基于图像的方法研究气孔谱系细胞中的膜运输事件

摘要

这里介绍了几种常用的方法来研究质膜受体激酶的膜运输事件。本手稿描述了详细的方案，包括植物材料制备、药物治疗和共聚焦成像设置。

摘要

在真核细胞中，膜成分（包括蛋白质和脂质）在时空上运输到内膜系统内的目的地。这包括新合成的蛋白质向细胞表面或细胞外部的分泌运输，细胞外货物或质膜成分进入细胞的内吞运输，以及货物在亚细胞器之间的循环或穿梭运输等。膜运输事件对于所有真核细胞的发育、生长和环境适应至关重要，因此受到严格的监管。细胞表面受体激酶感知来自细胞外空间的配体信号，经历分泌和内吞转运。本文介绍了使用质膜定位的富含亮氨酸重复受体激酶ERL1来研究膜运输事件的常用方法。这些方法包括植物材料制备、药物治疗和共聚焦成像设置。为了监测ERL1的时空调控，本研究描述了ERL1与多泡体标志蛋白RFP-Ara7之间的共定位分析，这两种蛋白质的时间序列分析，以及用膜运输抑制剂brefeldin A和wortmannin处理的ERL1-YFP的z-stack分析。

引言

膜运输是一种保守的细胞过程，它将膜成分（也称为货物），包括蛋白质、脂质和其他生物产物，在真核细胞内的不同细胞器之间或穿过质膜进出细胞^外空间1。该过程由称为内膜系统的膜和细胞器的集合促进，内膜系统由核膜、内质网、高尔基体、液泡/溶酶体、质膜和多个内体组成¹.内膜系统能够使用在这些细胞器之间穿梭的动态囊泡对膜组件进行修饰、包装和运输。膜运输事件对细胞发育、生长和环境适应至关重要，因此受到严格而^{复杂的监管2}。目前，分子生物学、化学生物学、显微镜和质谱的多种方法已被开发并应用于膜运输领域，并极大地促进了对内^膜系统时空调控的理解^3,4。分子生物学用于对参与膜运输的假定参与者进行经典的遗传操作，例如改变目标蛋白质的基因表达或用某些标签标记感兴趣的蛋白质。化学生物学中的工具包括使用专门干扰^{某些路线4,5}的交通的分子。质谱法对于鉴定通过生化方法机械分离的细胞器中的成分非常强大 ^3,4.然而，膜交通是一个动态、多样和复杂的生物过程

研究方案

1. 溶液的制备

1. 通过将 15 mL 漂白剂与 35 mL 蒸馏水和 50 μL Triton X-100 混合来制备种子灭菌溶液。
2. 通过将BFA粉末溶解在乙醇中至终浓度为10mM（储备液）来制备布雷菲尔丁A（BFA）溶液。通过将Wm粉末溶解在DMSO中至终浓度为10mM（储备液）来制备麦芽汁（Wm）溶液。

2. 播下种子

1. 将来自每个所需转基因植物的 10-50 颗种子等分到 1.5 mL 微量离心管中。向每个管中加入1mL种子灭菌溶液，并通过在摇床上轻轻倒置试管10分钟来彻底混合。
2. 弃去种子灭菌溶液，用1mL高压灭菌的蒸馏水洗涤种子五次。
3. 向每个试管中加入 300 μL 高压灭菌的蒸馏水，并将种子播种在含有 1% （w/v） 蔗糖和 0.75% （w/v） 琼脂的半强度 MS 培养基上。根据需要用相应的抗生素补充培养基。
4. 将板倒置在4°C下在黑暗中2天以同步发芽。
5. 2天后，将板转移到22°C下具有16小时光照/ 8小时黑暗循环（80μmol/ m² /^{s 1}）的生长室中。 这被认为是发芽后的第一天（1 dpg）。
6. 将幼苗移植到10 dpg的土壤中以进一步生长。

讨论

内膜系统将真核细胞的细胞质分离成不同的区室，从而使这些细胞器具有专门的生物学功能。为了在正确的时间将货物蛋白和大分子运送到它们的最终目的地，许多囊泡被引导到这些细胞器之间穿梭。高度调控的膜运输事件在细胞的活力、发育和生长中起着重要作用。调节这一关键而复杂的过程的机制仍然知之甚少。

这里已经描述了几种方法，用于观察膜蛋白的亚细胞定位?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringes	VWR	BD309695	Vacuum samples
Brefeldin A (BFA)	Sigma	B7651	membrane trafficking drug
Confocal Microscope	Leica	Lecia SP8 TCS with LAS-X software package	Imaging
Dissecting Forceps	VWR	82027-402	Genetic cross
Fiji	NIH	https://imagej.net/Fiji	Image processing
Leica LAS AF software	Leica	http://www.leica-microsystems.com	Image processing
transgenic seeds of ERL1-YFP			Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7			Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm)	Sigma	W1628	membrane trafficking drug