Métodos basados en imágenes para estudiar los eventos de tráfico de membrana en células de linaje estomática

Resumen

Aquí se introducen varios métodos de uso común para estudiar los eventos de tráfico de membrana de una quinasa receptora de membrana plasmática. Este manuscrito describe protocolos detallados que incluyen la preparación del material vegetal, el tratamiento farmacológico y la configuración de imágenes confocales.

Resumen

En las células eucariotas, los componentes de la membrana, incluidas las proteínas y los lípidos, se transportan espacio-temporalmente a su destino dentro del sistema de endomembranas. Esto incluye el transporte secretor de proteínas recién sintetizadas a la superficie celular o al exterior de la célula, el transporte endocítico de cargas extracelulares o componentes de la membrana plasmática dentro de la célula, y el transporte de reciclaje o transporte de cargas entre los orgánulos subcelulares, etc. Los eventos de tráfico de membrana son cruciales para el desarrollo, el crecimiento y la adaptación ambiental de todas las células eucariotas y, por lo tanto, están sujetos a una estricta regulación. Las quinasas receptoras de la superficie celular, que perciben las señales de ligandos del espacio extracelular, experimentan tanto el transporte secretor como el endocítico. Aquí se describen los enfoques comúnmente utilizados para estudiar los eventos de tráfico de membrana utilizando una quinasa receptora de repetición rica en leucina localizada en la membrana plasmática, ERL1. Los enfoques incluyen la preparación del material vegetal, el tratamiento farmacológico y la configuración de imágenes confocal. Para monitorizar la regulación espacio-temporal de ERL1, en este estudio se describe el análisis de colocalización entre ERL1 y una proteína marcador corporal multivesicular, RFP-Ara7, el análisis de series temporales de estas dos proteínas y el análisis de la pila z de ERL1-YFP tratada con los inhibidores del tráfico de membrana brefeldina A y wortmannina.

Introducción

El tráfico de membrana es un proceso celular conservado que distribuye los componentes de la membrana (también conocidos como cargas), incluidas proteínas, lípidos y otros productos biológicos, entre diferentes orgánulos dentro de una célula eucariota o a través de la membrana plasmática hacia y desde^{el espacio} extracelular. Este proceso es facilitado por una colección de membranas y orgánulos denominada sistema de endomembranas, que consiste en la membrana nuclear, el retículo endoplásmico, el aparato de Golgi, las vacuolas/lisosomas, la membrana plasmática y múltiples endosomas¹. El sistema de endomembranas permite la ....

Protocolo

1. Preparación de las soluciones

1. Prepare la solución de esterilización de semillas mezclando 15 ml de lejía con 35 ml de agua destilada y 50 μl de Triton X-100.
2. Preparar la solución de brefeldina A (BFA) disolviendo el polvo de BFA en etanol hasta una concentración final de 10 mM (stock). Prepare la solución de wortmannina (Wm) disolviendo el polvo de Wm en DMSO hasta una concentración final de 10 mM (stock).

2. Sembrando las semillas

1. Alícuota 10-50 semillas de cada una de las plantas transgénicas requeridas en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Agregue 1 ml de solución ....

Resultados

Un estudio previo indicó que ERL1 es un receptor quinasa activo que experimenta eventos dinámicos de tráfico de membrana²⁰. ERL1 es una quinasa transmembrana del receptor LRR en la membrana plasmática. La ERL1 recién sintetizada en el retículo endoplásmico se procesa en los cuerpos de Golgi y se transporta posteriormente a la membrana plasmática. Las moléculas ERL1 de la membrana plasmática pueden percibir ligandos EPF utilizando su dominio¹⁸ LRR extracelular. Tra.......

Discusión

El sistema de endomembranas separa el citoplasma de una célula eucariota en diferentes compartimentos, lo que permite la función biológica especializada de estos orgánulos. Para llevar las proteínas de carga y las macromoléculas a su destino final en el momento adecuado, se guían numerosas vesículas para que se transporten entre estos orgánulos. Los eventos de tráfico de membranas altamente regulados juegan un papel fundamental en la viabilidad, el desarrollo y el crecimiento de las células. El mecanismo que r.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringes	VWR	BD309695	Vacuum samples
Brefeldin A (BFA)	Sigma	B7651	membrane trafficking drug
Confocal Microscope	Leica	Lecia SP8 TCS with LAS-X software package	Imaging
Dissecting Forceps	VWR	82027-402	Genetic cross
Fiji	NIH	https://imagej.net/Fiji	Image processing
Leica LAS AF software	Leica	http://www.leica-microsystems.com	Image processing
transgenic seeds of ERL1-YFP			Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7			Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm)	Sigma	W1628	membrane trafficking drug