Stoma Soy Hücrelerinde Membran Kaçakçılığı Olaylarını İncelemek için Görüntü Tabanlı Yöntemler

Özet

Bir plazma membran reseptörü kinazının membran kaçakçılığı olaylarını incelemek için burada yaygın olarak kullanılan birkaç yöntem tanıtılmaktadır. Bu yazıda bitki materyali hazırlama, farmakolojik tedavi ve konfokal görüntüleme kurulumu dahil olmak üzere ayrıntılı protokoller açıklanmaktadır.

Özet

Ökaryotik hücrelerde, proteinler ve lipitler dahil olmak üzere zar bileşenleri, endomembran sistemi içindeki hedeflerine uzamsal olarak taşınır. Bu, yeni sentezlenen proteinlerin hücre yüzeyine veya hücrenin dışına salgı yoluyla taşınmasını, hücre dışı yüklerin veya plazma zarı bileşenlerinin hücre içine endositik taşınmasını ve yüklerin hücre altı organeller arasında geri dönüştürülmesini veya taşınmasını vb. içerir. Membran kaçakçılığı olayları, tüm ökaryotik hücrelerin gelişimi, büyümesi ve çevresel adaptasyonu için çok önemlidir ve bu nedenle sıkı düzenlemelere tabidir. Hücre dışı boşluktan ligand sinyallerini algılayan hücre yüzeyi reseptör kinazları hem salgı hem de endositik taşımaya uğrar. Plazma membranı lokalize lösin açısından zengin tekrar reseptör kinazı (ERL1) kullanarak membran kaçakçılığı olaylarını incelemek için yaygın olarak kullanılan yaklaşımlar burada açıklanmaktadır. Yaklaşımlar arasında bitki materyali hazırlama, farmakolojik tedavi ve konfokal görüntüleme kurulumu yer alır. ERL1'in uzay-zamansal regülasyonunu izlemek için bu çalışma, ERL1 ile bir multi-veziküler vücut belirteç proteini olan RFP-Ara7 arasındaki ko-lokalizasyon analizini, bu iki proteinin zaman serisi analizini ve membran kaçakçılığı inhibitörleri brefeldin A ve wortmannin ile tedavi edilen ERL1-YFP'nin z-yığın analizini açıklamaktadır.

Giriş

Membran trafiği, proteinler, lipitler ve diğer biyolojik ürünler dahil olmak üzere membran bileşenlerini (kargolar olarak da bilinir) ökaryotik bir hücre içindeki farklı organeller arasında veya plazma zarı boyunca hücre dışı boşluğa ve hücre dışı boşluğa^dağıtan korunmuş bir hücresel süreçtir 1. Bu süreç, nükleer zar, endoplazmik retikulum, Golgi aygıtı, vakuol/lizozomlar, plazma zarı ve çoklu endozomlardan oluşan endomembran sistemi adı verilen bir zar ve organeller topluluğu tarafından kolaylaştırılır¹. Endomembran sistemi, bu organeller arasında mekik dokuyan dinamik veziküller kullanarak membran bileşenlerinin değişt....

Protokol

1. Çözeltilerin hazırlanması

1. 15 mL ağartıcıyı 35 mL damıtılmış su ve 50 μL Triton X-100 ile karıştırarak tohum sterilizasyon solüsyonu hazırlayın.
2. BFA tozunu etanol içinde 10 mM'lik (stok) nihai konsantrasyona çözerek brefeldin A (BFA) çözeltisini hazırlayın. Wm tozunu DMSO içinde 10 mM'lik (stok) nihai konsantrasyona çözerek wortmannin (Wm) çözeltisini hazırlayın.

2. Tohumların ekilmesi

1. Gerekli transgenik bitkilerin her birinden 10-50 tohumu 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine alın. Her tüpe 1 mL tohum sterilizasyon solüsyonu ekleyin ve tüpü bir çalkalayıcı üzerinde 10 dakik....

Tartışmalar

Endomembran sistemi, ökaryotik bir hücrenin sitoplazmasını farklı bölmelere ayırır ve bu da bu organellerin özel biyolojik işlevini sağlar. Kargo proteinlerini ve makromolekülleri nihai varış yerlerine doğru zamanda ulaştırmak için, çok sayıda vezikül bu organeller arasında mekik dokumak üzere yönlendirilir. Yüksek düzeyde düzenlenmiş membran kaçakçılığı olayları, hücrelerin canlılığında, gelişmesinde ve büyümesinde temel roller oynar. Bu önemli ve karmaşık süreci düzenleye.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringes	VWR	BD309695	Vacuum samples
Brefeldin A (BFA)	Sigma	B7651	membrane trafficking drug
Confocal Microscope	Leica	Lecia SP8 TCS with LAS-X software package	Imaging
Dissecting Forceps	VWR	82027-402	Genetic cross
Fiji	NIH	https://imagej.net/Fiji	Image processing
Leica LAS AF software	Leica	http://www.leica-microsystems.com	Image processing
transgenic seeds of ERL1-YFP			Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7			Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm)	Sigma	W1628	membrane trafficking drug