Méthodes basées sur l’image pour étudier les événements de trafic membranaire dans les cellules de la lignée stomatique

Résumé

Plusieurs méthodes couramment utilisées sont présentées ici pour étudier les événements de trafic membranaire d’une kinase du récepteur de la membrane plasmique. Ce manuscrit décrit les protocoles détaillés, y compris la préparation du matériel végétal, le traitement pharmacologique et la configuration de l’imagerie confocale.

Résumé

Dans les cellules eucaryotes, les composants membranaires, y compris les protéines et les lipides, sont transportés spatio-temporellement vers leur destination dans le système endomembranaire. Cela comprend le transport sécrétoire de protéines nouvellement synthétisées à la surface cellulaire ou à l’extérieur de la cellule, le transport endocytaire de cargaisons extracellulaires ou de composants de membrane plasmique dans la cellule, et le recyclage ou le transport de navettes entre les organites subcellulaires, etc. Les événements de trafic membranaire sont cruciaux pour le développement, la croissance et l’adaptation environnementale de toutes les cellules eucaryotes et, par conséquent, sont soumis à une réglementation stricte. Les kinases réceptrices de surface cellulaire, qui perçoivent les signaux de ligand de l’espace extracellulaire, subissent à la fois un transport sécrétoire et endocytaire. Les approches couramment utilisées pour étudier les événements de trafic membranaire à l’aide d’une kinase à récepteurs riches en leucine et à répétition localisée par membrane plasmique, ERL1, sont décrites ici. Les approches comprennent la préparation du matériel végétal, le traitement pharmacologique et la configuration de l’imagerie confocale. Pour surveiller la régulation spatio-temporelle d’ERL1, cette étude décrit l’analyse de co-localisation entre ERL1 et une protéine marqueur corporel multi-vésiculaire, RFP-Ara7, l’analyse de séries chronologiques de ces deux protéines et l’analyse z-stack d’ERL1-YFP traitées avec les inhibiteurs du trafic membranaire brefeldin A et wortmannin.

Introduction

Le trafic membranaire est un processus cellulaire conservé qui distribue les composants membranaires (également appelés cargaisons), y compris les protéines, les lipides et d’autres produits biologiques, entre différents organites au sein d’une cellule eucaryote ou à travers la membrane plasmique vers et depuis l’espace extracellulaire¹. Ce processus est facilité par une collection de membranes et d’organites appelée système endomembranaire, qui comprend la membrane nucléaire, le réticulum endoplasmique, l’appareil de Golgi, les vaculoles/lysosomes, la membrane plasmique et de multiples endosomes¹. Le système endomembran....

Protocole

1. Préparation des solutions

1. Préparer la solution de stérilisation des semences en mélangeant 15 mL d’eau de Javel avec 35 mL d’eau distillée et 50 μL de Triton X-100.
2. Préparer la solution de brefeldine A (BFA) en dissolvant la poudre de BFA dans de l’éthanol jusqu’à une concentration finale de 10 mM (stock). Préparer la solution de wortmannin (Wm) en dissolvant la poudre de Wm dans du DMSO jusqu’à une concentration finale de 10 mM (stock).

2. Semer les graines

1. Aliquote 10-50 graines de chacune des plantes transgéniques requises dans des tubes microcentrifugés de 1,5 mL. ....

Discussion

Le système endomembranaire sépare le cytoplasme d’une cellule eucaryote en différents compartiments, ce qui permet la fonction biologique spécialisée de ces organites. Pour livrer les protéines et les macromolécules de cargaison à leur destination finale au bon moment, de nombreuses vésicules sont guidées pour faire la navette entre ces organites. Les événements de trafic membranaire hautement réglementés jouent un rôle fondamental dans la viabilité, le développement et la croissance des cellules. Le m.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringes	VWR	BD309695	Vacuum samples
Brefeldin A (BFA)	Sigma	B7651	membrane trafficking drug
Confocal Microscope	Leica	Lecia SP8 TCS with LAS-X software package	Imaging
Dissecting Forceps	VWR	82027-402	Genetic cross
Fiji	NIH	https://imagej.net/Fiji	Image processing
Leica LAS AF software	Leica	http://www.leica-microsystems.com	Image processing
transgenic seeds of ERL1-YFP			Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7			Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm)	Sigma	W1628	membrane trafficking drug