Méthodes basées sur l’image pour étudier les événements de trafic membranaire dans les cellules de la lignée stomatique

Résumé

Plusieurs méthodes couramment utilisées sont présentées ici pour étudier les événements de trafic membranaire d’une kinase du récepteur de la membrane plasmique. Ce manuscrit décrit les protocoles détaillés, y compris la préparation du matériel végétal, le traitement pharmacologique et la configuration de l’imagerie confocale.

Résumé

Dans les cellules eucaryotes, les composants membranaires, y compris les protéines et les lipides, sont transportés spatio-temporellement vers leur destination dans le système endomembranaire. Cela comprend le transport sécrétoire de protéines nouvellement synthétisées à la surface cellulaire ou à l’extérieur de la cellule, le transport endocytaire de cargaisons extracellulaires ou de composants de membrane plasmique dans la cellule, et le recyclage ou le transport de navettes entre les organites subcellulaires, etc. Les événements de trafic membranaire sont cruciaux pour le développement, la croissance et l’adaptation environnementale de toutes les cellules eucaryotes et, par conséquent, sont soumis à une réglementation stricte. Les kinases réceptrices de surface cellulaire, qui perçoivent les signaux de ligand de l’espace extracellulaire, subissent à la fois un transport sécrétoire et endocytaire. Les approches couramment utilisées pour étudier les événements de trafic membranaire à l’aide d’une kinase à récepteurs riches en leucine et à répétition localisée par membrane plasmique, ERL1, sont décrites ici. Les approches comprennent la préparation du matériel végétal, le traitement pharmacologique et la configuration de l’imagerie confocale. Pour surveiller la régulation spatio-temporelle d’ERL1, cette étude décrit l’analyse de co-localisation entre ERL1 et une protéine marqueur corporel multi-vésiculaire, RFP-Ara7, l’analyse de séries chronologiques de ces deux protéines et l’analyse z-stack d’ERL1-YFP traitées avec les inhibiteurs du trafic membranaire brefeldin A et wortmannin.

Introduction

Le trafic membranaire est un processus cellulaire conservé qui distribue les composants membranaires (également appelés cargaisons), y compris les protéines, les lipides et d’autres produits biologiques, entre différents organites au sein d’une cellule eucaryote ou à travers la membrane plasmique vers et depuis l’espace extracellulaire¹. Ce processus est facilité par une collection de membranes et d’organites appelée système endomembranaire, qui comprend la membrane nucléaire, le réticulum endoplasmique, l’appareil de Golgi, les vaculoles/lysosomes, la membrane plasmique et de multiples endosomes¹. Le système endomembranaire permet la modification, l’emballage et le transport des composants membranaires à l’aide de vésicules dynamiques qui font la navette entre ces organites. Les événements de trafic membranaire sont cruciaux pour le développement cellulaire, la croissance et l’adaptation environnementale et, par conséquent, sont soumis à une réglementation stricte et complexe². Actuellement, de multiples approches en biologie moléculaire, en biologie chimique, en microscopie et en spectrométrie de masse ont été développées et appliquées au domaine du trafic membranaire et ont grandement fait progresser la compréhension de la régulation spatio-temporelle du système endomembranaire ^3,4. La biologie moléculaire est utilisée pour les manipulations génétiques classiques des acteurs présumés impliqués dans le trafic membranaire, telles que la modification de l’expression génique de la protéine d’intérêt ou l’étiquetage de la protéine d’intérêt avec certaines étiquettes. Les outils en biologie chimique comprennent l’utilisation de molécules qui interfèrent spécifiquement avec le trafic de certaines routes ^4,5. La spectrométrie de masse est puissante pour identifier les composants d’un organite qui a été isolé mécaniquement par des approches biochimiques ^3,4. Cependant, le trafic membranaire est un processus biologique dynamique, diversifié et complexe¹. Pour visualiser le processus de trafic membranaire dans les cellules vivantes dans diverses conditions, la microscopie optique est un outil essentiel. Des progrès continus ont été réalisés dans les techniques de microscope avancées pour surmonter les défis liés à la mesure de l’efficacité, de la cinétique et de la diversité des événements⁴. Ici, cette étude se concentre sur les méthodologies largement adoptées en biologie chimique / pharmacologique, en biologie moléculaire et en microscopie pour étudier les événements de trafic membranaire dans un système naturellement simplifié et accessible expérimentalement, le processus de développement stomatique.

Les stomates sont des micropores sur les surfaces aériennes des plantes qui s’ouvrent et se ferment pour faciliter les échanges gazeux entre les cellules internes et l’environnement ^6,7,8. Par conséquent, les stomates sont essentiels à la photosynthèse et à la transpiration, deux événements cruciaux pour la survie et la croissance des plantes. Le développement stomatique est ajusté dynamiquement par des indices environnementaux afin d’optimiser l’adaptation de la plante à l’environnement⁹. Datant d’études de 2002, l’identification de la protéine réceptrice Too Many Mouths (TMM) a ouvert la porte à une nouvelle ère d’étude des mécanismes moléculaires du développement stomatique chez la plante modèle Arabidopsis thaliana¹⁰. Après seulement quelques décennies, une voie de signalisation classique a été identifiée. De l’amont vers l’aval, cette voie comprend un groupe de ligands peptidiques sécrétoires de la famille des facteurs de structuration épidermique (EFP), plusieurs kinases des récepteurs LRR (Leucine-Rich-Repeat) à la surface cellulaire de la famille EREECTA (ER), la protéine réceptrice LRR TMM, une cascade MAPK et plusieurs facteurs de transcription bHLH, notamment SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA et SCREAM (SCRM)^11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Des travaux antérieurs indiquent que l’un des récepteurs kinases, ER-LIKE 1 (ERL1), démontre des comportements subcellulaires actifs lors de la perception EPF²⁰. ERL2 circule également dynamiquement entre la membrane plasmique et certains organites intracellulaires²⁷. Le blocage des étapes de trafic membranaire provoque une structuration stomatique anormale, entraînant des grappes stomatiques à la surface des feuilles²⁸. Ces résultats suggèrent que le trafic membranaire joue un rôle essentiel dans le développement stomatique. Cette étude décrit un protocole pour étudier spatio-temporellement la dynamique ERL1 en utilisant une analyse de colocalisation sous-cellulaire protéine-protéine combinée à un traitement pharmacologique utilisant certains inhibiteurs du trafic membranaire.

Protocole

1. Préparation des solutions

1. Préparer la solution de stérilisation des semences en mélangeant 15 mL d’eau de Javel avec 35 mL d’eau distillée et 50 μL de Triton X-100.
2. Préparer la solution de brefeldine A (BFA) en dissolvant la poudre de BFA dans de l’éthanol jusqu’à une concentration finale de 10 mM (stock). Préparer la solution de wortmannin (Wm) en dissolvant la poudre de Wm dans du DMSO jusqu’à une concentration finale de 10 mM (stock).

2. Semer les graines

1. Aliquote 10-50 graines de chacune des plantes transgéniques requises dans des tubes microcentrifugés de 1,5 mL. Ajouter 1 mL de solution de stérilisation des graines dans chaque tube et bien mélanger en retournant doucement le tube pendant 10 minutes sur un agitateur.
2. Jeter la solution de stérilisation des graines et laver les graines avec 1 mL d’eau distillée autoclavée cinq fois.
3. Ajouter 300 μL d’eau distillée autoclavée dans chaque tube et semer les graines sur un milieu MS à demi-concentration contenant 1 % (p/v) de saccharose et 0,75 % (p/v) d’agar. Complétez le milieu avec les antibiotiques correspondants au besoin.
4. Gardez la plaque à l’envers à 4 °C dans l’obscurité pendant 2 jours pour synchroniser la germination.
5. Après 2 jours, transférer la plaque dans une salle de culture avec un cycle d’obscurité de 16 h lumière/8 h (80 μmol/m²/s¹) à 22 °C. Ceci est considéré comme le premier jour après la germination (1 dpg).
6. Transplantez les plantules dans le sol à 10 dpg pour une croissance ultérieure.

3. Préparation de plantes transgéniques F1 bicolores

1. Cultiver côte à côte des plantes transgéniques homozygotes portant ERL1-YFP (plante A) et des plantes transgéniques homozygotes portant une protéine marqueur marquée RFP-Ara7 (plante B)20 jusqu’à la floraison dans une salle de croissance avec un cycle d’obscurité de 16 h par la lumière et 8 h (⁸⁰ μmol/m²/s¹) à 22 °C.
2. Choisissez une jeune inflorescence de la plante A. Gardez une fleur qui est sur le point de s’ouvrir sur l’inflorescence pour les croisements génétiques. Enlevez toutes les fleurs et siliques plus anciennes. De plus, retirez soigneusement les fleurs plus jeunes et les méristèmes floraux pour éviter toute confusion future.
3. Disséquez délicatement la fleur non ouverte en enlevant les sépales, les pétales et les étamines à l’aide d’une pince à épiler pointue. Ne laissez que le pistil sur l’inflorescence.
4. Prenez une étamine mature d’une fleur ouverte sur la plante B et déposez les grains de pollen sur le stigmate du pistil disséqué sur la plante A.
5. Étiquetez cette fleur croisée manuellement en indiquant son père, sa mère et la date du croisement génétique. Laissez la fleur mûrir et récoltez les graines F1 lorsque la silique devient jaune/brune (~20 jours après la croix). Vérifiez si une usine F1 réussie possède à la fois des signaux YFP et RFP.

4. Traitement pharmacologique

1. Pour le traitement BFA, retirer les cotylédons des plantules âgées de 7 jours, immerger le reste des plantules dans une solution fictive (éthanol à 0,3 %) ou une solution BFA à 30 μM, appliquer le vide pendant 1 min et maintenir l’échantillon immergé pendant 30 minutes avant l’imagerie.
2. Pour le traitement du wortmannin, retirez les cotylédons des plantules âgées de 7 jours, immergez le reste des plantules dans une solution de DMSO à 0,25% ou dans du wortmannin à 25 mM, appliquez le vide pendant 1 min et maintenez l’échantillon immergé pendant 30 minutes avant l’imagerie.
3. Pour le traitement sous vide des échantillons, dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL, ajouter 500 μL de la solution médicamenteuse correspondante et immerger les plantules disséquées dans la solution. Fixez hermétiquement une seringue de 10 mL au tube de microcentrifugation et appliquez le vide pendant 1 min (Figure 1). Retirez la seringue et conservez l’échantillon dans la solution pendant le temps requis. Retirez délicatement les plantules pour la préparation de l’imagerie.

Figure 1 : Dispositif à vide simple. Une seringue de 10 mL est fixée à un tube microcentrifuge de 1,5 mL pour le traitement sous vide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Préparation des échantillons pour l’imagerie

1. Disséquer la vraie feuille de l’échantillon traité à l’aide d’une lame de rasoir tranchante. Mettez doucement la vraie feuille dans une goutte d’eau sur une lame de verre et maintenez le côté abaxial vers le haut. Couvrez lentement la vraie feuille avec une lamelle de couverture tout en évitant de piéger les bulles.

6. Imagerie confocale

REMARQUE: Un microscope confocal à balayage inversé Leica SP8 a été utilisé pour imager le signal de fluorescence des échantillons dans ce travail.

1. Configuration du trajet du faisceau
   1. Sélectionnez un laser 514 nm pour l’excitation YFP. Utilisez une puissance laser élevée pour augmenter l’intensité du signal et, ainsi, obtenir une qualité d’image élevée. Cependant, les puissances laser supérieures à 5% courent le risque de photoblanchiment, et la santé de l’échantillon peut être affectée. Si le signal de l’échantillon n’est pas trop faible, commencez à faible intensité laser.
   2. Activez PMT/HyD pour la détection et définissez les seuils de bande d’émission supérieurs et inférieurs en fonction du spectre du fluorophore YFP. Définissez une fenêtre de détection de 530 à 570 nm pour collecter le signal YFP.
   3. Imagerie séquentielle pour la deuxième couleur : Cliquez sur le bouton Seq et ajoutez un nouveau canal. Par défaut, le trajet de faisceau YFP précédemment conçu sera Seq 1. Dans Seq 2, sélectionnez un laser 561 nm pour l’excitation RFP et définissez une fenêtre de détection de 570-630 nm pour collecter le signal RFP.
2. Configuration des conditions d’analyse (Figure 2)
   1. Pour imager l’activité du trafic de la membrane subcellulaire dans les cellules précurseurs stomatiques, choisissez une lentille Corr 63x/1,2 W sur le système pour l’imagerie.
   2. Le format fait référence à la taille de l’image en pixels. Commencez avec 1 024 pixels x 1 024 pixels, puis optimisez-le en fonction du facteur de zoom et des paramètres objectifs pour une bonne résolution de la qualité de la publication.
   3. La vitesse fait référence à la vitesse de la tête de balayage lorsque le laser passe sur chaque pixel. Bien que les vitesses de balayage lentes entraînent souvent un meilleur rapport signal/bruit, elles peuvent ne pas capturer efficacement les événements de trafic de membrane qui changent rapidement. Commencez avec une vitesse de 400 Hz et optimisez-la en fonction de la situation spécifique des échantillons.
   4. Le facteur zoom est utilisé pour zoomer sur une région d’intérêt sans changer l’objectif de l’objectif. Commencez avec un facteur de zoom de 1 et optimisez-le en fonction des besoins spécifiques de l’expérience.
   5. La moyenne des lignes fait référence au nombre de fois que chaque ligne X sera balayée pour obtenir un résultat moyen. Une moyenne de ligne plus élevée réduit le bruit dans l’image résultante, mais elle augmente également le temps de numérisation et le temps d’exposition à la lumière laser. Pour imager les événements de trafic de membrane, n’utilisez pas une moyenne de ligne élevée. Commencez avec une moyenne de lignes 2x et optimisez au besoin.
3. Collecte d’une série chronologique
   REMARQUE: Lors de l’étude des événements de trafic membranaire, une série chronologique est souvent nécessaire pour enregistrer le mouvement rapide des endosomes subcellulaires.
   1. En mode d’acquisition, sélectionnez le mode d’analyse xyt pour activer l’utilitaire de séries chronologiques.
   2. Décidez d’une période d’attente entre les points de temps sous Intervalle de temps. Vous pouvez également cliquer sur Réduire pour prendre les images immédiatement l’une après l’autre. Un intervalle de temps de 7 s a été utilisé dans l’expérience de série chronologique suivante.
   3. Sélectionnez Durée, puis entrez la durée totale d’exécution de l’expérience. Vous pouvez également définir le nombre d’images à collecter en sélectionnant Images (Figure 3).
4. Pour collecter les informations tridimensionnelles concernant l’événement de trafic de membrane dans l’ensemble de la cellule, utilisez le mode de balayage Z-stack. La projection d’intensité maximale des images Z-stack est souvent utilisée pour l’analyse.
   1. Sélectionnez le mode d’analyse xyz dans le mode d’acquisition, puis l’utilitaire Z-Stack deviendra accessible.
   2. Sélectionnez l’option Z-wide . Sous le mode de numérisation, définissez l’image supérieure et l’image inférieure de la pile Z à l’aide des boutons Début et Fin .
   3. Définissez l’épaisseur de l’étape z en cliquant sur taille de l’étape z. Vous pouvez également définir le nombre d’images à prendre afin de couvrir toute la gamme de la pile Z. Pour assurer la cohérence entre les échantillons, définissez la taille de l’étape z (Figure 4).
5. Traitement d'images
   1. La projection d’intensité maximale des images z-stack est générée par le logiciel confocale (http://www.leica-microsystems.com). Dans l’onglet Processus principal, choisissez d’abord le fichier z-stack intéressé sous l’onglet Projets ouverts à l’extrême gauche. Ensuite, passez à l’onglet central nommé Outils de processus, sélectionnez la fonction Projection , choisissez Maximum dans le panneau déroulant de Méthode, puis cliquez sur le bouton Appliquer . Une image de projection z-stack sera générée sous l’onglet Projets ouverts.
   2. La vidéo des images de la série chronologique est générée par Fidji (https://imagej.net/Fiji). Dans l’onglet Fichier , utilisez la fonction Ouvrir pour ouvrir toutes les images de séries chronologiques dans le bon ordre. Dans l’onglet Image , recherchez la fonction Pile et choisissez Images à empiler pour générer une vidéo. Enregistrez le fichier au format .avi avec la fréquence d’images souhaitée (5 images/s pour la vidéo 1).

Figure 2 : panneau du mode de balayage de la dimension XY. Le panneau Mode de numérisation permet de configurer les conditions de numérisation de l’image. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : utilitaire de série chronologique en mode d’analyse xyt. L’utilitaire de série chronologique est utilisé pour configurer les conditions d’imagerie afin de collecter consécutivement une série d’images. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : L’utilitaire z-stack en mode d’analyse xyz. L’utilitaire z-stack est utilisé pour configurer les conditions d’imagerie afin de collecter une série d’images sur l’axe z. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Résultats

Une étude antérieure a indiqué qu’ERL1 est une kinase réceptrice active qui subit des événements de trafic membranaire dynamique²⁰. ERL1 est une kinase transmembranaire du récepteur LRR sur la membrane plasmique. ERL1 nouvellement synthétisé dans le réticulum endoplasmique est traité dans les corps de Golgi et ensuite transporté vers la membrane plasmique. Les molécules ERL1 sur la membrane plasmique peuvent percevoir les ligands EPF en utilisant leur domaine LRR^ex...

Discussion

Le système endomembranaire sépare le cytoplasme d’une cellule eucaryote en différents compartiments, ce qui permet la fonction biologique spécialisée de ces organites. Pour livrer les protéines et les macromolécules de cargaison à leur destination finale au bon moment, de nombreuses vésicules sont guidées pour faire la navette entre ces organites. Les événements de trafic membranaire hautement réglementés jouent un rôle fondamental dans la viabilité, le développement et la croissance des cellules. Le m...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringes	VWR	BD309695	Vacuum samples
Brefeldin A (BFA)	Sigma	B7651	membrane trafficking drug
Confocal Microscope	Leica	Lecia SP8 TCS with LAS-X software package	Imaging
Dissecting Forceps	VWR	82027-402	Genetic cross
Fiji	NIH	https://imagej.net/Fiji	Image processing
Leica LAS AF software	Leica	http://www.leica-microsystems.com	Image processing
transgenic seeds of ERL1-YFP			Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7			Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm)	Sigma	W1628	membrane trafficking drug