気孔系譜細胞における膜輸送事象を研究するための画像ベースの手法

要約

ここでは、原形質膜受容体キナーゼの膜輸送イベントを研究するために、一般的に使用されるいくつかの方法を紹介します。この原稿では、植物材料の調製、薬理学的処理、共焦点イメージングのセットアップなど、詳細なプロトコルについて説明しています。

要約

真核細胞では、タンパク質や脂質などの膜成分が膜内システム内の目的地に時空間的に輸送されます。これには、新たに合成されたタンパク質の細胞表面または細胞外への分泌輸送、細胞外または原形質膜成分の細胞内細胞輸送、および細胞内オルガネラ間の貨物のリサイクルまたは往復輸送などが含まれます。膜輸送イベントは、すべての真核細胞の発生、成長、および環境適応にとって重要であるため、厳しい規制下にあります。細胞外空間からのリガンドシグナルを知覚する細胞表面受容体キナーゼは、分泌輸送とエンドサイトーシス輸送の両方を受けます。ここでは、原形質膜に局在するロイシンリッチリピート受容体キナーゼERL1を使用して膜輸送イベントを研究するために一般的に使用されるアプローチについて説明します。アプローチには、植物材料の調製、薬理学的処理、および共焦点イメージングのセットアップが含まれます。ERL1の時空間制御を監視するために、本研究では、ERL1と多胞体マーカータンパク質RFP-Ara7との共局在解析、これら2つのタンパク質の時系列解析、および膜輸送阻害剤であるブレフェルジンAとワートマニンで処理したERL1-YFPのzスタック解析について説明します。

概要

膜輸送は、タンパク質、脂質、その他の生物学的産物を含む膜成分(貨物とも呼ばれる)を、真核細胞内の異なる細胞小器官間または原形質膜を横切って細胞外空間との間で分配する保存された細胞プロセスです¹。このプロセスは、核膜、小胞体、ゴルジ体、液胞/リソソーム、原形質膜、および複数のエンドソームで構成される膜内システムと呼ばれる膜と細胞小器官の集まりによって促進^{されます1。}膜内システムは、これらの細胞小器官間を往復する動的小胞を使用して、膜成分の修飾、パッケージング、および輸送を可能にします。膜輸送イベントは、細胞の発生、成長、および環境適応に不可欠であるため、厳格で複雑な規制下にあります²。現在、分子生物学、ケミカルバイオロジー、顕微鏡、質量分析における複数のアプローチが開発され、膜輸送の分野に適用されており、膜内システムの時空間調節の理解を大幅に進めています^3,4。分子生物学は、目的のタンパク質の遺伝子発現を変更したり、目的のタンパク質を特定のタグで標識したりするなど、膜輸送に関与する推定プレーヤーの古典的な遺伝子操作に使用されます。ケミカルバイオロジーのツールには、特定のルート^4,5

プロトコル

1.溶液の調製

1. 15 mLの漂白剤を35 mLの蒸留水および50 μLのTriton X-100と混合して、種子滅菌溶液を調製します。
2. BFA粉末をエタノールに溶解して最終濃度10 mM(ストック)にしてブレフェルジンA(BFA)溶液を調製します。Wm粉末をDMSOに溶解してワートマニン(Wm)溶液を最終濃度10mM(ストック)に調製する。

2.種をまく

1. 必要なトランスジェニック植物のそれぞれから10〜50個の種子を1.5 mLのマイクロ遠心チューブに分注します。各チューブに1 mLの種子殺菌液を加え、シェーカーで10分間チューブを静かに反転させて完全に混合します。
2. 種子殺菌液を捨て、1 mLのオートクレーブ滅菌蒸留水で種子を5回洗浄します。
3. 各チューブに300 μLのオートクレーブ滅菌蒸留水を加え、1%(w / v)スクロースと0.75%(w / v)寒天を含む半強度MS培地に種子を播種します。必要に応じて、対応する抗生物質を培地に補給します。
4. プレートを逆さまにして4°Cの暗所で2日間保持し、発芽を同期させます。
5. 2日後、プレートを22°Cで16時間の明暗サイクル(80 μmol/m²/s¹)で成長室に移します。....

ディスカッション

膜内システムは、真核細胞の細胞質を異なる区画に分離し、これらの細胞小器官の特殊な生物学的機能を可能にします。貨物タンパク質と高分子を適切なタイミングで最終目的地に送達するために、多数の小胞がこれらの細胞小器官間を往復するように誘導されます。高度に制御された膜輸送イベントは、細胞の生存率、発生、および成長において基本的な役割を果たします。この重要で複?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringes	VWR	BD309695	Vacuum samples
Brefeldin A (BFA)	Sigma	B7651	membrane trafficking drug
Confocal Microscope	Leica	Lecia SP8 TCS with LAS-X software package	Imaging
Dissecting Forceps	VWR	82027-402	Genetic cross
Fiji	NIH	https://imagej.net/Fiji	Image processing
Leica LAS AF software	Leica	http://www.leica-microsystems.com	Image processing
transgenic seeds of ERL1-YFP			Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7			Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm)	Sigma	W1628	membrane trafficking drug