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摘要

在这里，我们介绍了一种方案，该方案证明了花焯解毒汤 （HZJD） 使用线粒体自噬调节缓解胃癌癌前病变的治疗效果。

摘要

本研究旨在探讨花焯解毒汤 （HZJD） 在 体内 和 体外缓解胃癌 （PLGC） 癌前病变的疗效和潜在机制。HZJD 是一种传统的中草药配方，由 11 种草药组成。将 Sprague-Dawley （SD） 大鼠随机分为 4 个亚组：对照组、模型组、阳性药物组和 HZJD 组。HZJD 治疗 10 周后进行苏木精-伊红 （H&E） 染色、高铁二胺-阿尔新蓝 （HID-AB） 染色、阿尔新蓝-高碘酸希夫 （AB-PAS） 染色、免疫组化、免疫荧光、RT-qPCR 和蛋白质印迹法。 在体外，使用细胞计数试剂盒-8 （CCK-8） 和 5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶 （EdU） 测定法检测细胞增殖。进行 RT-qPCR 和 Western blot 检测以评估线粒体自噬水平。结果表明，HZJD 可以延缓 PLGC 大鼠的病理进展并减少 PLGC 细胞增殖。HZJD 处理显著提高了 Sirt3 、 Foxo3a 、 Parkin 和 LC3 II/I 的 mRNA 和蛋白表达水平，同时降低了 p62 和 Tomm20 的 mRNA 和蛋白表达水平。发现 HZJD 具有在 体内 和 体外逆转线粒体自噬活性下降的能力。总之，该研究评估了 HZJD 的影响，并提供了有关其潜在分子机制的证据。

引言

胃癌 （GC） 仍然是全球影响消化系统最常见的恶性疾病之一。据估计，GC 约占全球所有癌症的 6%，在最常诊断的癌症中排名第 5，在癌症相关死亡中排名第 31。GC 被广泛认为是一种渐进的、多步骤的生物过程。在 GC 发作之前，胃粘膜通常会经历数年的癌前病变，称为胃癌 （PLGC） 分期的癌前病变。Correa 级联理论被广泛接受，并解释了从正常粘膜到慢性非萎缩性胃炎、萎缩性胃炎、肠上皮生 （IM）、异型增生 （Dys） 并最终形成癌2 的连续进展。PLGC 是 GC 发展的关键阶段，及时干预和监测 PLGC 对于早期预防 GC 至关重要。

最近的临床评估和实验研究证实，中医 （TCM） 正在成为治疗 PLGC 最有效的疗法之一 3,4。HZJD 煎剂是根据临床经验开发的中医方剂，植根于中医祛热祛湿理论。既往研究表明 HZJD 煎药治疗 PLGC 的有益作用，特别是在缓解临床症状和病理表现方面 5,6。通过网络药理学相关研究，我们确定了 HZJD 煎剂的活性成分及其对 PLGC7 的潜在靶点。先前研究的结果表明，HZJD 煎剂具有增强 PLGC 大鼠多样性、优化群落结构和增加肠道菌群相对丰度的能力8。此外，证实 HZJD 煎剂可以通过调节肠道菌群及其代谢物来改善 PLGC9。在最近的研究中，我们证明了 HZJD 煎剂可以通过下调 lnc 51736810 的表达来调节 PLGC 细胞增殖和凋亡的动态平衡。

越来越多的研究证实，线粒体自噬在各种癌症中起着重要作用。线粒体自噬选择性地消除受损和去极化的线粒体，并进一步防止细胞毒性活性氧 （ROS） 从功能失调的线粒体中过度积累，进而抑制肿瘤发生11。线粒体自噬是受损或功能失调的线粒体的选择性降解，与线粒体氧化磷酸化 （OXPHOS） 有着错综复杂的联系。线粒体自噬的受损或缺失会导致细胞能量代谢转向有氧糖酵解，这种现象通常被称为 Warburg 效应。Warburg 效应导致乳酸和酮体的产生增加，有助于构建有利于细胞增殖的肿瘤微环境12。

本研究提出了一种利用 HZJD 煎剂作为缓解 PLGC 进展的治疗方法的综合方案。通过我们的评估，我们观察到 HZJD 煎剂具有显着的积极作用，尤其是在其调节线粒体自噬的能力方面。该研究为 HZJD 煎药治疗 PLGC 的潜在分子机制提供了有价值的见解。

研究方案

所有实验程序和动物护理均经河北中医药大学机构动物护理与使用委员会指南（批准文号：DWLL2019031）批准，并按照伦理指南进行。在恒温 （24 °C ± 4 °C） 和湿度 （50%-60%） 下，在受控的暗/光循环 12 小时下，共培养 90 只无特异性病原体的雄性 Sprague-Dawley （SD） 大鼠 （年龄 = 6 周;体重 = 150-180 g;参见 材料表）。大鼠在开始实验前适应新环境 1 周。

1. 动物实验的准备

  1. PLGC 大鼠模型
    1. 将大鼠随机分配到对照组 （n=20） 和 PLGC 模型组 （n=70）。为对照组的大鼠提供标准的啮齿动物颗粒饮食和 随意饮水。用不规律的饮食 （禁食 1 天，喂养 1 天） 喂养 PLGC 模型组中的大鼠。
    2. 将大鼠以 5 只为一组，每个笼子饲养。为对照组提供每个笼子 150 克/天的饲料。让 PLGC 模型组自由进食 23 小时（150 克/天/每个笼）。23 小时后，去除剩余的饲料。
    3. 为 PLGC 模型组中的大鼠提供 1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍 （MNNG） 溶液 （200 μg/mL） 免费饮用10,13。为 PLGC 模型组中的大鼠提供每个笼 200 mL 的 MNNG 溶液。将 MNNG 溶液放入不透明的饮瓶中，每天更换。
    4. 禁食 24 小时后（每 2 天灌胃一次），用 2% 水杨酸钠灌胃 PLGC 模型组中的大鼠。对于管饲法，使用硅胶针头（参见 材料表），针头的最小深度等于 6 厘米。在早上 8：30 AM 至 9：30 AM 之间的同一时间持续进行管饲。
    5. 从 PLGC 模型组中随机选择 2 只大鼠在第 12 周、第 16 周、第 20 周和第 24 周进行病理检查，以评估 PLGC 模型的建立。当两只大鼠都通过病理评估诊断为 PLGC 时，认为模型成功，如9 中所述。
      1. 这个建模过程持续大约 24 周。允许由两名高级病理学家独立进行病理评估。通过两名病理学家的协作评估确定大鼠 PLGC 的病理诊断。考虑他们的诊断意见，并在评估过程中使用以前的指南作为参考 14,15,16,17。
  2. HZJD 汤剂的制备
    1. 根据7 中描述的方法制备 HZJD 汤剂。
      注：HZJD 汤中的草药由河北省中医院购买和鉴定。
  3. 分组和药物干预
    1. 将 PLGC 模型组随机分为三个亚组：模型组 （n=20）、阳性药物组 （n=20） 和华碌解度煎剂组 （HZJD， n=20， 表 1）。
    2. 通过灌胃18 用 0.7 mg/kg/天的维生素 B12 灌胃阳性药物组大鼠。用 14.81 g/kg/第8 天的 HZJD 汤剂治疗 HZJD 组的大鼠。用蒸馏水 （10 mL/kg） 给予对照组和模型组的大鼠。所有四组均接受每天一次的灌胃给药，持续 10 周。
      注意：HZJD 汤剂的人类每日推荐剂量为 142 克/天10。使用体表面积计算方法，确定大鼠的推荐剂量是人类的 6.25 倍。因此，大鼠 HZJD 汤剂的日剂量为 14.81 g/kg。根据大鼠的体重每周调整剂量。最大管饲法体积不超过 3 mL。
  4. 样本采集
    1. 在第 35 周禁食 24 小时后（可自由饮水）处死所有大鼠。用异氟醚麻醉所有大鼠 （5% 诱导，2% 维持，1L / min流速）。
    2. 在确认疼痛刺激丧失后，剃掉腹部并用乙醇和碘对皮肤进行消毒。用手术刀沿腹部中线从剑突软骨上切下腹部皮肤。
    3. 用镊子和手术刀钝分离皮下组织，直到露出胃。用剪刀沿大曲率解剖胃，并立即用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗。
    4. 在冰板上展开胃组织。从胃窦、胃体和角区的较小曲率收集胃样本 （2 mm x 2 mm）。如果胃上有任何可见的病变，请收集这些特定部分并将其作为标本进行处理。
    5. 将胃样品在 4% 多聚甲醛中固定 24 小时。将剩余的胃组织放入冷冻管中。将它们在液氮中冷冻，然后储存在 -80 °C。
    6. 通过吸入二氧化碳对大鼠实施安乐死。将大鼠尸体放入密封袋中，然后将袋子放入动物尸体储存柜中。

2. 病理检查

  1. 用剪刀修剪并抚平固定的胃组织。用梯度醇系列脱水组织，即 75% 乙醇 30 分钟，85% 乙醇 30 分钟，95% 乙醇 30 分钟，以及 2x 无水乙醇 30 分钟。将组织浸入二甲苯/乙醇溶液 （1：1） 中 1 小时，并在 100% 二甲苯中浸泡 2 次，每次 30 分钟。
  2. 将一半的熔融蜡倒入模具中，然后将透化的组织快速放入模具中。将纸巾放入另一半熔融蜡中。在嵌入的盒子上做标记，让蜡完全凝固。
  3. 使用切片机切成厚度为 4 μm 的切片。将切片放在幻灯片上。
  4. 将切片放入 100% 二甲苯中 2 次，每次 10 分钟，然后在二甲苯/乙醇溶液 （1：1） 中放置 10 分钟，在无水乙醇中再次放置 2 次 5 分钟，然后在 95% 乙醇中放置 5 分钟，然后在 85% 乙醇中放置 5 分钟，最后在 70% 乙醇中放置 5 分钟。用流水冲洗切片。
  5. 用苏木精对切片染色 5 分钟。通过在 0.5% 盐酸 - 乙醇中浸泡 10 秒来区分。用伊红染色切片 2 分钟。
  6. 用蒸馏水冲洗切片。用梯度醇系列脱水切片，即 70% 乙醇 30 秒，80% 乙醇 30 秒，95% 乙醇 30 秒，无水乙醇 30 秒。用 2x 的 100% 二甲苯透化切片。用中性香脂密封切片。
  7. 以 50：3 的比例混合 HID 溶液 A 和 HID 溶液 B，以制备 HID 工作溶液。用 HID 工作溶液对切片染色 24 小时。
  8. 用流水冲洗，然后用 alcian 染色切片 20 分钟。用核固红溶液对切片复染 10 分钟。按照步骤 2.6 中的说明脱水并密封切片。
  9. 用 alcian 染色切片 20 分钟。将切片在 1% 高碘酸水溶液中孵育 5 分钟。用 Schiff 染色切片 20 分钟。
  10. 将载玻片与苏木精孵育 2 分钟以对细胞核进行染色。加入酸性分化溶液（随 HID 试剂盒提供）5 秒。将 Scott blue 溶液涂抹 3 分钟，将载玻片染成蓝色。如上文步骤 2.6 中所述，将切片脱水并密封。
    注意：染色过程应避光。使用 1% 高碘酸水溶液时，温度应保持在 22 °C 以下。切片应按照步骤 2.6 中的说明脱水并密封。
  11. 在光学显微镜下以 10 倍和 20 倍的放大倍率检查染色切片。

3. 免疫组化

  1. 使用步骤 2.4 中获取的切片。将切片放入 0.01 M 柠檬酸钠缓冲液中并加热 10 分钟以进行抗原修复。
  2. 加入 3% 过氧化氢 30 分钟以淬灭内源性过氧化物酶和生物素。用山羊血清封闭切片 30 分钟。
  3. 将切片与稀释的针对sirt3（1：200），foxo3a（1：100）和parkin（1：200）的一抗在4°C下孵育过夜。 用 PBS 代替阴性对照的一抗。
  4. 用 PBS 冲洗切片 3 次，每次冲洗 5 分钟。将切片与相应的二抗在室温下孵育 1 小时。
  5. 加入 20 μL 3,3'-二氨基联苯胺 （DAB），持续 3 分钟。如上文步骤 2.6 中所述，将切片脱水并密封。
  6. 在光学显微镜下以 40 倍放大倍率对所有切片进行成像。使用 Image-Pro Plus 6.0 软件进行定量图像分析。

4. 免疫荧光

  1. 使用步骤 3.1 中获得的切片。重复步骤 3.3。
  2. 将切片与稀释的针对 COX IV （1：500） 和 LC3 （1：500） 的一抗在 4 °C 下孵育过夜。 用 PBS 冲洗切片 3 次，每次冲洗 5 分钟。
  3. 将切片与山羊抗兔 IgG （1：1000） 和山羊抗小鼠 IgG （1：1000） 在室温下孵育 1.5 小时。用 PBS 冲洗切片 3 次，每次冲洗 5 分钟。
  4. 加入 DAPI 染色溶液，并在室温下避光孵育 10 分钟。用 PBS 冲洗切片 3 次，每次冲洗 5 分钟。
  5. 加入滴加 DAPI 染色溶液，并在室温下避光孵育 10 分钟。用抗褪色荧光封固剂封片。
  6. 在荧光显微镜下以 40 倍放大倍率观察和拍摄切片（参见 材料表）。

5. 蛋白质印迹分析

  1. 精确称取 100 毫克胃组织。加入 1 mL 的 RIPA 缓冲溶液（参见 材料表）。使用匀浆器（10,000 x g ， 每次 15 秒，3 次）彻底研磨组织。
  2. 将组织匀浆置于冰上 30 分钟。在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 20 分钟，然后收集上清液。
  3. 使用二辛可宁酸 （BCA） 蛋白质浓度测定试剂盒定量蛋白质浓度（参见 材料表）。调整所得上清液的蛋白质浓度，使其在样品内保持一致。
  4. 制备由 10% 分离凝胶和 5% 浓缩凝胶组成的 SDS-PAGE 凝胶。将 10% 分离凝胶倒入玻璃板中至总高度的 2/3。在凝胶上加入去离子水，直到凝胶凝固。倒入 5% 浓缩胶以填充玻璃板。插入电泳梳。
    注意：应注意确保凝胶中没有气泡。
  5. 将蛋白质上清液与 5x 上样缓冲液以 1：4 的比例混合。放入沸水中 5 分钟使其变性。将其储存在 -20 °C。
  6. 将制备好的 SDS-PAGE 凝胶组装在 Western 印迹电泳系统中。加入新鲜的电泳溶液（参见 材料表）。每孔将 20 μL 样品上样到凝胶上。在 80 V 下开始电泳 40 分钟，然后切换到 120 V。
  7. 收集凝胶并按如下方式制备转移三明治：两层海绵垫、两层滤纸、凝胶、聚偏二氟乙烯 （PVDF） 膜（参见 材料表）、两层滤纸、两层海绵垫（从负极到正极）。添加预冷的转移缓冲液。在 350 mA 下进行湿转移 2 小时。
    注意：在组装转移三明治之前，PVDF 膜应用甲醇进行预处理。此外，应提前将海绵、滤纸和预处理的 PVDF 膜浸入转印缓冲液中（参见 材料表）。
  8. 在摇床上用含吐温 20 （TBST） 的 tris 缓冲盐水中的 5% 脱脂牛奶封闭膜 2 小时。将膜在4°C与以下稀释的一抗（Sirt3 = 1：500，Foxo3a = 1：1000，Parkin = 1：2000，P62 = 1：1000，LC3 = 1：1000，Tomm20 = 1：2000，β-肌动蛋白= 1：5000，GAPDH = 1：5000）孵育过夜。
    注：由于 Parkin 的分子量 （50 kDa） 接近 β-肌动蛋白 （42 kDa），因此选择 GAPDH 作为检测 Parkin 的参考。
  9. 每次用 TBST 洗涤膜 4 次，每次 5 分钟。将其与稀释的二抗 （1：5000） 在室温下孵育 1 小时。
  10. 将 ECL 工作溶液滴在膜的蛋白质侧 2 分钟。通过化学发光成像系统获取图像。使用 ImageJ 软件测量灰度值。

6. 定量实时 PCR 分析

  1. 用 0.1% 焦碳酸二乙酯 （DEPC） 清洁所有实验装置，然后提前在高温高压下消毒。
  2. 称取 50 毫克胃组织。加入 1 mL Redzol（参见 材料表）并在均质器中研磨。将组织匀浆转移到不含 RNase 的离心管中，并在室温下静置 10 分钟。
  3. 加入 0.2 mL 三氯甲烷并充分混合。让它在室温下静置 3 分钟。在 4 °C 和 12,000 x g 下离心 15 分钟。
  4. 小心去除上层水相，并将其与 0.5 mL 异丙醇混合 10 分钟。在 4 °C 下离心 12,000 x g 10 分钟以沉淀 RNA。弃去上清液，然后用 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀物 3 次。
  5. 在 4 °C 下以 7,500 x g 离心 5 分钟。 弃去上清液，然后在无菌工作台中干燥 RNA 沉淀物 10 分钟。将沉淀物溶解在 50 μL DEPC 中。
  6. 将 1 μg RNA 逆转录成 cDNA。加入 1 μL 20x RTase 混合物、4 μL 5x RT 反应缓冲液（参见 材料表）并将 DEPC 补充至总体积为 20 μL。设置反应程序如下：在 25 °C 下 10 分钟，在 42 °C 下 40 分钟，在 85 °C 下 10 分钟，然后在 4 °C 下保持。
  7. 制备含有 2 μL cDNA、2 μL 正向引物、2 μL 反向引物（表 2）、10 μL 2x SYBR 预混料（参见 材料表）和 4 μL DEPC 的扩增反应混合物。设置反应程序如下：95 °C 15 秒，60 °C 10 秒，72 °C 30 秒（40 个循环）。
  8. 使用 β-肌动蛋白作为内源性参考。获取 Ct 值。使用 2-ΔΔCt 方法计算靶基因的相对表达。

7. 细胞实验的准备

  1. PLGC 细胞模型
    1. 在 Roswell Park Memorial Institute （RPMI） 1640 培养基中培养 GES-1 细胞，该培养基结合了 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素-链霉素。在 37 °C、5% CO2 下，在含有 1.5 mL 不含血清和抗生素的 RPMI 1640 培养基的 6 孔板中以每孔 2 x 105 个细胞的比例培养细胞。
    2. 用 MNNG 诱导 GES-1 细胞进行恶性转化。如下所述设置建模排列。
      1. 在第 0 天，预复苏并传代 GES-1 细胞以将其维持在对数生长期。将对数期 GES-1 细胞接种在培养瓶中并培养过夜。
      2. 在第 1 天和第 2 天，更换含 MNNG （10 μM/L） 的培养基。第 3 天，用无药物培养基替换含 MNNG 的培养基。
      3. 在第 4 天和第 6 天，用含 MNNG （5 μM/L） 的培养基处理细胞 24 小时。第 7 天，用无药物培养基替换含 MNNG 的培养基。去除大量垂死和脱落的细胞，继续细胞培养。
      4. 在第 8 天和第 10 天，用含有 MNNG （5 μM/L） 的培养基处理细胞 24 小时。在第 11 天，构建 PLGC （MC） 的细胞模型。
        注意：在建模期间，应定期观察细胞的状态。如果细胞状态不佳，建议用 MNNG 处理它们不同的时间间隔，最好间隔 2 天。或者，可以用低剂量的 MNNG （3 μM/L） 处理细胞。MC 细胞的病理诊断标准可以参考以前的研究，以准确评估细胞的状态 10,19,20,21。
  2. 含药血清的制备
    1. 用标准啮齿动物颗粒饮食和 随意 饮水喂养 30 只 SD 大鼠（雄性，220 克），直到所有大鼠的体重超过 350 克。将大鼠随机分配到阳性含药物血清组 （n=10）、含 HZJD 的血清组 （n=10） 和正常大鼠血清组 （n=10）。
    2. 如步骤 1.3.2 中所述，对大鼠进行药物给药。每天 8：00 AM 和 8：00 PM 给大鼠施用 2 次。继续药物干预 7 天。
    3. 在第 8 天（上午 8：00）最后一次给药后 1 小时内收集血样。将样品置于4°C的抗凝管中1小时。在 4 °C 下以 3,000 x g 离心 15 分钟，然后收集上清液。
  3. 细胞实验的分组和干预方法
    1. 细胞实验分为：GES-1组（GES-1）、MC组（MC）、阳性药物组（阳性药物）、HZJD煎剂组（HZJD）、Sirt3沉默组（si-Sirt3）、阴性对照组（si-NC）和Sirt3沉默联合HZJD煎剂组（si-Sirt3+HZJD）。
    2. 分别用含 10% 维生素 B12 的血清和含 10% HZJD 的血清处理阳性药物组和 HZJD 组的细胞。用 10% 正常大鼠血清施用其他组。
      注：根据之前的研究10，选择含有 10% 药物的血清进行细胞处理。
    3. 对 si-Sirt3 组和 si-Sirt3 + HZJD 组中的细胞进行 Sirt3 si-RNA（参见 材料表）转染。设置一个阴性对照组，接收空向量，即 si-NC。
    4. 将 2.5 nM siRNA 粉末溶解在 125 μL DEPC 中，制备 siRNA 溶液。用 250 μL 最低必需培养基稀释 5 μL siRNA 溶液，用 250 μL 最低必需培养基稀释 5 μL lipofectamine 2000。将它们均匀混合在一起。
    5. 将混合物添加到 6 孔板中的 RPMI 1640 培养基（1.5 mL/孔）中。在 37 °C 和 5% CO2 下孵育。进行 Western blot 分析以检测转染后 48 小时 Sirt3 的蛋白表达水平。

8. CCK-8 检测

  1. 当细胞覆盖瓶底的 70% 时，将细胞制备到细胞悬液中。使用细胞计数仪计数悬液中的细胞数。调整浓度以确保 2,000 个细胞/孔，每个孔含有 100 μL RPMI 1640 培养基。将细胞接种在 96 孔板中，并在 5% CO2 的培养箱中保持在 37 °C 2 24 小时。为每个组设置 6 个重复孔。
    注：未使用的 96 孔板的外围孔中填充有 200 μL PBS，以减少孵育期间的蒸发。
  2. 将细胞培养 24 小时后，用不同的含药物培养基替换培养基。用阳性含药物的培养基和含 HZJD 的培养基将细胞培养 48 小时。
    注意：培养基是透明的。用光观察培养瓶的底部，可以看到细胞被连接成片状。这种现象可以证明细胞已经粘附在壁上。在显微镜下观察时，贴壁细胞延伸到瓶底的穿梭物中，当摇动培养基时，细胞不会移动。细胞通常在培养 24 小时后粘附在壁上。
  3. 用新鲜培养基替换含药物的培养基。向每个孔中加入 10 μL CCK-8 溶液（参见 材料表），并在 37 °C 下孵育 1 小时。为避免形成气泡，将 CCK-8 溶液斜向添加到培养板壁上。
  4. 使用酶标仪在 450 nm 波长下检测每个孔的 OD 值。

9. EdU 细胞增殖测定

  1. 如步骤 7.1 所述，将细胞接种在 96 孔板中。用不同的含药物培养基替换培养基 48 小时。
    注意：通过初步实验确认最佳处理时间为 48 小时。
  2. 取出培养基并用 PBS 洗涤细胞。每孔添加 100 μL 培养基。准备 2x EdU 溶液（参见 材料表，20 μM）。将 6 μL EdU 储备液添加到 3 mL 培养基中。每孔加入 100 μL 的 2x EdU 溶液（37 °C 预热），然后孵育 2.5 小时。
    注：将 EdU 储备液以 1：500 的比例稀释，以获得 2x EdU 溶液。24 孔的 2x EdU 溶液的实际体积为 2.4 mL。
  3. 去除含 EdU 的培养基。在室温下每孔添加 200 μL 4% 多聚甲醛 15 分钟。去除多聚甲醛。用洗涤液（PBS 中的 3% 牛血清白蛋白 [BSA] 溶液）冲洗细胞 3 次，每次 5 分钟。
  4. 取出洗涤液。在室温下每孔加入 200 μL 透化溶液（0.3% Triton-X 100 在 PBS 中），持续 20 分钟。去除透化溶液。用洗涤液（PBS 中的 3% BSA 溶液）冲洗细胞 2 次，每次 5 分钟。
  5. 用 1.3 mL 去离子水溶解添加剂以完成溶液。制备含有 1.72 mL 反应缓冲液、4 μL 叠氮化物 488、80 μL CuSO4 和 200 μL 添加剂溶液的反应溶液。
  6. 每孔加入 50 μL 反应溶液。将样品在室温下避光孵育 30 分钟。用洗涤液冲洗细胞 3 次，每次 5 分钟。
  7. 取出洗涤液。加入 200 μL 的 1x Hoechst 33342 溶液，并在室温下避光孵育样品 10 分钟。
  8. 使用荧光显微镜采集图像。使用 Image-Pro plus 6.0 软件进行定量图像分析。
    注：叠氮化物 488 的最大激发波长和发射波长分别为 495 nm 和 519 nm。Hoechst 33342 的最大激发波长和发射波长分别为 346 nm 和 460 nm。

10. 活细胞中的线粒体自噬检测

  1. 将细胞以每孔 2 x 104 个细胞的密度接种在玻璃底 24 孔板中。用不含抗生素的 RPMI 1640 培养基在 37 °C 和 5% CO2 下培养过夜细胞。
  2. 准备 mtphagy 染料工作溶液和 lyso 染料工作溶液（参见 材料表）。用 Hanks' HEPES 缓冲液将 mtphagy 染料溶液稀释至浓度为 100 nM/L。用 Hanks' HEPES 缓冲液将溶血染料溶液稀释至 100 μM/L 浓度。
  3. 去除培养基并用 Hanks 的 HEPES 缓冲液 2 倍冲洗细胞。加入 500 μL mtphagy 染料工作溶液 （100 nM/L），然后在 37 °C 下孵育 30 分钟。
  4. 用 Hanks 的 HEPES 缓冲液 2 倍冲洗细胞。加入 500 μL 溶血染料工作溶液 （100 μM/L），然后在 37 °C 下孵育 30 分钟。
  5. 用 Hanks 的 HEPES 缓冲液 2 倍冲洗细胞。通过共聚焦荧光显微镜确定线粒体自噬水平。
    注意：细胞在染色前后无任何固定进行成像。成像过程应尽快进行，以尽量减少细胞状态的任何潜在变化或改变。

11. 统计分析

  1. 使用商业软件执行统计分析。使用单因素方差分析比较不同组之间的差异，然后进行 LSD 事后检验。将数据表示为均值±标准差 （SD）。设置统计显著性为 P<0.05。

结果

MNNG 在动物模型中诱导 PLGC 进程并促进 GES-1 细胞的形态学转化

经肉眼观察，对照组大鼠胃粘膜呈均匀的亮红色、光滑、柔软，粘膜皱襞呈线性排列。与对照组大鼠相比，模型组大鼠的胃粘膜表现为苍白和粗糙，粘膜夹层扁平甚至消失（图 1B）。从第 12 周开始，采用组织学检查观察大鼠胃粘膜的病理变化。

讨论

PLGC 是从慢性胃炎发展为 GC 的关键过程。近年来，中医已被证明是治疗 PLGC 的一种很有前途的治疗方法和干预措施24,25。近年来，中医已成为治疗和干预 PLGC 的一种有前途的方法。这与之前的研究一致10.病理检查结果显示，HZJD 煎药明显减轻了 PLGC 大鼠的病理损伤。此外，细胞实验结果还表明，HZJD 煎剂对细胞?...

披露声明

所有作者均声明他们没有利益冲突。

致谢

该项目由中国河北省自然科学基金 （H2020423207） 资助。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidineShanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHNR030453
3,3’-diaminobenzidineBeijing Zhong Shan-Golden Bridge Biological Technology Co., Ltd., Beijing, CHNZLI0919
Alcian blue periodic acid schiff staining reagent kitBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNG1285
Anti-fade fluorescence mounting mediumBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNS2110
Bicinchoninic acid protein concentration determination kitWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG2026-1000T
CCK-8 reagent kitBoster Biological Engineering co., Ltd., Wuhan, CHNAR1160
Confocal fluorescence microscopyLeica Instruments Co., Ltd., Weztlar, GERTCS-SP8SR
COX figure-materials-1036 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab202554
DAPI staining solutionBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNC0065
DEPCWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG3004
EdU cell proliferation kitBeyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, CHNC0071S
Electrophoresis solutionBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0139
EthanolTianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN64-17-5
FBSGibco Corporation, Gaithersburg, USA16000044
Fluorescence microscopeOlympus Corporation, Tokyo, JPNBH2-RFCA
Foxo3a antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHN23683
GAPDH antibodyWuhan Sanying Biology Technology Co., Ltd., Wuhan, CHN10494-1-AP
Gel preparation kitBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0138
GES-1 cellProcell Life Science&Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNCL-0563
Goat-anti-mouse IgGCST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN4409
Goat-anti-rabbit IgGAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab150077
Hematoxylin-eosin staining solutionZhuhai Beso Biotechnology Co., Ltd., Shenzhen, CHNBA4027
High iron diamine/alcian blue staining reagent kitBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNG2070
ImageJNational Institutes of Health, Bethesda, USA
Image-Pro Plus 6.0 softwareMedia Cybernetics Inc., Maryland, USA
IsopropanolTianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN67-63-0
LC3 antibodyCST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN83506
Loading bufferBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0198
Microplate readerRayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd., Shenzhen, CHNRT6100
MicrotomeLeica Instruments Co., Ltd., Weztlar, GERRM2245
Mitophagy kitDojindo Laboratories, Kyushu Island, JPNMD01-10
Neutral balsamWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNWG10004160
Optical microscopeOlympus Corporation, Tokyo, JPNBH2-RFCA
P62 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab91526
ParaformaldehydeBiosharp Life Sciences, Anhui, CHNBL539A
Parkin antibodyCST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN32833
Penicillin–streptomycinGibco Corporation, Gaithersburg, USA15140122
phosphate-buffered salineWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG0002-15
PVDF membraneMillipore Corporation, Michigan, USAIPVH00010
RedzolSBS Genetech Co., Ltd., Beijing, CHNFTR-50
Reverse transcription reagent kitIgene Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, CHNQP057
RIPA Buffer solutionBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNR002
Roswell Park Memorial InstituteGibco Corporation, Gaithersburg, USA11875093
Silicone needleZhongke Life Biotechnology Co., Ltd., Beijing, CHNTFEP-2
siRNAWuhan Genecreate Biological Engineering Co., Ltd. ,Wuhan,CHN
Sirt3 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHN189860
Sodium salicylateShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHNS104176
Sprague-Dawley ratBeijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd., Beijing, CHN110322210102553975
SYBR quantitative PCR kitWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG3320-15
Tomm20 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab186735
Transferring bufferBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0141
TrichloromethaneShanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHN821112
Tris-buffered saline with Tween 20Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG0004
VDAC1 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab15895
XyleneTianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN1330-20-7
β-actin antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab8226

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