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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die therapeutische Wirksamkeit der Huazhuojiedu-Abkochung (HZJD) bei der Linderung von Krebsvorstufen bei Magenkrebs durch Mitophagieregulierung demonstriert.

Zusammenfassung

Diese Forschung zielt darauf ab, die therapeutische Wirkung und mögliche Mechanismen der Huazhuojiedu-Abkochung (HZJD) zur Linderung von Krebsvorstufen von Magenkrebs (PLGC) sowohl in vivo als auch in vitro zu untersuchen. HZJD ist eine traditionelle chinesische Kräuterformel, die aus 11 Kräutern besteht. Sprague-Dawley (SD)-Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in vier Untergruppen eingeteilt: Kontrollgruppe, Modellgruppe, Gruppe mit positivem Wirkstoff und HZJD-Gruppe. Nach 10-wöchiger HZJD-Behandlung wurden Hämatoxylin-Eosin (H&E)-Färbung, Färbung mit hohem Eisendiamin-Alzianblau (HID-AB)-Gehalt, Alzianblau-periodische Säureschiff (AB-PAS)-Färbung, Immunhistochemie, Immunfluoreszenz, RT-qPCR und Western-Blot-Assays durchgeführt. In vitro wurden die Zellzählkit-8 (CCK-8) und 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin (EdU) Assays verwendet, um die Zellproliferation nachzuweisen. RT-qPCR und Western-Blot-Assays wurden durchgeführt, um die Mitophagiewerte zu bewerten. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass HZJD das pathologische Fortschreiten bei PLGC-Ratten verzögern und die Proliferation von PLGC-Zellen reduzieren kann. Die Behandlung mit HZJD erhöhte signifikant die mRNA- und Proteinexpressionsniveaus von Sirt3, Foxo3a, Parkin und LC3 II/I, während die mRNA- und Proteinexpressionsniveaus von p62 und Tomm20 verringert wurden. Es wurde festgestellt, dass HZJD die Fähigkeit hat, den Rückgang der Mitophagieaktivität sowohl in vivo als auch in vitro umzukehren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Studie den Einfluss von HZJD untersuchte und Hinweise auf seinen möglichen molekularen Mechanismus lieferte.

Einleitung

Magenkrebs (GC) ist nach wie vor eine der häufigsten bösartigen Erkrankungen des Verdauungssystems weltweit. Es wird geschätzt, dass GC für etwa 6 % aller Krebserkrankungen weltweit verantwortlich ist, was aufPlatz 5 der am häufigsten diagnostizierten Krebsarten und auf Platz3 unter den krebsbedingten Todesfällen liegt1. GC ist weithin als progressiver, mehrstufiger biologischer Prozess anerkannt. Vor dem Auftreten der GC durchläuft die Magenschleimhaut oft mehrere Jahre lang präkanzeröse Läsionen, die als präkanzeröse Läsionen des Magenkrebses (PLGC) bezeichnet werden. Die Correa-Kaskadentheorie ist weithin anerkannt und liefert eine Erklärung für die sequentielle Progression von normaler Schleimhaut zu chronischer nicht-atrophischer Gastritis, atrophischer Gastritis, intestinaler Metaplasie (IM), Dysplasie (Dys) und schließlich Karzinom2. PLGC stellt eine entscheidende Phase in der GC-Entwicklung dar, und eine rechtzeitige Intervention und Überwachung von PLGC sind für eine frühzeitige GC-Prävention von entscheidender Bedeutung.

Jüngste klinische Bewertungen und experimentelle Forschungen haben bestätigt, dass sich die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) zu einer der wirksamsten Therapien zur Behandlung von PLGC entwickelt 3,4. Der HZJD-Sud ist eine TCM-Formel, die auf der Grundlage klinischer Erfahrungen entwickelt wurde und in der TCM-Theorie der Wärme- und Feuchtigkeitsabfuhr verwurzelt ist. Frühere Studien haben die positiven Wirkungen des HZJD-Suds bei der Behandlung von PLGC gezeigt, insbesondere bei der Linderung klinischer Symptome und pathologischer Manifestationen 5,6. In netzwerkpharmakologischen Studien haben wir die Wirkstoffe der HZJD-Abkochung sowie ihre potenziellen Ziele für PLGC7 identifiziert. Die Ergebnisse einer früheren Studie deuteten darauf hin, dass die HZJD-Abkochung die Fähigkeit hatte, die Vielfalt zu erhöhen, die Gemeinschaftsstruktur zu optimieren und die relative Häufigkeit der Darmflora bei PLGC-Ratten zu erhöhen8. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass die HZJD-Abkochung die PLGC verbessern kann, indem sie die Darmmikrobiota und ihre Metaboliten reguliert9. In neueren Arbeiten haben wir gezeigt, dass die HZJD-Dekodierung das dynamische Gleichgewicht von Zellproliferation und Apoptose in PLGC-Zellen regulieren kann, indem sie die Expression von lnc 51736810 herunterreguliert.

Immer mehr Studien haben bestätigt, dass die Mitophagie bei verschiedenen Krebsarten eine wichtige Rolle spielt. Die Mitophagie eliminiert selektiv geschädigte und depolarisierte Mitochondrien und verhindert darüber hinaus eine übermäßige Akkumulation von zytotoxischen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) aus dem dysfunktionalen Mitochondrium, was wiederum die Tumorgenese hemmt11. Die Mitophagie, der selektive Abbau geschädigter oder dysfunktionaler Mitochondrien, ist eng mit der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) verbunden. Die Beeinträchtigung oder das Fehlen der Mitophagie kann zu einer Verschiebung des zellulären Energiestoffwechsels hin zur aeroben Glykolyse führen, ein Phänomen, das allgemein als Warburg-Effekt bekannt ist. Die erhöhte Produktion von Laktat- und Ketonkörpern, die sich aus dem Warburg-Effekt ergibt, trägt zum Aufbau einer Tumormikroumgebung bei, die der Zellproliferation förderlich ist12.

Diese Studie stellt ein umfassendes Protokoll für die Verwendung von HZJD-Abkochung als therapeutischen Ansatz zur Milderung des Fortschreitens von PLGC vor. Bei unserer Auswertung konnten wir einen signifikanten positiven Effekt der HZJD-Abkochung beobachten, insbesondere in Bezug auf seine Fähigkeit, die Mitophagie zu regulieren. Die Studie liefert wertvolle Einblicke in die möglichen molekularen Mechanismen der HZJD-Abkochung bei der Behandlung von PLGC.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren und die Tierpflege wurden von den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der Universität Hebei (Zulassungsnummer: DWLL2019031) genehmigt und in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien durchgeführt. Insgesamt wurden 90 spezifisch pathogenfreie männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten (Alter = 6 Wochen; Gewicht = 150-180 g; siehe Materialtabelle) bei konstanter Temperatur (24 °C ± 4 °C) und Luftfeuchtigkeit (50%-60%) unter kontrolliertem Dunkel-/Hell-Zyklus von 12 h aufgezogen. Die Ratten wurden 1 Woche lang an die neue Umgebung gewöhnt, bevor sie mit den Experimenten begannen.

1. Vorbereitung des Tierversuchs

  1. Rattenmodell von PLGC
    1. Ordnen Sie die Ratten nach dem Zufallsprinzip einer Kontrollgruppe (n=20) und einer PLGC-Modellgruppe (n=70) zu. Versorgen Sie die Ratten in der Kontrollgruppe mit einer Standarddiät aus Nagetierpellets und Wasser ad libitum. Füttern Sie die Ratten in der PLGC-Modellgruppe mit einer unregelmäßigen Ernährung (1 Tag Fasten, 1 Tag Fütterung).
    2. Halten Sie die Ratten in Fünfergruppen pro Käfig. Geben Sie der Kontrollgruppe 150 g/Tag Futter pro Käfig. Ermöglichen Sie der PLGC-Modellgruppe 23 h freien Zugang zu Futter (150 g/Tag/pro Käfig). Nach 23 h das restliche Futter entfernen.
    3. Den Ratten in der PLGC-Modellgruppe wird 1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidin (MNNG)-Lösung (200 μg/ml) zum freien Trinken10,13 zur Verfügung gestellt. Versorgen Sie die Ratten in der PLGC-Modellgruppe mit 200 mL MNNG-Lösung pro Käfig. Geben Sie die MNNG-Lösung in undurchsichtige Trinkflaschen und tauschen Sie sie täglich aus.
    4. Versorgen Sie die Ratten in der PLGC-Modellgruppe mit 2% Natriumsalicylat nach 24 Stunden Fasten (einmal alle 2 Tage durch Sonde). Verwenden Sie für die Sonde eine Silikonnadel (siehe Materialtabelle) mit einer Mindesttiefe der Nadel von 6 cm. Führen Sie die Sonde morgens zwischen 8:30 Uhr und 9:30 Uhr konsequent zur gleichen Zeit durch.
    5. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip zwei Ratten aus der PLGC-Modellgruppe für die pathologische Untersuchung in den Wochen 12, 16, 20 und 24 aus, um die Etablierung des PLGC-Modells zu beurteilen. Betrachten Sie das Modell als erfolgreich, wenn bei beiden Ratten PLGC durch pathologische Bewertung diagnostiziert wird, wie in9 beschrieben.
      1. Dieser Modellierungsprozess dauert ca. 24 Wochen. Lassen Sie die pathologische Beurteilung unabhängig voneinander von zwei leitenden Pathologen durchführen. Bestimmen Sie die pathologische Diagnose von PLGC bei Ratten durch die gemeinsame Beurteilung von zwei Pathologen. Berücksichtigen Sie deren diagnostische Meinungen und verwenden Sie die vorangegangenen Leitlinien als Referenz im Bewertungsprozess 14,15,16,17.
  2. Zubereitung der HZJD-Abkochung
    1. Bereiten Sie den HZJD-Sud nach der unterNummer 7 beschriebenen Methode vor.
      HINWEIS: Die Kräuter in HZJD-Abkochung wurden vom Hebei Krankenhaus für Traditionelle Chinesische Medizin gekauft und authentifiziert.
  3. Gruppierung und medikamentöse Intervention
    1. Unterteilen Sie die PLGC-Modellgruppe nach dem Zufallsprinzip in drei Untergruppen: Modellgruppe (n=20), Gruppe mit positivem Arzneimittel (n=20) und Huazhuojiedu-Dekoktionsgruppe (HZJD, n=20, Tabelle 1).
    2. Sondierung der Ratten in positiver Wirkstoffgruppe mit 0,7 mg/kg/Tag Vitamin B12 durch Sonde18. Behandeln Sie die Ratten in der HZJD-Gruppe mit HZJD-Abkochung in einer Dosis von 14,81 g/kg/Tag8. Den Ratten in der Kontrollgruppe und der Modellgruppe wird destilliertes Wasser (10 ml/kg) verabreicht. Alle vier Gruppen erhalten die intragastrische Verabreichung einmal täglich für 10 Wochen.
      HINWEIS: Die empfohlene Tagesdosis der HZJD-Abkochung für den Menschen beträgt 142 g/Tag10. Unter Verwendung der Methode zur Berechnung der Körperoberfläche wird festgestellt, dass die empfohlene Dosierung für Ratten das 6,25-fache der des Menschen beträgt. Daher beträgt die Tagesdosis der HZJD-Abkochung für Ratten 14,81 g/kg. Die Dosierung wurde wöchentlich an das Gewicht der Ratten angepasst. Das maximale Sondenvolumen betrug nicht mehr als 3 ml.
  4. Musterkollektion
    1. Tötet alle Ratten nach 24 Stunden Fasten (mit freiem Zugang zu Wasser) in Woche 35. Betäuben Sie alle Ratten mit Isofluran (5% Induktion, 2% zur Erhaltung, 1L/min Flussrate).
    2. Rasieren Sie den Bauchbereich und sterilisieren Sie die Haut mit Ethanol und Jod, nachdem Sie den Verlust der Schmerzstimulation bestätigt haben. Schneiden Sie mit einem Skalpell die Bauchhaut vom Xiphoidknorpel entlang der Mittellinie des Bauches ab.
    3. Das Unterhautgewebe mit einer Pinzette und einem Skalpell stumpf abtrennen, bis der Magen freigelegt ist. Präparieren Sie den Magen entlang der größeren Krümmung mit einer Schere und spülen Sie ihn sofort mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aus.
    4. Entfalten Sie das Magengewebe auf einer Eisplatte. Entnehmen Sie Magenproben (2 mm x 2 mm) aus dem Antrum, dem Korpus und der kleineren Krümmung des Winkelbereichs. Wenn es sichtbare Läsionen am Magen gibt, sammeln und verarbeiten Sie diese spezifischen Teile als Proben.
    5. Fixieren Sie die Magenproben 24 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd. Legen Sie das restliche Magengewebe in Kryoröhrchen. Frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie dann bei -80 °C.
    6. Euthanasieren Sie die Ratten durch Einatmen von Kohlendioxid. Legen Sie Rattenkadaver in versiegelte Beutel und legen Sie die Beutel dann in den Tierkadaverschrank.

2. Pathologische Untersuchung

  1. Trimmen und glätten Sie das fixierte Magengewebe mit einer Schere. Dehydrieren Sie Gewebe mit einer Gradientenalkoholreihe, d.h. 75% Ethanol für 30 min, 85% Ethanol für 30 min, 95% Ethanol für 30 min und 2x in wasserfreiem Ethanol für jeweils 30 min. Tauchen Sie das Gewebe 1 h lang in Xylol/Ethanol-Lösung (1:1) und 2x in 100%iges Xylol für jeweils 30 min.
  2. Gießen Sie die Hälfte des geschmolzenen Wachses in die Form und geben Sie dann die permeabilisierten Gewebe schnell in die Form. Lege die Taschentücher in die andere Hälfte des geschmolzenen Wachses. Markieren Sie die eingebettete Box und lassen Sie das Wachs vollständig erstarren.
  3. Mit dem Mikrotom in Scheiben mit einer Dicke von 4 μm schneiden. Legen Sie die Scheiben auf die Objektträger.
  4. Legen Sie die Scheiben 2x für je 100 min in 100% Xylol, dann 10 min in Xylol/Ethanol-Lösung (1:1), 5 min wieder 2x in wasserfreies Ethanol, dann 5 min in 95 % Ethanol, anschließend 5 min lang 85 % Ethanol und schließlich 5 min lang in 70 % Ethanol. Die Scheiben mit fließendem Wasser abspülen.
  5. Die Scheiben 5 Min. mit Hämatoxylin färben. Zur Unterscheidung wird 0,5 % Salzsäure-Ethanol 10 s lang eingetaucht. Die Scheiben 2 Min. mit Eosin färben.
  6. Die Scheiben mit destilliertem Wasser abspülen. Dehydrieren Sie die Scheiben mit einer Gradientenalkoholreihe, d.h. 70% Ethanol für 30 s, 80% Ethanol für 30 s, 95% Ethanol für 30 s, wasserfreies Ethanol für 30 s. Die Scheiben 2x mit 100% Xylol permeabilisieren. Die Scheiben mit neutralem Balsam verschließen.
  7. Mischen Sie HID-Lösung A und HID-Lösung B im Verhältnis 50:3, um die HID-Arbeitslösung herzustellen. Färben Sie die Scheiben 24 h lang mit der HID-Arbeitslösung.
  8. Unter fließendem Wasser abspülen und dann die Scheiben 20 min lang mit Alcian färben. Färben Sie die Scheiben 10 Minuten lang mit der nuclear fast red Lösung. Dörren und versiegeln Sie die Scheiben wie in Schritt 2.6 beschrieben.
  9. Die Scheiben 20 Min. mit Alcian färben. Die Scheiben in 1%iger wässriger Lösung von Periodensäure 5 min inkubieren. Die Scheiben 20 min mit Schiff färben.
  10. Inkubieren Sie die Objektträger 2 Minuten lang mit Hämatoxylin, um die Zellkerne zu färben. Die saure Differenzierungslösung (im Lieferumfang des HID-Kits enthalten) 5 s lang zugeben. Tragen Sie die Scott Blue Lösung 3 Minuten lang auf, um die Objektträger blau zu färben. Dörren und versiegeln Sie die Scheiben wie oben in Schritt 2.6 beschrieben.
    HINWEIS: Der Färbeprozess sollte vor Licht geschützt werden. Die Temperatur sollte unter 22 °C gehalten werden, wenn 1%ige wässrige Lösung von Periodensäure verwendet wird. Die Scheiben sollten dehydriert und verschlossen werden, wie in Schritt 2.6 beschrieben.
  11. Untersuchen Sie die gefärbten Scheiben unter einem optischen Mikroskop mit einer Vergrößerung von 10x und 20x.

3. Immunhistochemie

  1. Verwenden Sie die in Schritt 2.4 erhaltenen Scheiben. Legen Sie die Scheiben in 0,01 M Natriumcitratpuffer und erhitzen Sie sie 10 Minuten lang, um die Antigengewinnung durchzuführen.
  2. Fügen Sie 3% Wasserstoffperoxid für 30 Minuten hinzu, um die endogene Peroxidase und Biotin zu löschen. Blockieren Sie die Scheiben 30 Minuten lang mit Ziegenserum.
  3. Inkubieren Sie die Scheiben mit den verdünnten Primärantikörpern gegen SIRT3 (1:200), FOXO3a (1:100) und Parkin (1:200) über Nacht bei 4 °C. Ersetzen Sie die Negativkontrolle durch PBS.
  4. Spülen Sie die Scheiben 3x für 5 min pro Spülgang mit PBS. Inkubieren Sie die Scheiben mit dem entsprechenden Sekundärantikörper bei Raumtemperatur für 1 h.
  5. 20 μl 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) für 3 min zugeben. Dörren und versiegeln Sie die Scheiben wie oben in Schritt 2.6 beschrieben.
  6. Bilden Sie alle Schichten bei 40-facher Vergrößerung unter dem Lichtmikroskop ab. Verwenden Sie die Software Image-Pro Plus 6.0, um eine quantitative Bildanalyse durchzuführen.

4. Immunfluoreszenz

  1. Verwenden Sie die in Schritt 3.1 erhaltenen Scheiben. Wiederholen Sie Schritt 3.3.
  2. Inkubieren Sie die Scheiben mit den verdünnten Primärantikörpern gegen COX IV (1:500) und LC3 (1:500) über Nacht bei 4 °C. Spülen Sie die Scheiben 3x für 5 min pro Spülgang mit PBS.
  3. Inkubieren Sie die Scheiben mit dem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (1:1000) und dem Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:1000) bei Raumtemperatur für 1,5 h. Spülen Sie die Scheiben 3x für 5 min pro Spülgang mit PBS.
  4. Geben Sie DAPI-Färbelösung hinzu und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Spülen Sie die Scheiben 3x für 5 min pro Spülgang mit PBS.
  5. Geben Sie tropfenweise DAPI-Färbelösung hinzu und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Montieren Sie die Scheiben mit lichtbeständigem Fluoreszenz-Eindeckmedium.
  6. Visualisieren und fotografieren Sie die Schnitte unter einem Fluoreszenzmikroskop (siehe Materialtabelle) bei 40-facher Vergrößerung.

5. Western-Blot-Analyse

  1. Wiegen Sie 100 mg Magengewebe genau. Fügen Sie 1 ml RIPA-Pufferlösung hinzu (siehe Materialtabelle). Mahlen Sie das Gewebe gründlich mit einem Homogenisator (10.000 x g, jeweils 15 s für 3x).
  2. Legen Sie das Gewebehomogenat für 30 Minuten auf Eis. Bei 12.000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugieren und dann den Überstand auffangen.
  3. Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration mit dem Kit zur Bestimmung der Proteinkonzentration von Bichinoninsäure (BCA) (siehe Materialtabelle). Die Proteinkonzentration des erhaltenen Überstands ist so anzupassen, dass sie innerhalb der Proben konsistent ist.
  4. Bereiten Sie das SDS-PAGE-Gel vor, das aus einem 10%igen Trenngel und einem 5%igen Stapelgel besteht. Gießen Sie das 10%ige Trenngel bis zu 2/3 der Gesamthöhe in die Glasplatte. Geben Sie deionisiertes Wasser über das Gel, bis das Gel fest wird. Gießen Sie das 5%ige Stapelgel ein, um die Glasplatte zu füllen. Setzen Sie den Elektrophoresekamm ein.
    HINWEIS: Es sollte darauf geachtet werden, dass sich keine Blasen im Gel befinden.
  5. Mischen Sie den Proteinüberstand mit 5x Ladepuffer im Verhältnis 1:4. Legen Sie es 5 Minuten lang in kochendes Wasser, damit es denaturiert. Lagern Sie es bei -20 °C.
  6. Montieren Sie das vorbereitete SDS-PAGE-Gel in das Western-Blotting-Elektrophorese-System. Frische Elektrophoreselösung zugeben (siehe Materialtabelle). Laden Sie 20 μl Probe pro Vertiefung auf das Gel. Starten Sie die Elektrophorese bei 80 V für 40 min und schalten Sie dann auf 120 V um.
  7. Sammeln Sie das Gel und erstellen Sie ein Transfersandwich wie folgt: zwei Schichten Schwammpad, zwei Schichten Filterpapier, Gel, Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran (siehe Materialtabelle), zwei Schichten Filterpapier, zwei Schichten Schwammpad (vom Minuspol zum Pluspol). Fügen Sie einen vorgekühlten Transferpuffer hinzu. Führen Sie den Nasstransfer bei 350 mA für 2 h durch.
    HINWEIS: Vor dem Zusammenbau des Transfersandwiches sollte die PVDF-Membran mit Methanol vorbehandelt werden. Zusätzlich sollten der Schwamm, das Filterpapier und die vorbehandelte PVDF-Membran vorher in den Transferpuffer (siehe Materialtabelle) eingetaucht werden.
  8. Blockieren Sie die Membran mit 5% fettfreier Milch in trisgepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST) für 2 h auf einem Shaker. Inkubieren Sie die Membran über Nacht bei 4 °C mit den folgenden verdünnten Primärantikörpern (Sirt3 = 1:500, Foxo3a = 1:1000, Parkin = 1:2000, P62 = 1:1000, LC3 = 1:1000, Tomm20 = 1:2000, β-Aktin = 1:5000, GAPDH = 1:5000).
    HINWEIS: GAPDH wurde als Referenz für den Nachweis von Parkin ausgewählt, da das Molekulargewicht von Parkin (50 kDa) nahe an dem von β-Aktin (42 kDa) liegt.
  9. Waschen Sie die Membran 4x mit TBST für jeweils 5 Minuten. Inkubieren Sie es mit dem verdünnten Sekundärantikörper (1:5000) bei Raumtemperatur für 1 h.
  10. Lassen Sie die ECL-Arbeitslösung 2 Minuten lang auf die Proteinseite der Membranen fallen. Erfassen Sie die Bilder mit dem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem. Verwenden Sie die ImageJ-Software, um die Graustufenwerte zu messen.

6. Quantitative real-time PCR-Analyse

  1. Reinigen Sie alle Versuchsgeräte mit 0,1 % Diethylpyrocarbonat (DEPC) und sterilisieren Sie sie anschließend vorab bei hoher Temperatur und hohem Druck.
  2. Wiegen Sie 50 mg Magengewebe. 1 ml Redzol (siehe Materialtabelle) zugeben und in einem Homogenisator mahlen. Übertragen Sie das Gewebehomogenat in ein RNase-freies Zentrifugenröhrchen und lassen Sie es 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen.
  3. 0,2 ml Trichlormethan zugeben und gründlich mischen. 3 min bei Raumtemperatur ziehen lassen. Zentrifugieren Sie bei 4 °C und 12.000 x g für 15 min.
  4. Entfernen Sie vorsichtig die obere wässrige Phase und mischen Sie sie 10 Minuten lang mit 0,5 mL Isopropanol. 12.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren, um RNA auszufällen. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie dann den RNA-Präzipitat 3x mit 75% Ethanol.
  5. Zentrifugieren Sie bei 7.500 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie die RNA-Präzipitation 10 Minuten lang in einer sterilen Werkbank. Lösen Sie den Niederschlag in 50 μl DEPC.
  6. 1 μg RNA in cDNA reverse-transkribieren. Fügen Sie 1 μl 20x RTase-Mix, 4 μl 5x RT-Reaktionspuffer hinzu (siehe Materialtabelle) und füllen Sie DEPC auf ein Gesamtvolumen von 20 μl auf. Stellen Sie das Reaktionsverfahren wie folgt ein: 10 min bei 25 °C, 40 min bei 42 °C, 10 min bei 85 °C und dann bei 4 °C halten.
  7. Bereiten Sie ein Amplifikationsreaktionsgemisch vor, das 2 μl cDNA, 2 μl Forward-Primer, 2 μl Reverse-Primer (Tabelle 2), 10 μl 2x SYBR-Premix (siehe Materialtabelle) und 4 μl DEPC enthält. Stellen Sie das Reaktionsverfahren wie folgt ein: 95 °C für 15 s, 60 °C für 10 s und 72 °C für 30 s (40 Zyklen).
  8. Verwenden Sie β-Aktin als endogene Referenz. Rufen Sie die Ct-Werte ab. Berechnen Sie die relative Expression von Zielgenen mit der 2-ΔΔCt-Methode.

7. Vorbereitung von Zellexperimenten

  1. Zellmodell von PLGC
    1. Kultivieren Sie die GES-1-Zellen im Medium 1640 des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) in Kombination mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin. Kultivieren Sie die Zellen bei 2 x 105 Zellen pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte mit 1,5 ml RPMI 1640 Medium ohne Serum und Antibiotika bei 37 °C mit 5 % CO2.
    2. Induzieren Sie die GES-1-Zellen mit MNNG für die maligne Transformation. Legen Sie die Modellierungsanordnung wie unten beschrieben fest.
      1. Am Tag 0 werden GES-1-Zellen vor der Reanimation und Passage durchgeführt, um sie in der logarithmischen Wachstumsphase zu halten. Die logarithmischen GES-1-Zellen werden in Kulturflaschen inokuliert und über Nacht kultiviert.
      2. Ersetzen Sie an Tag 1 und Tag 2 das MNNG (10 μM/L)-haltige Medium. Ersetzen Sie an Tag 3 das MNNG-haltige Medium durch ein arzneimittelfreies Medium.
      3. Behandeln Sie die Zellen an Tag 4 und Tag 6 24 h lang mit MNNG (5 μM/L)-haltigem Medium. Ersetzen Sie an Tag 7 das MNNG-haltige Medium durch ein arzneimittelfreies Medium. Entfernen Sie die zahlreichen absterbenden und abstoßenden Zellen und setzen Sie die Zellkultur fort.
      4. Behandeln Sie die Zellen an Tag 8 und Tag 10 24 h lang mit dem Medium, das MNNG (5 μM/L) enthält. Konstruieren Sie an Tag 11 das Zellmodell von PLGC (MC).
        HINWEIS: Während des Modellierungszeitraums sollte der Status der Zellen regelmäßig beobachtet werden. Wenn die Zellen einen schlechten Zustand aufweisen, wird empfohlen, sie in verschiedenen Zeitintervallen, vorzugsweise im Abstand von 2 Tagen, mit MNNG zu behandeln. Alternativ können die Zellen mit einer niedrigen Dosis MNNG (3 μM/L) behandelt werden. Die pathologischen Diagnosekriterien von MC-Zellen können aus früheren Forschungen herangezogen werden, um den Status der Zellen genau zu beurteilen 10,19,20,21.
  2. Herstellung von arzneimittelhaltigem Serum
    1. Füttern Sie 30 SD-Ratten (männlich, 220 g) mit einer Standard-Nagetierpelletdiät und Wasser ad libitum , bis alle Ratten mehr als 350 g wiegen. Ordnen Sie die Ratten nach dem Zufallsprinzip der positiven arzneimittelhaltigen Serumgruppe (n = 10), der HZJD-haltigen Serumgruppe (n = 10) und der normalen Rattenserumgruppe (n = 10) zu.
    2. Die Verabreichung des Arzneimittels an Ratten ist wie in Schritt 1.3.2 beschrieben durchzuführen. Verabreichen Sie den Ratten 2x täglich um 8:00 Uhr und 20:00 Uhr. Setzen Sie die medikamentöse Intervention für 7 Tage fort.
    3. Entnehmen Sie die Blutproben innerhalb von 1 h nach der letzten Verabreichung an Tag 8 (8:00 Uhr). Die Proben werden 1 h lang bei 4 °C in Antikoagulanzienröhrchen gegeben. Bei 3.000 x g 15 min bei 4 °C zentrifugieren und anschließend den Überstand auffangen.
  3. Gruppierung und Interventionsmethoden von Zellexperimenten
    1. Teilen Sie die Zellexperimente wie folgt auf: GES-1-Gruppe (GES-1), MC-Gruppe (MC), positive Wirkstoffgruppe (positives Medikament), HZJD-Dekoktionsgruppe (HZJD), Sirt3-Silencing-Gruppe (si-Sirt3), negative Kontrollgruppe (si-NC) und Sirt3-Silencing kombiniert mit HZJD-Dekod-Dekodgruppe (si-Sirt3+HZJD).
    2. Behandeln Sie die Zellen in der positiven Wirkstoffgruppe und der HZJD-Gruppe mit 10 % Vitamin B12-haltigem Serum bzw. 10 % HZJD-haltigem Serum. Anderen Gruppen 10% normales Rattenserum verabreichen.
      HINWEIS: Basierend auf früheren Untersuchungen10 wurden 10 % arzneimittelhaltiges Serum für die Zellbehandlung ausgewählt.
    3. Führen Sie eine Sirt3 si-RNA (siehe Materialtabelle) Transfektion für die Zellen der si-Sirt3-Gruppe und der si-Sirt3+HZJD-Gruppe durch. Richten Sie eine Negativkontrollgruppe ein, die einen leeren Vektor, nämlich si-NC, empfängt.
    4. Löse 2,5 nM siRNA-Leistung in 125 μl DEPC auf, um die siRNA-Lösung herzustellen. 5 μl siRNA-Lösung mit mindestens 250 μl essentiellem Medium verdünnen und 5 μl Lipofectamine 2000 mit mindestens 250 μl essentiellem Medium verdünnen. Vermische sie gleichmäßig miteinander.
    5. Geben Sie die Mischung in RPMI 1640 Medium (1,5 ml/pro Well) in eine 6-Well-Platte. Inkubieren bei 37 °C mit 5 % CO2. Führen Sie eine Western-Blot-Analyse durch, um das Proteinexpressionsniveau von Sirt3 48 Stunden nach der Transfektion nachzuweisen.

8. CCK-8-Analyse

  1. Bereiten Sie die Zellen in Zellsuspension vor, wenn die Zellen 70 % des Flaschenbodens bedecken. Verwenden Sie den Zellzähler, um die Anzahl der Zellen in der Suspension zu zählen. Passen Sie die Konzentration so an, dass 2.000 Zellen/Vertiefung vorhanden sind und jede Vertiefung 100 μl RPMI 1640 Medium enthält. Die Zellen in 96-Well-Platten aussäen und in einem Inkubator mit 5 % CO2 24 h bei 37 °C halten. Richten Sie 6 Replikationsvertiefungen für jede Gruppe ein.
    HINWEIS: Die peripheren Vertiefungen der 96-Well-Platten, die nicht verwendet werden, sind mit 200 μl PBS gefüllt, um die Verdunstung während der Inkubationszeit zu reduzieren.
  2. Nachdem Sie die Zellen 24 Stunden lang kultiviert haben, ersetzen Sie das Kulturmedium durch ein anderes arzneimittelhaltiges Kulturmedium. Die Zellen werden 48 h lang mit positivem arzneimittelhaltigem Kulturmedium und HZJD-haltigem Kulturmedium kultiviert.
    HINWEIS: Das Nährmedium ist klar. Betrachtet man den Boden der Kulturflasche mit Licht, so ist zu erkennen, dass die Zellen zu Blättern verbunden sind. Dieses Phänomen kann beweisen, dass die Zellen an der Wand haften geblieben sind. Bei der Beobachtung unter dem Mikroskop erstrecken sich die adhärenten Zellen zu Schiffchen am Boden der Flasche und beim Schütteln des Kulturmediums bewegen sich die Zellen nicht. Die Zellen haften in der Regel nach 24 Stunden Kultur an der Wand.
  3. Ersetzen Sie das arzneimittelhaltige Kulturmedium durch ein frisches Kulturmedium. Geben Sie 10 μl CCK-8-Lösung (siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung und inkubieren Sie 1 h lang bei 37 °C. Um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, geben Sie die CCK-8-Lösung schräg an die Wand der Kulturplatte.
  4. Ermitteln Sie den OD-Wert jedes Wells mit einem Mikroplatten-Reader bei einer Wellenlänge von 450 nm.

9. EdU-Zellproliferations-Assay

  1. Aussäen Sie die Zellen in 96-Well-Platten, wie in Schritt 7.1 beschrieben. Ersetzen Sie das Kulturmedium für 48 Stunden durch ein anderes arzneimittelhaltiges Kulturmedium.
    HINWEIS: Die optimale Behandlungszeit wurde durch vorläufige Versuche mit 48 h bestätigt.
  2. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit PBS. Geben Sie 100 μl Kulturmedium pro Vertiefung hinzu. Bereiten Sie die 2x EdU-Lösung vor (siehe Materialtabelle, 20 μM). Geben Sie 6 μl der EdU-Stammlösung in 3 ml Nährmedium auf. 100 μL der 2x EdU-Lösung (37 °C vorgewärmt) pro Vertiefung zugeben und dann 2,5 h inkubieren.
    HINWEIS: Die EdU-Stammlösung wurde in einem Verhältnis von 1:500 verdünnt, um die 2x EdU-Lösung zu erhalten. Das tatsächliche Volumen der 2x EdU-Lösung betrug 2,4 mL für 24 Wells.
  3. Entfernen Sie das EdU-haltige Medium. 200 μl 4% Paraformaldehyd pro Vertiefung bei Raumtemperatur für 15 min zugeben. Paraformaldehyd entfernen. Spülen Sie die Zellen 3x für jeweils 5 min mit Waschlösung (3% Rinderserumalbumin [BSA] in PBS).
  4. Entfernen Sie die Waschlösung. Geben Sie 200 μl Permeabilisierungslösung (0,3 % Triton-X 100 in PBS) pro Vertiefung bei Raumtemperatur für 20 Minuten hinzu. Entfernen Sie die Permeabilisierungslösung. Spülen Sie die Zellen 2x für jeweils 5 min mit Waschlösung (3% BSA in PBS).
  5. Löse das Additiv mit 1,3 ml deionisiertem Wasser auf, um die Lösung zu vervollständigen. Die Reaktionslösung wird hergestellt und enthält 1,72 ml Reaktionspuffer, 4 μl Azid 488, 80 μl CuSO4 und 200 μl Additivlösung.
  6. Geben Sie 50 μl Reaktionslösung pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 30 min im Dunkeln. Spülen Sie die Zellen 3x für je 5 min mit Waschlösung.
  7. Entfernen Sie die Waschlösung. 200 μl 1x Hoechst 33342 Lösung zugeben und die Proben 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
  8. Nehmen Sie Bilder mit dem Fluoreszenzmikroskop auf. Verwenden Sie die Software Image-Pro plus 6.0, um eine quantitative Bildanalyse durchzuführen.
    HINWEIS: Die maximalen Anregungs- und Emissionswellenlängen von Azid 488 betragen 495 nm bzw. 519 nm. Die maximalen Anregungs- und Emissionswellenlängen von Hoechst 33342 betragen 346 nm bzw. 460 nm.

10. Nachweis von Mitophagie in lebenden Zellen

  1. Aussaat der Zellen mit 2 x 104 Zellen pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte mit Glasboden. Kultivieren Sie Übernachtzellen mit RPMI 1640 Medium ohne Antibiotika bei 37 °C mit 5 % CO2.
  2. Bereiten Sie die Farbstoff-Arbeitslösung mtphagy und die Lyso-Farbstoff-Arbeitslösung vor (siehe Materialtabelle). Verdünnen Sie die mtphagy-Farbstofflösung mit Hanks' HEPES-Puffer auf eine Konzentration von 100 nM/L. Verdünnen Sie die Lyso-Farbstofflösung mit Hanks' HEPES-Puffer auf eine Konzentration von 100 μM/L.
  3. Entfernen Sie das Kulturmedium und spülen Sie die Zellen 2x mit Hanks' HEPES-Puffer aus. 500 μl mtphagy-Farbstoff-Arbeitslösung (100 nM/l) zugeben und dann 30 Minuten lang bei 37 °C inkubieren.
  4. Spülen Sie die Zellen 2x mit Hanks' HEPES-Puffer. 500 μl Lyso-Farbstoff-Arbeitslösung (100 μM/L) zugeben und dann 30 Minuten lang bei 37 °C inkubieren.
  5. Spülen Sie die Zellen 2x mit Hanks' HEPES-Puffer. Bestimmen Sie den Grad der Mitophagie durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie.
    HINWEIS: Die Zellen wurden ohne Fixierung vor oder nach der Färbung abgebildet. Der bildgebende Prozess wurde so schnell wie möglich durchgeführt, um mögliche Veränderungen oder Veränderungen des zellulären Zustands zu minimieren.

11. Statistische Analysen

  1. Verwenden Sie kommerzielle Software, um statistische Analysen durchzuführen. Vergleichen Sie die Unterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen mit der Einweg-ANOVA, gefolgt vom LSD-Post-hoc-Test. Stellen Sie die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dar. Legen Sie die statistische Signifikanz auf P<0,05 fest.

Ergebnisse

MNNG induziert die PLGC-Progression im Tiermodell und fördert die morphologische Transformation von GES-1-Zellen

Bei makroskopischer Beobachtung erschien die Magenschleimhaut der Ratten in der Kontrollgruppe einheitlich hellrot, glatt und weich, wobei die Schleimhautfalten in einem linearen Muster angeordnet waren. Im Gegensatz zu den Ratten in der Kontrollgruppe wies die Magenschleimhaut der Ratten in der Modellgruppe Blässe und Rauheit auf...

Diskussion

PLGC dient als Schlüsselprozess im Verlauf von chronischer Gastritis zu GC. Die TCM hat sich in den letzten Jahren als vielversprechende Behandlung und Intervention bei PLGC erwiesen24,25. In den letzten Jahren hat sich die TCM als vielversprechender Ansatz für die Behandlung und Intervention von PLGC herauskristallisiert. Dies steht im Einklang mit früherenForschungen 10. Die Ergebnisse der pathologisc...

Offenlegungen

Alle Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Danksagungen

Dieses Projekt wurde von der Natural Science Foundation der chinesischen Provinz Hebei (H2020423207) finanziert.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidineShanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHNR030453
3,3’-diaminobenzidineBeijing Zhong Shan-Golden Bridge Biological Technology Co., Ltd., Beijing, CHNZLI0919
Alcian blue periodic acid schiff staining reagent kitBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNG1285
Anti-fade fluorescence mounting mediumBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNS2110
Bicinchoninic acid protein concentration determination kitWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG2026-1000T
CCK-8 reagent kitBoster Biological Engineering co., Ltd., Wuhan, CHNAR1160
Confocal fluorescence microscopyLeica Instruments Co., Ltd., Weztlar, GERTCS-SP8SR
COX figure-materials-1036 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab202554
DAPI staining solutionBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNC0065
DEPCWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG3004
EdU cell proliferation kitBeyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, CHNC0071S
Electrophoresis solutionBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0139
EthanolTianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN64-17-5
FBSGibco Corporation, Gaithersburg, USA16000044
Fluorescence microscopeOlympus Corporation, Tokyo, JPNBH2-RFCA
Foxo3a antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHN23683
GAPDH antibodyWuhan Sanying Biology Technology Co., Ltd., Wuhan, CHN10494-1-AP
Gel preparation kitBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0138
GES-1 cellProcell Life Science&Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNCL-0563
Goat-anti-mouse IgGCST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN4409
Goat-anti-rabbit IgGAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab150077
Hematoxylin-eosin staining solutionZhuhai Beso Biotechnology Co., Ltd., Shenzhen, CHNBA4027
High iron diamine/alcian blue staining reagent kitBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNG2070
ImageJNational Institutes of Health, Bethesda, USA
Image-Pro Plus 6.0 softwareMedia Cybernetics Inc., Maryland, USA
IsopropanolTianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN67-63-0
LC3 antibodyCST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN83506
Loading bufferBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0198
Microplate readerRayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd., Shenzhen, CHNRT6100
MicrotomeLeica Instruments Co., Ltd., Weztlar, GERRM2245
Mitophagy kitDojindo Laboratories, Kyushu Island, JPNMD01-10
Neutral balsamWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNWG10004160
Optical microscopeOlympus Corporation, Tokyo, JPNBH2-RFCA
P62 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab91526
ParaformaldehydeBiosharp Life Sciences, Anhui, CHNBL539A
Parkin antibodyCST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN32833
Penicillin–streptomycinGibco Corporation, Gaithersburg, USA15140122
phosphate-buffered salineWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG0002-15
PVDF membraneMillipore Corporation, Michigan, USAIPVH00010
RedzolSBS Genetech Co., Ltd., Beijing, CHNFTR-50
Reverse transcription reagent kitIgene Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, CHNQP057
RIPA Buffer solutionBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNR002
Roswell Park Memorial InstituteGibco Corporation, Gaithersburg, USA11875093
Silicone needleZhongke Life Biotechnology Co., Ltd., Beijing, CHNTFEP-2
siRNAWuhan Genecreate Biological Engineering Co., Ltd. ,Wuhan,CHN
Sirt3 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHN189860
Sodium salicylateShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHNS104176
Sprague-Dawley ratBeijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd., Beijing, CHN110322210102553975
SYBR quantitative PCR kitWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG3320-15
Tomm20 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab186735
Transferring bufferBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0141
TrichloromethaneShanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHN821112
Tris-buffered saline with Tween 20Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG0004
VDAC1 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab15895
XyleneTianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN1330-20-7
β-actin antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab8226

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