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Method Article
Ici, nous présentons un protocole qui démontre l’efficacité thérapeutique de la décoction de Huazhuojiedu (HZJD) dans le soulagement des lésions précancéreuses du cancer gastrique en utilisant la régulation de la mitohagie.
Cette recherche vise à explorer l’effet thérapeutique et les mécanismes potentiels de la décoction de Huazhuojiedu (HZJD) pour soulager les lésions précancéreuses du cancer gastrique (PLGC) à la fois in vivo et in vitro. HZJD est une formule traditionnelle chinoise à base de plantes composée de 11 herbes. Les rats Sprague-Dawley (SD) ont été divisés au hasard en quatre sous-groupes : groupe témoin, groupe modèle, groupe de médicament positif et groupe HZJD. La coloration à l’hématoxyline-éosine (H&E), la coloration à haute teneur en diamine-bleu d’alcian (HID-AB), la coloration au bleu d’alcian-acide périodique de Schiff (AB-PAS), l’immunohistochimie, l’immunofluorescence, la RT-qPCR et le Western blot ont été effectués après 10 semaines de traitement par HZJD. In vitro, les dosages de comptage cellulaire kit-8 (CCK-8) et de 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU) ont été utilisés pour détecter la prolifération cellulaire. Des tests RT-qPCR et Western blot ont été effectués pour évaluer les taux de mitophagie. Les résultats ont indiqué que HZJD pouvait retarder la progression pathologique chez les rats PLGC et réduire la prolifération cellulaire PLGC. Le traitement par HZJD a significativement augmenté les niveaux d’expression de l’ARNm et des protéines de Sirt3, Foxo3a, Parkin et LC3 II/I, tout en diminuant les niveaux d’expression de l’ARNm et des protéines de p62 et Tomm20. Il s’est avéré que HZJD avait la capacité d’inverser le déclin de l’activité de la mitophagie in vivo et in vitro. En conclusion, l’étude a évalué l’impact de HZJD et a fourni des preuves concernant son mécanisme moléculaire potentiel.
Le cancer gastrique (GC) reste l’une des maladies malignes les plus courantes affectant le système digestif dans le monde. On estime que le GC représente environ 6 % de tous les cancers dans le monde, se classant au 5e rang des cancers les plus fréquemment diagnostiqués et au 3e rang des décès liés au cancer1. La CG est largement reconnue comme un processus biologique progressif en plusieurs étapes. Avant l’apparition de la GC, la muqueuse gastrique subit souvent plusieurs années de lésions précancéreuses, appelées lésions précancéreuses du cancer gastrique (PLGC). La théorie de la cascade de Correa est largement acceptée et fournit une explication de la progression séquentielle de la muqueuse normale à la gastrite chronique non atrophique, à la gastrite atrophique, à la métaplasie intestinale (MI), à la dysplasie (Dys) et finalement au carcinome2. La PLGC représente une étape cruciale dans le développement de la GC, et une intervention et une surveillance rapides de la PLGC sont essentielles pour la prévention précoce de la GC.
Des évaluations cliniques récentes et des recherches expérimentales ont confirmé que la médecine traditionnelle chinoise (MTC) est en train de devenir l’une des thérapies les plus efficaces pour traiter le PLGC 3,4. La décoction HZJD est une formule de MTC développée sur la base de l’expérience clinique et enracinée dans la théorie de la MTC sur l’élimination de la chaleur et de l’humidité. Des études antérieures ont démontré les effets bénéfiques de la décoction de HZJD dans le traitement de la PLGC, en particulier dans le soulagement des symptômes cliniques et des manifestations pathologiques 5,6. Grâce à des études pharmacologiques en réseau, nous avons identifié les composants actifs de la décoction de HZJD ainsi que leurs cibles potentielles pour PLGC7. Les résultats d’une étude précédente indiquaient que la décoction de HZJD avait la capacité d’améliorer la diversité, d’optimiser la structure de la communauté et d’augmenter l’abondance relative de la flore intestinale chez les rats PLGC8. De plus, il a été vérifié que la décoction de HZJD pouvait améliorer le PLGC en régulant le microbiote intestinal et ses métabolites9. Dans des travaux récents, nous avons démontré que la décoction de HZJD pouvait réguler l’équilibre dynamique de la prolifération cellulaire et de l’apoptose dans les cellules PLGC en régulant à la baisse l’expression de lnc 51736810.
De plus en plus d’études ont confirmé que la mitophagie joue un rôle important dans divers cancers. La mitophagie élimine sélectivement les mitochondries endommagées et dépolarisées et empêche en outre l’accumulation excessive d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) cytotoxiques de la mitochondrie dysfonctionnelle, ce qui inhibe à son tour la tumorigenèse11. La mitophagie, la dégradation sélective des mitochondries endommagées ou dysfonctionnelles, est intimement liée à la phosphorylation oxydative mitochondriale (OXPHOS). L’altération ou l’absence de mitophagie peut entraîner un changement du métabolisme énergétique cellulaire vers la glycolyse aérobie, un phénomène communément appelé effet Warburg. L’augmentation de la production de lactate et de corps cétoniques, résultant de l’effet Warburg, contribue à la construction d’un microenvironnement tumoral propice à la prolifération cellulaire12.
Cette étude présente un protocole complet pour l’utilisation de la décoction de HZJD comme approche thérapeutique pour atténuer la progression de la PLGC. Grâce à notre évaluation, nous avons observé un effet positif significatif de la décoction de HZJD, notamment dans sa capacité à réguler la mitophagie. L’étude fournit des informations précieuses sur les mécanismes moléculaires potentiels de la décoction de HZJD dans le traitement de la PLGC.
Toutes les procédures expérimentales et les soins aux animaux ont été approuvés par les directives du comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine traditionnelle chinoise du Hebei (numéro d’approbation : DWLL2019031) et ont été effectués conformément aux directives éthiques. Au total, 90 rats Sprague-Dawley mâles (SD) exempts d’agents pathogènes spécifiques (âge = 6 semaines ; poids = 150-180 g ; voir le tableau des matériaux) ont été élevés à une température constante (24 °C ± 4 °C) et à une humidité (50 %-60 %) sous un cycle contrôlé d’obscurité/lumière de 12 h. Les rats ont été acclimatés au nouvel environnement pendant 1 semaine avant de commencer les expériences.
1. Préparation à l’expérimentation animale
2. Examen pathologique
3. Immunohistochimie
4. Immunofluorescence
5. Analyse par transfert Western
6. Analyse PCR quantitative en temps réel
7. Préparation aux expériences cellulaires
8. Dosage CCK-8
9. Essai de prolifération cellulaire EdU
10. Détection de mitophagie dans les cellules vivantes
11. Analyses statistiques
Le MNNG induit la progression du PLGC dans le modèle animal et favorise la transformation morphologique des cellules GES-1
Lors de l’observation macroscopique, la muqueuse gastrique des rats du groupe témoin est apparue uniformément rouge vif, lisse et molle, avec les plis muqueux disposés selon un motif linéaire. Contrairement aux rats du groupe témoin, la muqueuse gastrique des rats du groupe modèle présentait une pâleur et une ru...
La PLGC joue un rôle clé dans la progression de la gastrite chronique vers la GC. La MTC s’est avérée être un traitement et une intervention prometteurs pour la PLGC au cours des dernières années24,25. Ces dernières années, la MTC est apparue comme une approche prometteuse pour le traitement et l’intervention du PLGC. Cela est cohérent avec les recherches précédentes10. Les résultats de l?...
Tous les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.
Ce projet a été financé par la Fondation des sciences naturelles de la province du Hebei en Chine (H2020423207).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHN | R030453 | |
3,3’-diaminobenzidine | Beijing Zhong Shan-Golden Bridge Biological Technology Co., Ltd., Beijing, CHN | ZLI0919 | |
Alcian blue periodic acid schiff staining reagent kit | Beijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHN | G1285 | |
Anti-fade fluorescence mounting medium | Beijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHN | S2110 | |
Bicinchoninic acid protein concentration determination kit | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHN | G2026-1000T | |
CCK-8 reagent kit | Boster Biological Engineering co., Ltd., Wuhan, CHN | AR1160 | |
Confocal fluorescence microscopy | Leica Instruments Co., Ltd., Weztlar, GER | TCS-SP8SR | |
COX ![]() | Abcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHN | ab202554 | |
DAPI staining solution | Beijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHN | C0065 | |
DEPC | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHN | G3004 | |
EdU cell proliferation kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, CHN | C0071S | |
Electrophoresis solution | Boster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHN | AR0139 | |
Ethanol | Tianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN | 64-17-5 | |
FBS | Gibco Corporation, Gaithersburg, USA | 16000044 | |
Fluorescence microscope | Olympus Corporation, Tokyo, JPN | BH2-RFCA | |
Foxo3a antibody | Abcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHN | 23683 | |
GAPDH antibody | Wuhan Sanying Biology Technology Co., Ltd., Wuhan, CHN | 10494-1-AP | |
Gel preparation kit | Boster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHN | AR0138 | |
GES-1 cell | Procell Life Science&Technology Co., Ltd., Wuhan, CHN | CL-0563 | |
Goat-anti-mouse IgG | CST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN | 4409 | |
Goat-anti-rabbit IgG | Abcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHN | ab150077 | |
Hematoxylin-eosin staining solution | Zhuhai Beso Biotechnology Co., Ltd., Shenzhen, CHN | BA4027 | |
High iron diamine/alcian blue staining reagent kit | Beijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHN | G2070 | |
ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, USA | ||
Image-Pro Plus 6.0 software | Media Cybernetics Inc., Maryland, USA | ||
Isopropanol | Tianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN | 67-63-0 | |
LC3 antibody | CST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN | 83506 | |
Loading buffer | Boster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHN | AR0198 | |
Microplate reader | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd., Shenzhen, CHN | RT6100 | |
Microtome | Leica Instruments Co., Ltd., Weztlar, GER | RM2245 | |
Mitophagy kit | Dojindo Laboratories, Kyushu Island, JPN | MD01-10 | |
Neutral balsam | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHN | WG10004160 | |
Optical microscope | Olympus Corporation, Tokyo, JPN | BH2-RFCA | |
P62 antibody | Abcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHN | ab91526 | |
Paraformaldehyde | Biosharp Life Sciences, Anhui, CHN | BL539A | |
Parkin antibody | CST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN | 32833 | |
Penicillin–streptomycin | Gibco Corporation, Gaithersburg, USA | 15140122 | |
phosphate-buffered saline | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHN | G0002-15 | |
PVDF membrane | Millipore Corporation, Michigan, USA | IPVH00010 | |
Redzol | SBS Genetech Co., Ltd., Beijing, CHN | FTR-50 | |
Reverse transcription reagent kit | Igene Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, CHN | QP057 | |
RIPA Buffer solution | Beijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHN | R002 | |
Roswell Park Memorial Institute | Gibco Corporation, Gaithersburg, USA | 11875093 | |
Silicone needle | Zhongke Life Biotechnology Co., Ltd., Beijing, CHN | TFEP-2 | |
siRNA | Wuhan Genecreate Biological Engineering Co., Ltd. ,Wuhan,CHN | ||
Sirt3 antibody | Abcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHN | 189860 | |
Sodium salicylate | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHN | S104176 | |
Sprague-Dawley rat | Beijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd., Beijing, CHN | 110322210102553975 | |
SYBR quantitative PCR kit | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHN | G3320-15 | |
Tomm20 antibody | Abcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHN | ab186735 | |
Transferring buffer | Boster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHN | AR0141 | |
Trichloromethane | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHN | 821112 | |
Tris-buffered saline with Tween 20 | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHN | G0004 | |
VDAC1 antibody | Abcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHN | ab15895 | |
Xylene | Tianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN | 1330-20-7 | |
β-actin antibody | Abcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHN | ab8226 |
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