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요약

여기에서는 미토파지 조절을 사용하여 위암의 전암성 병변을 완화하는 데 있어 Huazhuojiedu 달인(HZJD)의 치료 효능을 입증하는 프로토콜을 소개합니다.

초록

이 연구는 생체 내 및 체외 모두에서 위암의 전암성 병변(PLGC)을 완화하기 위한 Huazhuojiedu 달임(HZJD)의 치료 효과와 잠재적 메커니즘을 탐구하는 것을 목표로 합니다. HZJD는 11가지 허브로 구성된 중국 전통 허브 포뮬러입니다. Sprague-Dawley(SD) 쥐는 무작위로 대조군, 모델 그룹, 양성 약물 그룹 및 HZJD 그룹의 4개 하위 그룹으로 나뉘었습니다. HZJD 치료 10주 후 Hematoxylin-eosin(H&E) 염색, 고철분 디아민-알시안 블루(HID-AB) 염색, ALCIAN 블루-주기적 산 쉬프(AB-PAS) 염색, 면역조직화학, 면역형광, RT-qPCR 및 웨스턴 블롯 분석을 수행했습니다. 세포 증식을 검출하기 위해 시험관 내에서, 세포 계수 키트-8(CCK-8) 및 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU) 분석을 사용했습니다. 미토파지 수치를 평가하기 위해 RT-qPCR 및 웨스턴 블롯 분석을 수행했습니다. 그 결과, HZJD가 PLGC 쥐의 병리학적 진행을 지연시키고 PLGC 세포 증식을 감소시킬 수 있음을 시사했습니다. HZJD를 사용한 치료는 Sirt3, Foxo3a, Parkin 및 LC3 II/I의 mRNA 및 단백질 발현 수준을 크게 증가시키는 동시에 p62 및 Tomm20의 mRNA 및 단백질 발현 수준을 감소시켰습니다. HZJD는 in vivo 및 in vitro 모두에서 미토파지 활성의 감소를 역전시킬 수 있는 능력이 있는 것으로 밝혀졌습니다. 결론적으로, 이 연구는 HZJD의 영향을 평가하고 잠재적인 분자 메커니즘에 대한 증거를 제공했습니다.

서문

위암(GC)은 전 세계적으로 소화계에 영향을 미치는 가장 흔한 악성 질환 중 하나입니다. GC는 전 세계 모든 암의 약 6%를 차지하는 것으로 추정되며, 가장 빈번하게 진단되는 암 중 5위 , 암 관련 사망 사례 중 3위를 차지합니다1. GC는 점진적인 다단계 생물학적 과정으로 널리 알려져 있습니다. GC가 발병하기 전에 위 점막은 종종 위암의 전암성 병변(PLGC) 단계라고 하는 수년간의 전암성 병변을 겪습니다. 코레아 폭포 이론(Correa cascade theory)은 정상 점막에서 만성 비위축성 위염, 위축성 위염, 장 화생(IM), 이형성증(Dys), 그리고 결국 암종2로 순차적으로 진행되는 것에 대한 설명을 제공합니다. PLGC는 GC 발달에서 중요한 단계를 나타내며, PLGC의 적시 개입 및 모니터링은 조기 GC 예방에 필수적입니다.

최근의 임상 평가 및 실험 연구는 중국 전통 의학(TCM)이 PLGC 3,4를 치료하는 가장 효과적인 치료법 중 하나로 부상하고 있음을 확인했습니다. HZJD 달인은 임상 경험을 바탕으로 개발된 TCM 공식으로 열 및 습기 제거에 대한 TCM 이론에 뿌리를 두고 있습니다. 이전 연구에서는 PLGC 치료, 특히 임상 증상 및 병리학적 징후를 완화하는 데 HZJD 달인의 유익한 효과가 입증되었습니다 5,6. 네트워크 약리학 관련 연구를 통해 HZJD 달인의 활성 성분과 PLGC7의 잠재적 표적을 확인했습니다. 이전 연구의 결과에 따르면 HZJD 달인은 PLGC 쥐의 다양성을 향상시키고, 군집 구조를 최적화하며, 장내 세균총의 상대적 풍부도를 증가시키는 능력이 있는 것으로 나타났습니다8. 또한, HZJD 달임이 장내 미생물총(microbiota)과 그 대사산물을 조절하여 PLGC를 개선할 수 있음이 확인되었다9. 최근 연구에서 우리는 HZJD 달인이 lnc 51736810의 발현을 하향 조절함으로써 PLGC 세포에서 세포 증식과 세포사멸의 동적 균형을 조절할 수 있음을 입증했습니다.

점점 더 많은 연구에서 미토파지가 다양한 암에서 중요한 역할을 한다는 사실이 확인되었습니다. Mitophagy는 손상되고 탈분극된 미토콘드리아를 선택적으로 제거하고, 더 나아가 역기능 미토콘드리아에서 세포독성 활성산소종(ROS)이 과도하게 축적되는 것을 방지하여 종양 형성을 억제합니다11. 손상되거나 기능 장애가 있는 미토콘드리아의 선택적 분해인 미토파지(Mitophagy)는 미토콘드리아 산화적 인산화(OXPHOS)와 복잡하게 연결되어 있습니다. 미토파지의 손상 또는 부재는 세포 에너지 대사를 호기성 해당작용으로 전환할 수 있으며, 이는 일반적으로 바르부르크 효과(Warburg effect)로 알려진 현상입니다. 바르부르크 효과(Warburg effect)로 인한 젖산염과 케톤체의 생산 증가는 세포 증식에 도움이 되는 종양 미세환경을 형성하는 데 기여한다12.

이 연구는 PLGC의 진행을 완화하기 위한 치료 접근법으로 HZJD 달인을 활용하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 평가를 통해 HZJD 달임의 유의미한 긍정적 효과, 특히 미토파지를 조절하는 능력에서 관찰되었습니다. 이 연구는 PLGC 치료에서 HZJD 달인의 잠재적인 분자 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.

프로토콜

모든 실험 절차 및 동물 관리는 Hebei University of Traditional Chinese Medicine Institutional Animal Care and Use Committee Guidelines(승인 번호: DWLL2019031)의 승인을 받았으며 윤리 지침에 따라 수행되었습니다. 총 90 마리의 특정 병원체가없는 수컷 Sprague-Dawley (SD) 쥐 (연령 = 6 주, 체중 = 150-180g, 재료 표 참조)를 12 시간의 제어 된 어둡고 밝은 주기에서 일정한 온도 (24 ° C ± 4 ° C)와 습도 (50 % -60 %)에서 키웠습니다. 쥐는 실험을 시작하기 전에 1주일 동안 새로운 환경에 적응했습니다.

1. 동물실험 준비

  1. PLGC의 쥐 모델
    1. 쥐를 대조군(n=20)과 PLGC 모델 그룹(n=70)에 무작위로 할당합니다. 대조군의 쥐에게 표준 설치류 펠릿 사료 와 물을 공급합니다. PLGC 모델 그룹의 쥐에게 불규칙한 식단(1일 금식, 1일 먹이기)을 먹이십시오.
    2. 쥐를 우리당 5명씩 그룹으로 나눠 수용합니다. 대조군에게 케이지당 하루 150g의 사료를 제공합니다. PLGC 모델 그룹이 23시간(150g/일/케이지당) 동안 식품에 자유롭게 접근할 수 있도록 합니다. 23 시간 후 남은 사료를 제거하십시오.
    3. PLGC 모델 그룹의 쥐에게 1-메틸-3-니트로-1-니트로소구아니딘(MNNG) 용액(200μg/mL)을 무료로 마실 수 있도록 제공합니다10,13. PLGC 모델 그룹의 쥐에게 케이지당 200mL의 MNNG 용액을 제공합니다. MNNG 용액을 불투명한 음료수 병에 넣고 매일 교체하십시오.
    4. PLGC 모델 그룹의 쥐를 공복 24시간 후(2일에 한 번, 공복 24시간) 2% 살리실산나트륨으로 배배쥬합니다. 가스의 경우 바늘의 최소 깊이가 6cm인 실리콘 바늘( 재료 표 참조)을 사용하십시오. 오전 8시 30분에서 9시 30분 사이에 같은 시간에 지속적으로 가비쥬를 수행합니다.
    5. PLGC 모델의 확립을 평가하기 위해 12주, 16주, 20주 및 24주에 병리학적 검사를 위해 PLGC 모델 그룹에서 두 마리의 쥐를 무작위로 선택합니다. 9에 설명된 대로 두 쥐 모두 병리학적 평가에 의해 PLGC로 진단되었을 때 모델이 성공적이라고 가정합니다.
      1. 이 모델링 프로세스는 약 24주 동안 지속됩니다. 병리학적 평가가 두 명의 선임 병리학자에 의해 독립적으로 수행될 수 있도록 합니다. 두 병리학자의 공동 평가를 통해 쥐에서 PLGC의 병리학적 진단을 결정합니다. 그들의 진단 의견을 고려하고 평가 과정에서 이전 지침을 참조로 사용하십시오 14,15,16,17.
  2. HZJD 달인 준비
    1. 7에 설명된 방법에 따라 HZJD 달인을 준비합니다.
      참고: HZJD 달인 허브는 Hebei Hospital of Traditional Chinese Medicine에서 구매 및 인증했습니다.
  3. 그룹화 및 약물 개입
    1. PLGC 모델 그룹을 모델 그룹(n=20), 양성 약물 그룹(n=20) 및 Huazhuojiedu 달인 그룹(HZJD, n=20, 표 1)의 세 가지 하위 그룹으로 무작위로 나눕니다.
    2. 양성 약물 그룹의 쥐에게 gavage18에 의해 0.7 mg / kg / day의 비타민 B12를 Gavage합니다. HZJD 그룹의 쥐를 14.81g/kg/일에서 HZJD 달인으로 치료합니다8. 대조군 및 모델군의 쥐에게 증류수(10mL/kg)를 투여합니다. 4개 그룹 모두 10주 동안 하루에 한 번 위내 투여를 받습니다.
      참고: 인간을 위한 HZJD 달인의 일일 권장 복용량은 142g/일10입니다. 체표면적 계산 방법을 사용하여 쥐에 대한 권장 용량은 인간의 6.25배인 것으로 확인되었습니다. 따라서 쥐에 대한 HZJD 달인의 일일 복용량은 14.81g / kg입니다. 복용량은 쥐의 체중에 따라 매주 조정되었습니다. 최대 위장 부피는 3mL를 초과하지 않았습니다.
  4. 시료 채취
    1. 35주차에 24시간 금식(물을 자유롭게 이용할 수 있음) 후 모든 쥐를 희생시킵니다. 모든 쥐를 이소플루란(isoflurane)으로 마취합니다(유도 5%, 유지 관리 2%, 유속 1L/min).
    2. 복부를 면도하고 통증 자극의 소실을 확인한 후 에탄올과 요오드로 피부를 살균합니다. 메스로 복부 정중선을 따라 xiphoid 연골의 복부 피부를 자릅니다.
    3. 위가 드러날 때까지 집게와 메스로 피하 조직을 둔기로 분리합니다. 가위로 더 큰 곡률을 따라 위를 절개하고 즉시 인산염 완충 식염수(PBS)로 헹굽니다.
    4. 얼음판에 위 조직을 펼칩니다. 전방, 말뭉치 및 각도 영역의 더 작은 곡률에서 위 샘플(2mm x 2mm)을 수집합니다. 위에 눈에 띄는 병변이 있는 경우 해당 특정 부분을 표본으로 수집하고 처리합니다.
    5. 위 샘플을 4% 파라포름알데히드로 24시간 동안 고정합니다. 남은 위 조직을 냉동관에 넣습니다. 액체 질소에 얼린 다음 -80 °C에서 보관하십시오.
    6. 이산화탄소 흡입을 통해 쥐를 안락사시킵니다. 쥐 사체는 밀봉된 가방에 넣은 다음 동물 사체 보관 캐비닛에 가방을 넣으십시오.

2. 병리학적 검사

  1. 가위로 고정된 위 조직을 다듬고 매끄럽게 합니다. 구배 알코올 계열, 즉 75% 에탄올을 30분 동안, 85% 에탄올을 30분 동안, 95% 에탄올을 30분 동안 그리고 2x 무수 에탄올을 각각 30분 동안 탈수합니다. 조직을 자일렌/에탄올 용액(1:1)에 1시간 동안 담그고, 100% 자일렌에 2배씩 각각 30분 동안 담그십시오.
  2. 용융된 왁스의 절반을 주형에 붓고 투과된 조직을 주형에 빠르게 넣습니다. 용융된 왁스의 다른 절반에 조직을 놓습니다. 내장된 상자를 표시하고 왁스가 완전히 응고되도록 합니다.
  3. 마이크로톰을 사용하여 4μm 두께의 조각으로 자릅니다. 슬라이드에 슬라이스를 놓습니다.
  4. 슬라이스를 100% 크실렌에 2배씩 10분 동안 넣은 다음 자일렌/에탄올 용액(1:1)에 10분, 다시 2배를 무수 에탄올에 5분, 95% 에탄올에 5분, 85% 에탄올에 5분, 마지막으로 70% 에탄올에 5분 동안 넣습니다. 흐르는 물로 조각을 헹굽니다.
  5. 헤마톡실린으로 슬라이스를 5분 동안 염색합니다. 0.5% 염산-에탄올을 10초 동안 담가 구별합니다. 슬라이스를 에오신 2분 동안 염색합니다.
  6. 증류수로 조각을 헹굽니다. 그라디언트 알코올 계열, 즉 30초 동안 70% 에탄올, 30초 동안 80% 에탄올, 30초 동안 95% 에탄올, 30초 동안 무수 에탄올로 슬라이스를 탈수합니다. 100% 자일렌 2x로 슬라이스를 투과화합니다. 중성 발삼으로 조각을 밀봉하십시오.
  7. HID 솔루션 A와 HID 솔루션 B를 50:3 비율로 혼합하여 HID 작업 솔루션을 준비합니다. HID 작업 솔루션으로 24시간 동안 슬라이스를 염색합니다.
  8. 흐르는 물에 헹군 다음 20분 동안 알시안으로 슬라이스를 염색합니다. 핵 고속 적색 용액으로 슬라이스를 10분 동안 대조 염색합니다. 2.6단계에서 설명한 대로 슬라이스를 탈수하고 밀봉합니다.
  9. 알시안으로 슬라이스를 20분 동안 염색합니다. 슬라이스를 주기적인 산의 1% 수용액에 5분 동안 배양합니다. Schiff로 20분 동안 슬라이스를 염색합니다.
  10. 핵을 염색하기 위해 2분 동안 hematoxylin으로 슬라이드를 배양합니다. 산성 분화 용액(HID 키트와 함께 제공됨)을 5초 동안 추가합니다. Scott 블루 솔루션을 3분 동안 적용하여 슬라이드를 파란색으로 칠합니다. 위의 2.6단계에서 설명한 대로 슬라이스를 탈수하고 밀봉합니다.
    알림: 염색 과정은 빛으로부터 보호되어야 합니다. 온도는 주기성 산의 22% 수용액을 사용할 때 1°C 이하로 유지되어야 합니다. 슬라이스는 2.6단계에서 설명한 대로 탈수하고 밀봉해야 합니다.
  11. 광학 현미경으로 10배 및 20배의 배율로 염색된 조각을 검사합니다.

3. 면역조직화학(Immunohistochemistry)

  1. 2.4단계에서 얻은 슬라이스를 사용합니다. 슬라이스를 0.01M 구연산나트륨 완충액에 넣고 10분 동안 가열하여 항원 검색을 수행합니다.
  2. 3% 과산화수소를 30분 동안 첨가하여 내인성 과산화효소와 비오틴을 담금질합니다. 염소 세럼으로 30분 동안 슬라이스를 막습니다.
  3. Sirt3 (1:200), foxo3a (1:100) 및 parkin (1:200)에 대한 희석된 1차 항체와 함께 슬라이스를 4°C에서 밤새 배양합니다. 음성 대조군을 위해 1차 항체를 PBS로 대체합니다.
  4. PBS로 헹굴 때마다 5분 동안 슬라이스를 3번 헹굽니다. 슬라이스를 해당 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
  5. 3분 동안 20μL의 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)을 추가합니다. 위의 2.6단계에서 설명한 대로 슬라이스를 탈수하고 밀봉합니다.
  6. 광학 현미경으로 40배 배율로 모든 슬라이스를 이미지화합니다. Image-Pro Plus 6.0 소프트웨어를 사용하여 정량적 이미지 분석을 수행할 수 있습니다.

4. 면역형광

  1. 3.1단계에서 얻은 슬라이스를 사용합니다. 3.3단계를 반복합니다.
  2. COX IV (1:500) 및 LC3 (1:500)에 대해 희석된 1차 항체와 함께 슬라이스를 4°C에서 밤새 배양합니다. PBS로 헹굴 때마다 5분 동안 슬라이스를 3번 헹굽니다.
  3. 염소 항토끼 IgG(1:1000) 및 염소 항쥐 IgG(1:1000)로 슬라이스를 실온에서 1.5시간 동안 배양합니다. PBS로 헹굴 때마다 5분 동안 슬라이스를 3번 헹굽니다.
  4. DAPI 염색 용액을 넣고 어두운 곳에서 10분 동안 실온에서 배양합니다. PBS로 헹굴 때마다 5분 동안 슬라이스를 3번 헹굽니다.
  5. 적방울 DAPI 염색 용액을 추가하고 어두운 곳에서 10분 동안 실온에서 배양합니다. 페이드 방지 형광 장착 매체로 슬라이스를 장착합니다.
  6. 형광 현미경( Table of Materials)으로 40배 배율로 슬라이스를 시각화하고 사진을 찍습니다.

5. 웨스턴 블롯 분석

  1. 위 조직 100mg의 무게를 정확하게 잰다. RIPA 완충 용액 1mL를 추가합니다( 재료 표 참조). 균질화기(10,000 x g, 3x의 경우 매번 15초)를 사용하여 조직을 철저히 분쇄합니다.
  2. 조직 균질액을 얼음 위에 30분 동안 놓습니다. 12,000 x g 에서 4°C에서 20분 동안 원심분리기를 한 다음 상층액을 수집합니다.
  3. bicinchoninic acid (BCA) 단백질 농도 측정 키트를 사용하여 단백질 농도를 정량화합니다( 재료 표 참조). 얻어진 상등액의 단백질 농도를 샘플 내에서 일정하게 조정합니다.
  4. 10% 분리 젤과 5% 스태킹 젤로 구성된 SDS-PAGE 젤을 준비합니다. 10% 분리 젤을 유리판에 총 높이의 2/3까지 붓습니다. 젤이 응고될 때까지 젤 위에 탈이온수를 추가합니다. 5% 스태킹 젤을 붓고 유리판을 채웁니다. 전기영동 빗을 삽입합니다.
    알림: 젤에 기포가 없는지 주의해야 합니다.
  5. 단백질 상등액을 5x loading buffer와 1:4의 비율로 혼합합니다. 끓는 물에 5분 동안 넣어 변성시킵니다. -20 °C에서 보관하십시오.
  6. 준비된 SDS-PAGE 겔을 웨스턴 블로팅 전기영동 시스템에서 조립합니다. 새로운 전기영동 용액을 추가합니다( 재료 표 참조). 웰당 20μL의 샘플을 겔에 로드합니다. 80V에서 40분 동안 전기영동을 시작한 다음 120V로 전환합니다.
  7. 젤을 모으고 다음과 같이 전사 샌드위치를 만듭니다 : 스폰지 패드 2 층, 여과지 2 층, 젤, 폴리 비닐 리덴 플루오 라이드 (PVDF) 멤브레인 ( 재료 표 참조), 여과지 2 층, 스폰지 패드 2 층 (음극에서 양극까지). 사전 냉각된 전송 버퍼를 추가합니다. 350mA에서 2시간 동안 습식 이송을 수행합니다.
    참고: 트랜스퍼 샌드위치를 조립하기 전에 PVDF 멤브레인을 메탄올로 전처리해야 합니다. 또한 스펀지, 여과지 및 전처리된 PVDF 멤브레인을 사전에 전사 완충액( 재료 표 참조)에 담가야 합니다.
  8. 셰이커에서 2시간 동안 트윈 20(TBST)으로 트리스 완충 식염수에 5% 무지방 우유를 넣은 멤브레인을 막습니다. 다음과 같은 희석된 1차 항체(Sirt3 = 1:500, Foxo3a = 1:1000, Parkin = 1:2000, P62 = 1:1000, LC3 = 1:1000, Tomm20 = 1:2000, β-actin = 1:5000, GAPDH = 1:5000)를 사용하여 4°C에서 밤새 멤브레인을 배양합니다.
    참고: GAPDH는 Parkin(50kDa)의 분자량이 β-actin(42kDa)의 분자량에 가깝기 때문에 Parkin 검출을 위한 기준으로 선택되었습니다.
  9. 매번 5분 동안 TBST로 멤브레인을 4번 세척합니다. 희석된 2차 항체(1:5000)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
  10. ECL 작동 용액을 멤브레인의 단백질 쪽에 2분 동안 떨어뜨립니다. 화학발광 이미징 시스템을 통해 이미지를 획득합니다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 그레이스케일 값을 측정합니다.

6. 정량적 Real-Time PCR 분석

  1. 모든 실험 장치를 0.1% 디에틸 피로탄산염(DEPC)으로 세척한 다음 미리 고온 및 고압에서 멸균합니다.
  2. 위 조직 50mg의 무게를 잰다. Redzol 1mL( 재료 표 참조)를 넣고 균질화기에서 분쇄합니다. 조직 균질액을 RNase-free 원심분리기 튜브로 옮기고 실온에서 10분 동안 그대로 둡니다.
  3. 트리클로로메탄 0.2mL를 넣고 잘 섞는다. 실온에서 3분 동안 그대로 두십시오. 4°C에서 12,000 x g 에서 15분 동안 원심분리기
  4. 상부 수성상을 조심스럽게 제거하고 0.5mL의 이소프로판올과 10분 동안 혼합합니다. RNA를 침전시키기 위해 4°C에서 10분 동안 12,000 x g 를 원심분리기합니다. 상등액을 버리고 RNA 침전물을 75% 에탄올로 3배 세척합니다.
  5. 7,500 x g 에서 4°C에서 5분간 원심분리기. 상층액을 버리고 RNA 침전물을 멸균 작업대에서 10분 동안 건조시킵니다. 침전물을 50μL의 DEPC에 용해시킵니다.
  6. 1 μg RNA를 cDNA로 역전사합니다. 1 μL의 20x RTase mix, 4 μL의 5x RT 반응 완충액( 재료 표 참조)을 추가하고 DEFC를 총 부피 20 μL로 보충합니다. 반응 절차를 다음과 같이 설정합니다: 25 °C에서 10분, 42 °C에서 40분, 85 °C에서 10분, 그리고 나서 4 °C에서 유지.
  7. cDNA 2μL, 순방향 프라이머 2μL, 역방향 프라이머 2μL(표 2), 2x SYBR 프리믹스 10μL( 재료 표 참조) 및 DEPC 4μL를 포함하는 증폭 반응 혼합물을 준비합니다. 반응 절차를 다음과 같이 설정합니다: 95°C에서 15초, 60°C에서 10초, 72°C에서 30초(40사이클)).
  8. β-actin을 내인성 참조로 사용하십시오. Ct 값을 구합니다. 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 타겟 유전자의 상대적 발현을 계산합니다.

7. 세포 실험 준비

  1. PLGC의 세포 모델
    1. Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배지에서 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신과 결합된 GES-1 세포를 배양합니다. 혈청 및 항생제가 없는 1.5mL의 RPMI 1640 배지를 함유한 6웰 플레이트에서 웰당 2 x 105 개의 세포로 세포를 37°C에서 5%CO2로 배양합니다.
    2. MNNG로 GES-1 세포를 유도하여 악성 형질전환을 유도합니다. 아래 설명된 대로 모델링 배치를 설정합니다.
      1. 0일차에는 GES-1 세포를 사전 소생시키고 계대를 측정하여 로그 성장 단계를 유지합니다. 배양 플라스크에 log-phase GES-1 세포를 접종하고 밤새 배양합니다.
      2. 1일차와 2일차에 MNNG(10μM/L) 함유 배지를 교체합니다. 3일차에 MNNG 함유 배지를 무약물 배지로 교체합니다.
      3. 4일차와 6일차에 MNNG(5μM/L) 함유 배지로 세포를 24시간 동안 처리합니다. 7일째에 MNNG 함유 배지를 무약물 배지로 교체합니다. 수많은 죽어가고 흘리는 세포를 제거하고 세포 배양을 계속합니다.
      4. 8일차와 10일차에 MNNG(5μM/L)가 포함된 배지로 세포를 24시간 동안 처리합니다. 11일차에 PLGC(MC)의 세포 모델을 구성합니다.
        참고: 모델링 기간 동안 셀의 상태를 정기적으로 관찰해야 합니다. 세포의 상태가 좋지 않은 경우 다른 시간 간격, 가급적이면 2일 간격으로 MNNG로 치료하는 것이 좋습니다. 또는 세포를 저용량의 MNNG(3μM/L)로 처리할 수 있습니다. MC 세포의 병리학적 진단 기준은 세포의 상태를 정확하게 평가하기 위해 이전 연구에서 참조될 수 있습니다 10,19,20,21.
  2. 약물 함유 혈청의 제조
    1. 30마리의 SD 쥐(수컷, 220g)에게 표준 설치류 펠릿 사료를 먹이고 모든 쥐의 체중이 350g 이상이 될 때까지 물을 뿌립니다. 쥐를 약물 함유 양성 혈청 그룹(n=10), HZJD 함유 혈청 그룹(n=10) 및 정상 쥐 혈청 그룹(n=10)에 무작위로 할당합니다.
    2. 1.3.2단계에서 설명한 대로 쥐에게 약물 투여를 수행합니다. 쥐를 매일 2회 오전 8:00 및 오후 8:00에 투여합니다. 7일 동안 약물 개입을 계속합니다.
    3. 8일째(오전 8:00) 마지막 투여 후 1시간 이내에 혈액 샘플을 수집합니다. 샘플을 항응고제 튜브에 넣고 4°C에서 1시간 동안 보관합니다. 3,000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리기를 한 다음 상층액을 수집합니다.
  3. 세포 실험의 그룹화 및 중재 방법
    1. 세포 실험을 다음과 같이 나눕니다: GES-1 그룹(GES-1), MC 그룹(MC), 양성 약물 그룹(양성 약물), HZJD 달인 그룹(HZJD), Sirt3 침묵 그룹(si-Sirt3), 음성 대조군(si-NC) 및 HZJD 달인 그룹(si-Sirt3+HZJD)과 결합된 Sirt3 침묵.
    2. 양성 약물군과 HZJD 그룹의 세포를 각각 10% 비타민 B12 함유 혈청과 10% HZJD 함유 혈청으로 처리합니다. 다른 그룹에는 10%의 정상 쥐 혈청을 투여합니다.
      참고: 이전 연구10에 따라 세포 치료를 위해 10% 약물 함유 혈청을 선택했습니다.
    3. si-Sirt3 그룹 및 si-Sirt3+HZJD 그룹의 세포에 대해 Sirt3 si-RNA( 재료 표 참조) transfection을 수행합니다. 빈 벡터를 받는 음성 제어 그룹, 즉 si-NC를 설정합니다.
    4. 125 μL의 DEPC에 2.5 nM siRNA power를 용해하여 siRNA 용액을 준비합니다. 5 μL의 siRNA 용액을 250 μL의 최소 필수 배지로 희석하고 5 μL의 lipofectamine 2000을 250 μL의 최소 필수 배지로 희석합니다. 골고루 섞는다.
    5. 혼합물을 6웰 플레이트의 RPMI 1640 배지(1.5mL/웰당)에 추가합니다. 37 ° C에서 5 % CO2로 배양하십시오. 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 transfection 후 48시간에 Sirt3의 단백질 발현 수준을 검출합니다.

8. CCK-8 분석

  1. 세포가 병 바닥의 70%를 덮을 때 세포를 세포 현탁액으로 준비합니다. cell counter를 사용하여 현탁액에 있는 세포의 수를 계산합니다. 2,000개의 세포/웰이 되도록 농도를 조정하고 각 웰에는 100μL의 RPMI 1640 배지가 포함되어 있습니다. 96웰 플레이트에 세포를 시딩하고 5% CO2 가 있는 인큐베이터에서 24시간 동안 37°C로 유지합니다. 각 그룹에 대해 6개의 복제 웰을 설정합니다.
    참고: 사용되지 않는 96웰 플레이트의 주변 웰은 배양 기간 동안 증발을 줄이기 위해 200μL의 PBS로 채워집니다.
  2. 24시간 동안 세포를 배양한 후 배양 배지를 다른 약물 함유 배양 배지로 교체합니다. 양성 약물 함유 배양 배지 및 HZJD 함유 배양 배지로 48시간 동안 세포를 배양합니다.
    참고: 배양 매체는 명확합니다. 배양병의 바닥을 빛으로 관찰하면 세포가 시트로 연결되어 있는 것을 볼 수 있습니다. 이 현상은 세포가 벽에 달라붙었다는 것을 증명할 수 있습니다. 현미경으로 관찰하면 부착 세포가 병 바닥의 셔틀로 확장되고 배양 배지를 흔들 때 세포가 움직이지 않습니다. 세포는 일반적으로 배양 24시간 후에 벽에 부착됩니다.
  3. 약물 함유 배양 배지를 신선한 배양 배지로 교체하십시오. 각 웰에 10μL의 CCK-8 용액( 재료 표 참조)을 추가하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 기포 형성을 방지하려면 CCK-8 용액을 배양 플레이트 벽에 비스듬히 첨가하십시오.
  4. 450nm 파장에서 마이크로플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 OD 값을 검출합니다.

9. EdU 세포 증식 분석

  1. 7.1단계에서 설명한 대로 96웰 플레이트에 세포를 시딩합니다. 배양 배지를 48시간 동안 다른 약물 함유 배양 배지로 교체합니다.
    참고: 예비 실험을 통해 최적의 치료 시간을 48시간으로 확인하였습니다.
  2. 매체를 제거하고 PBS로 세포를 세척합니다. 웰당 100μL의 배양 배지를 추가합니다. 2x EdU 용액을 준비합니다( 재료 표, 20μM 참조). 6μL의 EdU 원액을 3mL의 배양 배지에 추가합니다. 웰당 100μL의 2x EdU 용액(37°C 예열)을 추가한 다음 2.5시간 동안 배양합니다.
    참고: EdU 원액을 1:500의 비율로 희석하여 2x EdU 용액을 얻었습니다. 2x EdU 용액의 실제 부피는 24웰에 대해 2.4mL였습니다.
  3. EdU 함유 매체를 제거합니다. 실온에서 15분 동안 웰당 200μL의 4% 파라포름알데히드를 추가합니다. 파라포름알데히드를 제거합니다. 세척 용액(PBS의 경우 3% 소 혈청 알부민[BSA])으로 세포를 각각 3회 5회 헹굽니다.
  4. 세척액을 제거하십시오. 실온에서 웰당 200μL의 투과화 용액(PBS의 0.3% Triton-X 100)을 20분 동안 추가합니다. 투과화 용액을 제거합니다. 세척 용액(PBS의 경우 3% BSA)으로 세포를 각각 5분 동안 2회 헹굽니다.
  5. 첨가제를 1.3mL의 탈이온수로 용해시켜 용액을 완성합니다. 1.72 mL의 반응 완충액, 4 μL의 아지드 488, 80 μL의 CuSO4 및 200 μL의 첨가제 용액을 포함하는 반응 용액을 준비합니다.
  6. 웰당 50μL의 반응 용액을 추가합니다. 어두운 곳에서 30분 동안 실온에서 샘플을 배양합니다. 세척 용액으로 세포를 각각 3분씩 5회 헹굽니다.
  7. 세척액을 제거하십시오. 200μL의 1x Hoechst 33342 용액을 추가하고 어두운 곳에서 10분 동안 실온에서 샘플을 배양합니다.
  8. 형광 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다. Image-Pro plus 6.0 소프트웨어를 사용하여 정량적 이미지 분석을 수행할 수 있습니다.
    참고: Azide 488의 최대 여기 및 방출 파장은 각각 495nm 및 519nm입니다. Hoechst 33342의 최대 여기 파장 및 방출 파장은 각각 346nm 및 460nm입니다.

10. 살아있는 세포에서 Mitophagy 검출

  1. 유리 바닥 24웰 플레이트에 웰당 2 x 104 개의 세포로 세포를 파종합니다. 항생제 없이 RPMI 1640 배지로 37°C에서 5% CO2로 하룻밤 동안 세포를 배양합니다.
  2. mtphagy 염료 작업 용액 및 리소 염료 작업 솔루션을 준비합니다( 재료 표 참조). Hanks의 HEPES 완충액으로 mtphagy 염료 용액을 100nM/L의 농도로 희석합니다.Hanks의 HEPES 완충액으로 lyso 염료 용액을 100μM/L의 농도로 희석합니다.
  3. 배양 배지를 제거하고 Hanks의 HEPES buffer 2x로 세포를 헹굽니다. 500μL의 mtphagy 염료 작업 용액(100nM/L)을 추가한 다음 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
  4. Hanks의 HEPES 완충액 2x로 세포를 헹굽니다. 500μL의 리소 염료 작업 용액(100μM/L)을 첨가한 다음 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
  5. Hanks의 HEPES 완충액 2x로 세포를 헹굽니다. 컨포칼 형광 현미경 검사로 미토파지 수준을 측정합니다.
    참고: 세포는 염색 전이나 후에 어떠한 고정도 없이 이미지화되었습니다. 이미징 프로세스는 세포 상태의 잠재적인 변화 또는 변경을 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 수행되었습니다.

11. 통계 분석

  1. 상용 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다. 서로 다른 그룹 간의 차이를 일원 분산 분석(One-Way ANOVA) 다음에 LSD 사후 검정(LSD post hoc test)으로 비교합니다. 데이터를 평균 ± 표준 편차(SD)로 제시합니다. 통계적 유의성을 P<0.05로 설정합니다.

결과

MNNG는 동물모델에서 PLGC 진행을 유도하고 GES-1 세포의 형태학적 형질전환을 촉진합니다.

거시적으로 관찰한 결과, 대조군에 속한 쥐의 위 점막은 균일하게 밝은 빨갛고 매끄럽고 부드러웠으며, 점막 주름은 선형 패턴으로 배열되어 있었다. 대조군의 쥐와 대조적으로, 모델 그룹의 쥐의 위 점막은 창백하고 거칠었으며 점막 플리카는 평평?...

토론

PLGC는 만성 위염에서 GC로 진행하는 핵심 과정 역할을 합니다. TCM은 최근 몇 년 동안 PLGC에 대한 유망한 치료 및 중재로 입증되었습니다24,25. 최근 몇 년 동안 TCM은 PLGC의 치료 및 중재를 위한 유망한 접근 방식으로 부상했습니다. 이는 이전 연구10과 일치한다. 병리학적 검사 결과, HZJD 달인은 PLGC 쥐의 병리학적 ?...

공개

모든 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

이 프로젝트는 중국 허베이성 자연과학재단(H2020423207)의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidineShanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHNR030453
3,3’-diaminobenzidineBeijing Zhong Shan-Golden Bridge Biological Technology Co., Ltd., Beijing, CHNZLI0919
Alcian blue periodic acid schiff staining reagent kitBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNG1285
Anti-fade fluorescence mounting mediumBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNS2110
Bicinchoninic acid protein concentration determination kitWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG2026-1000T
CCK-8 reagent kitBoster Biological Engineering co., Ltd., Wuhan, CHNAR1160
Confocal fluorescence microscopyLeica Instruments Co., Ltd., Weztlar, GERTCS-SP8SR
COX figure-materials-1036 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab202554
DAPI staining solutionBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNC0065
DEPCWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG3004
EdU cell proliferation kitBeyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, CHNC0071S
Electrophoresis solutionBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0139
EthanolTianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN64-17-5
FBSGibco Corporation, Gaithersburg, USA16000044
Fluorescence microscopeOlympus Corporation, Tokyo, JPNBH2-RFCA
Foxo3a antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHN23683
GAPDH antibodyWuhan Sanying Biology Technology Co., Ltd., Wuhan, CHN10494-1-AP
Gel preparation kitBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0138
GES-1 cellProcell Life Science&Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNCL-0563
Goat-anti-mouse IgGCST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN4409
Goat-anti-rabbit IgGAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab150077
Hematoxylin-eosin staining solutionZhuhai Beso Biotechnology Co., Ltd., Shenzhen, CHNBA4027
High iron diamine/alcian blue staining reagent kitBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNG2070
ImageJNational Institutes of Health, Bethesda, USA
Image-Pro Plus 6.0 softwareMedia Cybernetics Inc., Maryland, USA
IsopropanolTianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN67-63-0
LC3 antibodyCST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN83506
Loading bufferBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0198
Microplate readerRayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd., Shenzhen, CHNRT6100
MicrotomeLeica Instruments Co., Ltd., Weztlar, GERRM2245
Mitophagy kitDojindo Laboratories, Kyushu Island, JPNMD01-10
Neutral balsamWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNWG10004160
Optical microscopeOlympus Corporation, Tokyo, JPNBH2-RFCA
P62 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab91526
ParaformaldehydeBiosharp Life Sciences, Anhui, CHNBL539A
Parkin antibodyCST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN32833
Penicillin–streptomycinGibco Corporation, Gaithersburg, USA15140122
phosphate-buffered salineWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG0002-15
PVDF membraneMillipore Corporation, Michigan, USAIPVH00010
RedzolSBS Genetech Co., Ltd., Beijing, CHNFTR-50
Reverse transcription reagent kitIgene Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, CHNQP057
RIPA Buffer solutionBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNR002
Roswell Park Memorial InstituteGibco Corporation, Gaithersburg, USA11875093
Silicone needleZhongke Life Biotechnology Co., Ltd., Beijing, CHNTFEP-2
siRNAWuhan Genecreate Biological Engineering Co., Ltd. ,Wuhan,CHN
Sirt3 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHN189860
Sodium salicylateShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHNS104176
Sprague-Dawley ratBeijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd., Beijing, CHN110322210102553975
SYBR quantitative PCR kitWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG3320-15
Tomm20 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab186735
Transferring bufferBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0141
TrichloromethaneShanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHN821112
Tris-buffered saline with Tween 20Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG0004
VDAC1 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab15895
XyleneTianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN1330-20-7
β-actin antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab8226

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