JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол, который демонстрирует терапевтическую эффективность отвара Хуачжуоцзеду (HZJD) в облегчении предраковых поражений рака желудка с помощью регуляции митофагии.

Аннотация

Данное исследование направлено на изучение терапевтического эффекта и потенциальных механизмов применения отвара Хуачжуоцзеду (HZJD) для облегчения предраковых поражений рака желудка (PLGC) как in vivo , так и in vitro. HZJD — это традиционная китайская травяная формула, состоящая из 11 трав. Крысы Спрага-Доули (SD) были случайным образом разделены на четыре подгруппы: контрольная группа, модельная группа, группа положительных препаратов и группа HZJD. После 10 недель лечения HZJD проводили окрашивание гематоксилин-эозином (H&E), окрашивание с высоким содержанием железа, окрашивание с высоким содержанием железа, периодическую кислоту Шиффа (AB-PAS), иммуногистохимию, иммунофлуоресценцию, ОТ-кПЦР и вестерн-блоттинг. Для выявления пролиферации клеток in vitro использовали набор для подсчета клеток-8 (CCK-8) и 5-этинил-2'-дезоксиуридин (EdU). Для оценки уровня митофагии проводили ОТ-кПЦР и вестерн-блоттинг. Результаты показали, что HZJD может замедлить патологическое прогрессирование у крыс PLGC и снизить пролиферацию клеток PLGC. Лечение HZJD значительно повысило уровни экспрессии мРНК и белка Sirt3, Foxo3a, Parkin и LC3 II/I, в то время как уровни экспрессии мРНК и белка p62 и Tomm20 значительно увеличили. Было обнаружено, что HZJD обладает способностью обращать вспять снижение активности митофагии как in vivo , так и in vitro. В заключение следует отметить, что в исследовании оценивалось влияние HZJD и были представлены данные о его потенциальном молекулярном механизме.

Введение

Рак желудка (РЖ) остается одним из самых распространенных злокачественных заболеваний, поражающих пищеварительную систему во всем мире. По оценкам, на долю ГК приходится примерно 6% всех случаев рака во всем мире, занимая5-е место среди наиболее часто диагностируемых видов рака и3-е место среди смертей, связанных с раком. ГК широко признана как прогрессивный, многоступенчатый биологический процесс. До начала ГК слизистая оболочка желудка часто в течение нескольких лет подвергается предраковым поражениям, называемым предраковыми поражениями стадии рака желудка (PLGC). Теория каскада Корреа широко принята и дает объяснение последовательному прогрессированию от нормальной слизистой оболочки к хроническому неатрофическому гастриту, атрофическому гастриту, кишечной метаплазии (ИМ), дисплазии (Дис) и, в конечном итоге, к карциноме2. PLGC представляет собой важнейший этап в развитии ГК, и своевременное вмешательство и мониторинг PLGC имеют жизненно важное значение для ранней профилактики ГК.

Недавние клинические оценки и экспериментальные исследования подтвердили, что традиционная китайская медицина (ТКМ) становится одним из наиболее эффективных методов лечения PLGC 3,4. Отвар HZJD — это формула ТКМ, разработанная на основе клинического опыта и основанная на теории ТКМ по удалению тепла и влаги. Предыдущие исследования продемонстрировали благотворное влияние отвара HZJD в лечении PLGC, в частности в облегчении клинических симптомов и патологических проявлений 5,6. В ходе исследований, связанных с сетевой фармакологией, мы определили активные компоненты отвара HZJD, а также их потенциальные мишени для PLGC7. Результаты предыдущего исследования показали, что отвар HZJD обладает способностью увеличивать разнообразие, оптимизировать структуру сообщества и увеличивать относительную численность кишечной флоры у крыс PLGC8. Кроме того, было подтверждено, что отвар HZJD может улучшать PLGC за счет регуляции кишечной микробиоты и ее метаболитов9. В недавней работе мы продемонстрировали, что отвар HZJD может регулировать динамический баланс пролиферации и апоптоза клеток PLGC за счет подавления экспрессии lnc 51736810.

Все большее число исследований подтверждают, что митофагия играет важную роль в развитии различных видов рака. Митофагия избирательно устраняет поврежденные и деполяризованные митохондрии и дополнительно предотвращает чрезмерное накопление цитотоксических активных форм кислорода (АФК) из дисфункциональной митохондрии, что, в свою очередь, ингибирует онкогенез11. Митофагия, избирательная деградация поврежденных или дисфункциональных митохондрий, неразрывно связана с митохондриальным окислительным фосфорилированием (OXPHOS). Нарушение или отсутствие митофагии может привести к сдвигу клеточного энергетического метаболизма в сторону аэробного гликолиза, феномену, широко известному как эффект Варбурга. Повышенная продукция лактатных и кетоновых тел, возникающая в результате эффекта Варбурга, способствует созданию опухолевого микроокружения, способствующего пролиферации клеток.

В этом исследовании представлен комплексный протокол использования отвара HZJD в качестве терапевтического подхода для смягчения прогрессирования PLGC. В ходе нашей оценки мы наблюдали значительный положительный эффект отвара HZJD, в частности, в его способности регулировать миофагию. Исследование дает ценную информацию о потенциальных молекулярных механизмах отвара HZJD при лечении PLGC.

протокол

Все экспериментальные процедуры и уход за животными были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Хэбэйского университета традиционной китайской медицины (номер одобрения: DWLL2019031) и выполнялись в соответствии с этическими принципами. В общей сложности 90 специфических самцов крыс породы Спрэг-Доули (SD) без патогенов (возраст = 6 недель; вес = 150-180 г; см. таблицу материалов) выращивали при постоянной температуре (24 °C ± 4 °C) и влажности (50%-60%) в контролируемом темне/световом цикле в течение 12 часов. Крыс акклиматизировали к новой среде в течение 1 недели до начала экспериментов.

1. Подготовка к эксперименту на животных

  1. Крысиная модель ПЛСК
    1. Случайным образом распределите крыс по контрольной группе (n=20) и модельной группе PLGC (n=70). Снабжайте крыс в контрольной группе стандартной гранулированной диетой для грызунов и водой в неограниченном количестве. Кормить крыс модельной группы PLGC нерегулярным рационом (1 день голодания, 1 день кормления).
    2. Размещайте крыс группами по пять человек в клетке. Обеспечьте контрольную группу 150 г/сутки корма на клетку. Обеспечьте модельной группе PLGC свободный доступ к пище в течение 23 ч (150 г/день/на клетку). Через 23 ч уберите остатки корма.
    3. Обеспечить крыс модельной группы PLGC раствором 1-метил-3-нитро-1-нитрозогуанидина (МННГ) (200 мкг/мл) для свободного питья10,13. Обеспечьте крыс в модельной группе PLGC 200 мл раствора MNNG на клетку. Поместите раствор МННГ в непрозрачные бутылки для питья и заменяйте ежедневно.
    4. Зондирование крыс в модельной группе PLGC 2% салицилатом натрия после 24 ч голодания (1 раз в 2 дня зондированием). Для зондирования используйте силиконовую иглу (см. Таблицу материалов) с минимальной глубиной иглы, равной 6 см. Выполняйте зондирование последовательно в одно и то же время утром с 8:30 до 9:30 утра.
    5. Случайным образом выбрать двух крыс из модельной группы PLGC для патологического обследования на 12, 16, 20 и 24 неделях с целью оценки становления модели PLGC. Считайте, что модель успешна, когда у обеих крыс диагностирован PLGC путем патологической оценки, как описано впункте 9.
      1. Этот процесс моделирования длится около 24 недель. Позвольте двум старшим патологоанатомам провести патологоанатомическую оценку независимо друг от друга. Определите патологический диагноз PLGC у крыс с помощью совместной оценки двух патологоанатомов. Примите во внимание их диагностические заключения и используйте предыдущие рекомендации в качестве ориентира в процессе оценки 14,15,16,17.
  2. Приготовление отвара HZJD
    1. Приготовьте отвар HZJD по методу, описанному впункте 7.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Травы в отваре HZJD были приобретены и аутентифицированы больницей традиционной китайской медицины провинции Хэбэй.
  3. Группировка и лекарственная интервенция
    1. Случайным образом разделите модельную группу PLGC на три подгруппы: модельная группа (n=20), группа положительных препаратов (n=20) и группа отвара Хуачжуоцзиеду (HZJD, n=20, табл. 1).
    2. Вводите крысам в группе положительных препаратов 0,7 мг/кг/сут витамина В12 через18 минут. Обработайте крыс в группе HZJD отваром HZJD в дозе 14,81 г/кг/день 8. Крысам в контрольной и модельной группах вводят дистиллированной водой (10 мл/кг). Все четыре группы получают внутрижелудочное введение один раз в день в течение 10 недель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Суточная рекомендуемая доза отвара HZJD для человека составляет 142 г/день 10. С помощью метода расчета площади поверхности тела было установлено, что рекомендуемая дозировка для крыс в 6,25 раз выше, чем для человека. Поэтому суточная дозировка отвара HZJD для крыс составляет 14,81 г/кг. Дозировка корректировалась еженедельно в соответствии с весом крыс. Максимальный объем зонда не превышал 3 мл.
  4. Забор образцов
    1. Принесите в жертву всех крыс после 24 ч голодания (со свободным доступом к воде) на 35 неделе. Обезболить всех крыс изофлураном (5% индукция, 2% для поддержания, скорость потока 1 л/мин).
    2. Побрейте область живота и простерилизуйте кожу этанолом и йодом после подтверждения потери болевой стимуляции. Разрежьте скальпелем кожу живота с мечевидного хряща по средней линии живота.
    3. Тупым путем отделите подкожную клетчатку щипцами и скальпелем до тех пор, пока не обнажится живот. Рассеките желудок по большей кривизне ножницами и сразу же промойте его фосфатно-солевым буфером (PBS).
    4. Разверните ткани желудка на ледяной пластине. Соберите образцы желудка (2 мм x 2 мм) из антрального отдела, тела и меньшей кривизны угловой области. Если на желудке есть какие-либо видимые поражения, соберите и обработайте эти конкретные части в качестве образцов.
    5. Зафиксировать образцы желудка в 4% параформальдегиде в течение 24 ч. Поместите оставшиеся ткани желудка в криопробирки. Заморозьте их в жидком азоте, а затем храните при температуре -80 °C.
    6. Усыпьте крыс путем вдыхания углекислого газа. Поместите туши крыс в герметичные пакеты, а затем положите пакеты в шкаф для хранения туш животных.

2. Патологоанатомическое обследование

  1. Обрежьте и разгладьте неподвижные ткани желудка ножницами. Обезвоживайте ткани градиентным спиртовым рядом, т.е. 75% этанола в течение 30 мин, 85% этанола в течение 30 мин, 95% этанола в течение 30 мин и 2x в безводном этаноле в течение 30 мин каждый. Погрузите салфетки в раствор ксилола/этанола (1:1) на 1 час и 2 раза в 100% ксилол на 30 минут.
  2. Вылейте половину расплавленного воска в форму, а затем быстро поместите пропитанные ткани в форму. Поместите салфетки во вторую половину расплавленного воска. Отметьте заложенную коробку и дайте воску полностью застыть.
  3. С помощью микротома нарезать ломтиками толщиной 4 мкм. Выложите ломтики на горки.
  4. Поместите ломтики 2 раза в 100% ксилол на 10 мин каждый, затем в раствор ксилола/этанола (1:1) на 10 мин, снова 2 раза в безводный этанол на 5 мин, затем в 95% этанол на 5 мин, затем 85% этанол на 5 мин и, наконец, в 70% этанол на 5 мин. Промойте ломтики проточной водой.
  5. Срезы окрашивать гематоксилином в течение 5 мин. Дифференцировать путем погружения в 0,5% соляную кислоту-этанол на 10 с. Окрашиваем ломтики эозином в течение 2 мин.
  6. Промойте ломтики дистиллированной водой. Обезвоживайте ломтики градиентным спиртовым рядом, т.е. 70% этанола в течение 30 с, 80% этанола в течение 30 с, 95% этанола в течение 30 с, безводного этанола в течение 30 с. Пропитайте ломтики 100% ксилолом 2x. Заклейте ломтики нейтральным бальзамитом.
  7. Смешайте раствор HID A и раствор HID B в соотношении 50:3 для приготовления рабочего раствора HID. Окрашивайте ломтики рабочим раствором HID в течение 24 часов.
  8. Промойте под проточной водой, а затем обмажьте ломтики альцианом на 20 минут. Закрасьте ломтики ядерным быстрым красным раствором в течение 10 минут. Обезвожьте и запечатайте ломтики, как описано в шаге 2.6.
  9. Обкрашиваем ломтики альцианом в течение 20 минут. Выдержать ломтики в 1% водном растворе периодической кислоты в течение 5 минут. Обмажьте ломтики Schiff в течение 20 минут.
  10. Инкубируйте предметные стекла с гематоксилином в течение 2 минут, чтобы окрасить ядра. Добавьте раствор кислотной дифференцировки (входит в комплект HID) в течение 5 с. Нанесите раствор синего Скотта на 3 минуты, чтобы окрасить слайды в синий цвет. Обезвожьте и запечатайте ломтики, как описано выше в шаге 2.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс окрашивания должен быть защищен от света. Температура должна поддерживаться ниже 22 °C при использовании 1% водного раствора периодической кислоты. Ломтики должны быть обезвожены и запечатаны, как описано в шаге 2.6.
  11. Рассмотрите окрашенные срезы под оптическим микроскопом при увеличении 10х и 20х.

3. Иммуногистохимия

  1. Используйте срезы, полученные на шаге 2.4. Поместите ломтики в буфер цитрата натрия 0,01 М и нагревайте в течение 10 минут для извлечения антигена.
  2. Добавьте 3% перекись водорода на 30 минут, чтобы погасить эндогенную пероксидазу и биотин. Залейте ломтики козьей сывороткой на 30 минут.
  3. Инкубируйте ломтики с разведенными первичными антителами против sirt3 (1:200), foxo3a (1:100) и паркина (1:200) в течение ночи при 4 °C. Замените первичные антитела на PBS для отрицательного контроля.
  4. Промойте ломтики 3 раза в течение 5 минут за промывку PBS. Инкубируйте срезы с соответствующим вторичным антителом при комнатной температуре в течение 1 ч.
  5. Добавьте 20 мкл 3,3'-диаминобензидина (DAB) в течение 3 мин. Обезвожьте и запечатайте ломтики, как описано выше в шаге 2.6.
  6. Получите изображение всех срезов с 40-кратным увеличением под оптическим микроскопом. Используйте программное обеспечение Image-Pro Plus 6.0 для выполнения количественного анализа изображений.

4. Иммунофлюоресценция

  1. Используйте срезы, полученные на шаге 3.1. Повторите шаг 3.3.
  2. Инкубируйте срезы с разведенными первичными антителами против ЦОГ IV (1:500) и LC3 (1:500) в течение ночи при 4 °C. Промойте ломтики 3 раза в течение 5 минут за промывку PBS.
  3. Инкубируйте ломтики с козьим антикроличьим IgG (1:1000) и козьим антимышиным IgG (1:1000) при комнатной температуре в течение 1,5 часа. Промойте ломтики 3 раза в течение 5 минут за промывку PBS.
  4. Добавьте раствор для окрашивания DAPI и выдерживайте при комнатной температуре в течение 10 минут в темноте. Промойте ломтики 3 раза в течение 5 минут за промывку PBS.
  5. Добавьте раствор для окрашивания DAPI по каплям и выдерживайте при комнатной температуре в течение 10 минут в темноте. Закрепите срезы с помощью флуоресцентной монтажной среды, препятствующей выцветанию.
  6. Визуализируйте и сфотографируйте срезы под флуоресцентным микроскопом (см. Таблицу материалов) при 40-кратном увеличении.

5. Вестерн-блоттинг

  1. Весить 100 мг тканей желудка точно. Добавьте 1 мл буферного раствора RIPA (см. Таблицу материалов). Тщательно измельчите салфетки с помощью гомогенизатора (10 000 x g, 15 с каждый раз для 3x).
  2. Поместите гомогенированную ткань на лед на 30 минут. Центрифугируйте при 12 000 x g в течение 20 минут при 4 °C, а затем соберите надосадочную жидкость.
  3. Количественное определение концентрации белка с помощью набора для определения концентрации белка бицинхониловой кислоты (BCA) (см. Таблицу материалов). Отрегулируйте концентрацию белка полученной надосадочной жидкости так, чтобы она была постоянной в пределах образцов.
  4. Приготовьте гель SDS-PAGE, состоящий из 10% разделительного геля и 5% укладывающего геля. Налейте 10% разделительный гель в стеклянную пластину на 2/3 от общей высоты. Добавляйте деионизированную воду поверх геля, пока гель не застынет. Налейте 5% стекирующий гель, чтобы заполнить стеклянную тарелку. Вставьте гребень для электрофореза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует следить за тем, чтобы в геле не было пузырьков.
  5. Смешайте надосадочную жидкость с 5-кратным буфером загрузки в соотношении 1:4. Опустите его в кипящую воду на 5 минут для денатурации. Храните при температуре -20 °C.
  6. Соберите подготовленный гель SDS-PAGE в системе электрофореза Вестерн-блоттинг. Добавьте свежий раствор электрофореза (см. Таблицу материалов). Загрузите в гель 20 мкл образца из каждой лунки. Запустите электрофорез при напряжении 80 В в течение 40 минут, а затем переключитесь на напряжение 120 В.
  7. Соберите гель и создайте бутерброд для переноса следующим образом: два слоя губчатой прокладки, два слоя фильтровальной бумаги, гель, мембрана из поливинилиденфторида (PVDF) (см. Таблицу материалов), два слоя фильтровальной бумаги, два слоя губчатой прокладки (от отрицательного полюса к положительному полюсу). Добавьте предварительно охлажденный буфер для переноса. Выполняйте влажный перенос при давлении 350 мА в течение 2 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед сборкой переносного сэндвича мембрана из ПВДФ должна быть предварительно обработана метанолом. Кроме того, губка, фильтровальная бумага и предварительно обработанная мембрана из ПВДФ должны быть предварительно погружены в буфер для переноса (см. Таблицу материалов).
  8. Заблокируйте мембрану 5% обезжиренным молоком в трис-буферном физрастворе с tween 20 (TBST) в течение 2 часов на шейкере. Инкубировать мембрану в течение ночи при 4 °C со следующими разведенными первичными антителами (Sirt3 = 1:500, Foxo3a = 1:1000, Parkin = 1:2000, P62 = 1:1000, LC3 = 1:1000, Tomm20 = 1:2000, β-актин = 1:5000, GAPDH = 1:5000).
    ПРИМЕЧАНИЕ: GAPDH был выбран в качестве эталона для обнаружения паркина из-за того, что молекулярная масса паркина (50 кДа) близка к молекулярной массе β-актина (42 кДа).
  9. Промойте мембрану 4 раза с TBST в течение 5 минут каждый раз. Инкубируйте его с разведенным вторичным антителом (1:5000) при комнатной температуре в течение 1 ч.
  10. Капните рабочий раствор ECL на белковую сторону мембран на 2 мин. Получение изображений с помощью системы хемилюминесцентной визуализации. Используйте программное обеспечение ImageJ для измерения значений оттенков серого.

6. Количественный анализ ПЦР в реальном времени

  1. Очистите все экспериментальные устройства 0,1% диэтилпирокарбонатом (ДЭПК), а затем заранее простерилизуйте их при высокой температуре и высоком давлении.
  2. Весить 50 мг тканей желудочного сока. Добавьте 1 мл Редзола (см. Таблицу материалов) и измельчите в гомогенизаторе. Перенесите гомогенат тканей в центрифужную пробирку без РНКазы и дайте ей постоять при комнатной температуре в течение 10 минут.
  3. Добавьте 0,2 мл трихлорметана и тщательно перемешайте. Дайте постоять при комнатной температуре 3 минуты. Центрифуга при 4 °C и 12 000 x g в течение 15 минут.
  4. Осторожно удалите верхнюю водную фазу и смешайте ее с 0,5 мл изопропанола в течение 10 минут. Центрифугируйте 12 000 x g в течение 10 минут при 4 °C для осаждения РНК. Выбросьте надосадочную жидкость, а затем промойте РНК-осадок 3 раза с 75% этанолом.
  5. Центрифуга при 7 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, а затем высадите сухую РНК в стерильном верстаке в течение 10 минут. Растворите осадок в 50 μл DEPC.
  6. Выполните обратную транскрибацию 1 мкг РНК в кДНК. Добавьте 1 мкл смеси 20x RTase, 4 мкл 5x RT реакционного буфера (см. Таблицу материалов) и доведите DEPC до общего объема 20 мкл. Установите процедуру реакции следующим образом: 10 мин при 25 °C, 40 мин при 42 °C, 10 мин при 85 °C, а затем подержать при 4 °C.
  7. Приготовьте реакционную смесь амплификации, содержащую 2 мкл кДНК, 2 мкл прямого праймера, 2 мкл обратного праймера (Таблица 2), 10 мкл 2x предварительной смеси SYBR (см. Таблицу материалов) и 4 мкл DEPC. Установите процедуру реакции следующим образом: 95 °C в течение 15 с, 60 °C в течение 10 с и 72 °C в течение 30 с (40 циклов).
  8. Используйте β-актин в качестве эндогенного референта. Получите значения Ct. Рассчитайте относительную экспрессию генов-мишеней с помощью метода 2-ΔΔCt.

7. Подготовка к клеточным экспериментам

  1. Модель ячейки PLGC
    1. Культивировали клетки GES-1 в среде Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 в сочетании с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицином. Культивируют клетки при концентрации 2 x10-5 клеток на лунку в 6-луночном планшете, содержащем 1,5 мл среды RPMI 1640 без сыворотки и антибиотиков при 37 °C с 5%CO2.
    2. Индуцировать клетки GES-1 с помощью MNNG для злокачественной трансформации. Задайте схему моделирования, как описано ниже.
      1. На 0-й день проводят предварительную реанимацию и пассаж клеток GES-1 для поддержания их в логарифмической фазе роста. Инокулируйте клетки GES-1 в логарифмические колбы и культивируйте их в течение ночи.
      2. В день 1 и день 2 замените среду, содержащую MNNG (10 мкМ/л). На 3-й день замените среду, содержащую МННГ, на безнаркотическую.
      3. На 4-й и 6-й день обрабатывайте клетки средой, содержащей MNNG (5 мкМ/л) в течение 24 ч. На 7-й день замените среду, содержащую МННГ, на безнаркотическую. Удалите многочисленные умирающие и отслаивающиеся клетки и продолжите культивирование клеток.
      4. На 8-й и 10-й день обрабатывайте клетки средой, содержащей MNNG (5 мкМ/л) в течение 24 ч. На 11-й день постройте модель ячейки PLGC (MC).
        ПРИМЕЧАНИЕ: В течение периода моделирования следует регулярно наблюдать за состоянием клеток. Если клетки показывают плохое состояние, рекомендуется обрабатывать их МННГ в течение разных временных интервалов, желательно с интервалом в 2 дня. В качестве альтернативы клетки могут быть обработаны низкой дозой МНГ (3 мкМ/л). Критерии патологического диагноза клеток МК могут быть использованы в предыдущих исследованиях для точной оценки состояния клеток 10,19,20,21.
  2. Приготовление препаратосодержащей сыворотки
    1. Кормите 30 крыс SD (самец, 220 г) стандартной гранулированной диетой для грызунов и водой в неограниченном количестве, пока вес всех крыс не превысит 350 г. Случайным образом распределите крыс по группе положительной лекарственно-содержащей сыворотки (n=10), группе HZJD-содержащей сыворотке (n=10) и нормальной группе сыворотки крыс (n=10).
    2. Проводите введение препарата крысам, как описано в шаге 1.3.2. Вводите крысам 2 раза в день в 8:00 и 20:00. Продолжайте медикаментозное вмешательство в течение 7 дней.
    3. Соберите образцы крови в течение 1 часа после последнего введения на 8-й день (8:00 утра). Поместите образцы в пробирки с антикоагулянтами при температуре 4 °C на 1 ч. Центрифугируйте при 3 000 x g в течение 15 минут при 4 °C, а затем соберите надосадочную жидкость.
  3. Группировка и интервенционные методы клеточных экспериментов
    1. Разделите клеточные эксперименты следующим образом: группа GES-1 (GES-1), группа MC (MC), группа положительного препарата (положительный препарат), группа отвара HZJD (HZJD), группа сайленсинга Sirt3 (si-Sirt3), группа отрицательного контроля (si-NC) и сайленсинг Sirt3 в сочетании с группой отвара HZJD (si-Sirt3+HZJD).
    2. Клетки в группе положительного препарата и группе HZJD обрабатывают 10% сывороткой, содержащей витамин B12, и 10% сывороткой, содержащей HZJD, соответственно. В других группах вводите 10% нормальной сыворотки крыс.
      Примечание: На основании предыдущих исследований для лечения клеток была выбрана10-10% лекарственно-содержащая сыворотка.
    3. Проведите трансфекцию Si-РНК Sirt3 (см. Таблицу материалов) для клеток группы si-Sirt3 и группы si-Sirt3+HZJD. Настройте отрицательную контрольную группу, получающую пустой вектор, а именно si-NC.
    4. Растворите 2,5 нМ мощности миРНК в 125 мкл DEPC для приготовления раствора миРНК. Разведите 5 мкл раствора миРНК с 250 мкл минимально незаменимой среды и разведите 5 мкл липофектамина 2000 с 250 мкл минимальной незаменимой среды. Равномерно перемешайте их вместе.
    5. Добавьте смесь в среду RPMI 1640 (1,5 мл/на лунку) в 6-луночный планшет. Инкубировать при 37 °C с 5%CO2. Проведите вестерн-блоттинг для определения уровня экспрессии белка Sirt3 через 48 ч после трансфекции.

8. Анализ CCK-8

  1. Приготовьте клетки в клеточную суспензию, когда клетки покроют 70% дна бутылки. Используйте счетчик клеток для подсчета количества клеток в суспензии. Отрегулируйте концентрацию так, чтобы обеспечить 2 000 клеток на лунку, и каждая лунка содержит 100 мкл среды RPMI 1640. Засейте клетки в 96-луночные планшеты и поддерживайте при температуре 37 °C в инкубаторе с 5%CO2 в течение 24 ч. Установите по 6 повторяющихся скважин для каждой группы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Периферийные лунки 96-луночных планшетов, которые не используются, заполнены 200 μL PBS для уменьшения испарения в течение инкубационного периода.
  2. После культивирования клеток в течение 24 ч замените питательную среду другой питательной средой, содержащей лекарственные средства. Культивируют клетки в течение 48 ч положительной лекарственно-содержащей питательной средой и HZJD-содержащей питательной средой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Питательная среда прозрачна. Наблюдая за дном бутылки с культурой на свету, можно заметить, что клетки соединены в листы. Это явление может свидетельствовать о том, что клетки прилипли к стенке. При наблюдении под микроскопом адгезивные клетки расширяются в челноки на дне флакона, и при встряхивании питательной среды клетки не двигаются. Клетки обычно прилипают к стенке через 24 ч после посева.
  3. Замените лекарственно-содержащую питательную среду свежей питательной средой. Добавьте 10 μL раствора CCK-8 (см. Таблицу материалов) в каждую лунку и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч. Чтобы избежать образования пузырьков воздуха, раствор ССС-8 добавляют наискось на стенку тарелки культуры.
  4. Определение значения наружного диаметра каждой лунки с помощью микропланшетного ридера на длине волны 450 нм.

9. Анализ пролиферации клеток EdU

  1. Засейте клетки в 96-луночные планшеты, как описано в шаге 7.1. Заменяйте питательную среду другой лекарственносодержащей питательной средой на 48 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В ходе предварительных экспериментов было подтверждено, что оптимальное время лечения составляет 48 часов.
  2. Удалите среду и промойте клетки PBS. Добавьте 100 μл питательной среды на лунку. Приготовьте 2x раствор EdU (см. Таблицу материалов, 20 μM). Добавьте 6 мкл стокового раствора EdU в 3 мл питательной среды. Добавьте 100 μл 2x раствора EdU (предварительно нагретый до 37 °C) в лунку и затем инкубируйте в течение 2,5 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стоковый раствор EdU был разбавлен в соотношении 1:500 для получения 2x раствора EdU. Фактический объем 2x раствора EdU составил 2,4 мл для 24 скважин.
  3. Удалите среду, содержащую EdU. Добавьте 200 мкл 4% параформальдегида в лунку при комнатной температуре в течение 15 мин. Удалите параформальдегид. Промойте клетки промывочным раствором (3% бычий сывороточный альбумин [BSA] в PBS) 3 раза по 5 минут каждая.
  4. Удалите раствор для стирки. Добавьте 200 мкл раствора для пермеабилизации (0,3% Triton-X 100 в PBS) на лунку при комнатной температуре в течение 20 мин. Удалите раствор для пермеабилизации. Промойте ячейки промывочным раствором (3% BSA в PBS) 2 раза по 5 минут каждая.
  5. Растворите добавку в 1,3 мл деионизированной воды для полного раствора. Готовят реакционный раствор, содержащий 1,72 мл реакционного буфера, 4 мкл азида 488, 80 мкл CuSO4 и 200 мкл раствора добавки.
  6. Добавьте 50 мкл реакционного раствора на лунку. Образцы инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте. Промойте ячейки промывочным раствором 3 раза по 5 минут каждая.
  7. Удалите раствор для стирки. Добавьте 200 μл 1x раствора Hoechst 33342 и инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 минут в темноте.
  8. Получение изображений с помощью флуоресцентного микроскопа. Используйте программное обеспечение Image-Pro plus 6.0 для выполнения количественного анализа изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальные длины волн возбуждения и излучения Azide 488 составляют 495 нм и 519 нм соответственно. Максимальные длины волн возбуждения и излучения Hoechst 33342 составляют 346 нм и 460 нм соответственно.

10. Обнаружение митофагии в живых клетках

  1. Засейте ячейки по 2 х 10 по4 ячейки в 24-луночный стакан со стеклянным дном. Культивирование ночных клеток средой RPMI 1640 без антибиотиков при 37 °C с 5%CO2.
  2. Приготовьте рабочий раствор красителя мтфагии и рабочий раствор лизокрасителя (см. Таблицу материалов). Разбавьте раствор красителя мтфагии буфером HEPES Hanks' до концентрации 100 нМ/л. Разбавьте раствор лизокрасителя буфером HEPES Hanks' до концентрации 100 мкМ/л.
  3. Удалите питательную среду и промойте клетки буфером HEPES Hanks' 2x. Добавьте 500 мкл рабочего раствора красителя мтфагии (100 нМ/л) и затем инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.
  4. Промойте клетки буфером HEPES Hanks' 2x. Добавьте 500 μL рабочего раствора лизокрасителя (100 μМ/л) и затем инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.
  5. Промойте клетки буфером HEPES Hanks' 2x. Определяют уровень митофагии методом конфокальной флуоресцентной микроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки были визуализированы без какой-либо фиксации до или после окрашивания. Процесс визуализации был проведен как можно быстрее, чтобы свести к минимуму любые потенциальные изменения или изменения в клеточном состоянии.

11. Статистический анализ

  1. Используйте коммерческое программное обеспечение для выполнения статистического анализа. Сравните различия между различными группами с помощью одностороннего ANOVA с последующим тестом на ЛСД. Представьте данные в виде среднего значения ± стандартного отклонения (SD). Установите статистическую значимость как P<0,05.

Результаты

MNNG индуцирует прогрессирование PLGC в животной модели и способствует морфологической трансформации клеток GES-1

При макроскопическом наблюдении слизистая оболочка желудка крыс контрольной группы выглядела равномерно ярко-красной, гладкой и мя?...

Обсуждение

PLGC служит ключевым процессом в прогрессировании от хронического гастрита к ГК. В последние годы было доказано, что ТКМ является многообещающим методом лечения и вмешательства для PLGC24,25. В последние годы ТКМ стала многообещающим подход?...

Раскрытие информации

Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Этот проект был профинансирован Фондом естественных наук провинции Хэбэй в Китае (H2020423207).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidineShanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHNR030453
3,3’-diaminobenzidineBeijing Zhong Shan-Golden Bridge Biological Technology Co., Ltd., Beijing, CHNZLI0919
Alcian blue periodic acid schiff staining reagent kitBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNG1285
Anti-fade fluorescence mounting mediumBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNS2110
Bicinchoninic acid protein concentration determination kitWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG2026-1000T
CCK-8 reagent kitBoster Biological Engineering co., Ltd., Wuhan, CHNAR1160
Confocal fluorescence microscopyLeica Instruments Co., Ltd., Weztlar, GERTCS-SP8SR
COX figure-materials-1036 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab202554
DAPI staining solutionBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNC0065
DEPCWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG3004
EdU cell proliferation kitBeyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, CHNC0071S
Electrophoresis solutionBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0139
EthanolTianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN64-17-5
FBSGibco Corporation, Gaithersburg, USA16000044
Fluorescence microscopeOlympus Corporation, Tokyo, JPNBH2-RFCA
Foxo3a antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHN23683
GAPDH antibodyWuhan Sanying Biology Technology Co., Ltd., Wuhan, CHN10494-1-AP
Gel preparation kitBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0138
GES-1 cellProcell Life Science&Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNCL-0563
Goat-anti-mouse IgGCST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN4409
Goat-anti-rabbit IgGAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab150077
Hematoxylin-eosin staining solutionZhuhai Beso Biotechnology Co., Ltd., Shenzhen, CHNBA4027
High iron diamine/alcian blue staining reagent kitBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNG2070
ImageJNational Institutes of Health, Bethesda, USA
Image-Pro Plus 6.0 softwareMedia Cybernetics Inc., Maryland, USA
IsopropanolTianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN67-63-0
LC3 antibodyCST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN83506
Loading bufferBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0198
Microplate readerRayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd., Shenzhen, CHNRT6100
MicrotomeLeica Instruments Co., Ltd., Weztlar, GERRM2245
Mitophagy kitDojindo Laboratories, Kyushu Island, JPNMD01-10
Neutral balsamWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNWG10004160
Optical microscopeOlympus Corporation, Tokyo, JPNBH2-RFCA
P62 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab91526
ParaformaldehydeBiosharp Life Sciences, Anhui, CHNBL539A
Parkin antibodyCST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN32833
Penicillin–streptomycinGibco Corporation, Gaithersburg, USA15140122
phosphate-buffered salineWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG0002-15
PVDF membraneMillipore Corporation, Michigan, USAIPVH00010
RedzolSBS Genetech Co., Ltd., Beijing, CHNFTR-50
Reverse transcription reagent kitIgene Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, CHNQP057
RIPA Buffer solutionBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNR002
Roswell Park Memorial InstituteGibco Corporation, Gaithersburg, USA11875093
Silicone needleZhongke Life Biotechnology Co., Ltd., Beijing, CHNTFEP-2
siRNAWuhan Genecreate Biological Engineering Co., Ltd. ,Wuhan,CHN
Sirt3 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHN189860
Sodium salicylateShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHNS104176
Sprague-Dawley ratBeijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd., Beijing, CHN110322210102553975
SYBR quantitative PCR kitWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG3320-15
Tomm20 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab186735
Transferring bufferBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0141
TrichloromethaneShanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHN821112
Tris-buffered saline with Tween 20Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG0004
VDAC1 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab15895
XyleneTianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN1330-20-7
β-actin antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab8226

Ссылки

  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  2. He, J., et al. Helicobacter pylori infection induces stem cell-like properties in Correa cascade of gastric cancer. Cancer Letters. 542, 215764 (2022).
  3. Xu, W., Li, B., Xu, M., Yang, T., Hao, X. Traditional Chinese medicine for precancerous lesions of gastric cancer: A review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 146, 112542 (2022).
  4. Yang, L., et al. A Systematic Review of the Mechanisms Underlying Treatment of Gastric Precancerous Lesions by Traditional Chinese Medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, 9154738 (2020).
  5. Ping, Z., Yan, W., Jing, L., Qian, J., Xin, H. The Effect of Huazhuo Jiedu recipe on Epithelial -Mesenchymal-Transition in Chronic Erosive Gastritis Patients with Zhuoduneiyun syndrome. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (6), 154-158 (2019).
  6. Yan, W., Jing, L., Pan, Z. The effect of Huazhuojiedu formula on HGF/c-Met signal pathway in patients with chronic erosive gastritis. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 33 (02), 186-189 (2017).
  7. Hao, X., et al. Integrating Network Pharmacology and Experimental Validation to Investigate the Mechanisms of Huazhuojiedu Decoction to Treat Chronic Atrophic Gastritis. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, 2638362 (2020).
  8. Zhou, P., et al. 16S rRNA sequencing-based evaluation of the protective effects of Hua-Zhuo-Jie-Du on rats with chronic atrophic gastritis. BMC Complementary Medicine and Therapies. 22 (1), 71 (2022).
  9. Zhou, P., et al. Determination of the protective effects of Hua-Zhuo-Jie-Du in chronic atrophic gastritis by regulating intestinal microbiota and metabolites: combination of liquid chromatograph mass spectrometer metabolic profiling and 16S rRNA gene sequencing. Chinese Medicine. 16 (1), 37 (2021).
  10. Hao, X., Zhou, P., Yang, Z., Yang, T., Wang, Y. The therapeutic effect of Huazhuojiedu decoction on precancerous lesions in a gastric cancer model via the regulation of lnc 517368. Journal of Ethnopharmacology. 283, 114635 (2022).
  11. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).
  12. Zhang, C., et al. Parkin, a p53 target gene, mediates the role of p53 in glucose metabolism and the Warburg effect. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16259-16264 (2011).
  13. Cai, T., et al. Protective effects of Weipixiao decoction against MNNG-induced gastric precancerous lesions in rats. Biomedicine & Pharmacotherapy. 120, 109427 (2019).
  14. Shah, S. C., Piazuelo, M. B., Kuipers, E. J., Li, D. AGA Clinical Practice Update on the Diagnosis and Management of Atrophic Gastritis: Expert Review. Gastroenterology. 161 (4), 1325-1332 (2021).
  15. Pimentel-Nunes, P., et al. Management of epithelial precancerous conditions and lesions in the stomach (MAPS II): European Society of Gastrointestinal Endoscopy (ESGE), European Helicobacter and Microbiota Study Group (EHMSG), European Society of Pathology (ESP), and Sociedade Portuguesa de Endoscopia Digestiva (SPED) guideline update 2019. Endoscopy. 51 (4), 365-388 (2019).
  16. Nagtegaal, I. D., et al. The 2019 WHO classification of tumours of the digestive system. Histopathology. 76 (2), 182-188 (2020).
  17. Kushima, R. The updated WHO classification of digestive system tumours-gastric adenocarcinoma and dysplasia. Der Pathologe. 43 (1), 8-15 (2022).
  18. Yang, P., et al. Weipiling decoction alleviates N-methyl-N-nitro-N'-nitrosoguanidine-induced gastric precancerous lesions via NF-κB signalling pathway inhibition. Chinese Medicine. 17 (1), 104 (2022).
  19. Xu, J., et al. Xiao Tan He Wei Decoction reverses MNNG-induced precancerous lesions of gastric carcinoma in vivo and vitro: Regulation of apoptosis through NF-κB pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 108, 95-102 (2018).
  20. Li, S. Study on the mechanism of regulating NF-kB activity and inhibiting the migration of gastric "inflammation-cancer" transformed cells by invigorating spleen, removing blood stasis and detoxifying. Guangzhou University of Chinese Medicine. , 17-19 (2021).
  21. Liu, H. Research Progress of Cell Models of Gastric Cancer Precancerous Lesions. Traditional Chinese Drug Research and Clinical Pharmacology. 27 (4), 592-596 (2016).
  22. Zheng, J., et al. Chronic stress accelerates the process of gastric precancerous lesions in rats. Journal of Cancer. 12 (14), 4121-4133 (2021).
  23. Yu, W., et al. Sirt3 deficiency exacerbates diabetic cardiac dysfunction: Role of Foxo3A-Parkin-mediated mitophagy. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (8), 1973-1983 (2017).
  24. Cao, Y., et al. Efficacy of Banxia Xiexin decoction for chronic atrophic gastritis: A systematic review and meta-analysis. PLoS One. 15 (10), e0241202 (2020).
  25. Yin, J., et al. Weiqi Decoction Attenuated Chronic Atrophic Gastritis with Precancerous Lesion through Regulating Microcirculation Disturbance and HIF-1α Signaling Pathway. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 2651037 (2019).
  26. Zhang, J., Wang, X., Wang, F., Tang, X. Xiangsha Liujunzi Decoction improves gastrointestinal motility in functional dyspepsia with spleen deficiency syndrome by restoring mitochondrial quality control homeostasis. Phytomedicine. 105, 154374 (2022).
  27. Shida, M., et al. Impaired mitophagy activates mtROS/HIF-1α interplay and increases cancer aggressiveness in gastric cancer cells under hypoxia. International Journal of Oncology. 48 (4), 1379-1390 (2016).
  28. Zhou, X. Y., et al. Inhibition of autophagy blocks cathepsins-tBid-mitochondrial apoptotic signaling pathway via stabilization of lysosomal membrane in ischemic astrocytes. Cell Death & Disease. 8 (2), e2618 (2017).
  29. He, R., Peng, J., Yuan, P., Xu, F., Wei, W. Divergent roles of BECN1 in LC3 lipidation and autophagosomal function. Autophagy. 11 (5), 740-747 (2015).
  30. Fernández-Coto, D. L., et al. Quantitative proteomics reveals proteins involved in the progression from non-cancerous lesions to gastric cancer. Journal of Proteomics. 186, 15-27 (2018).
  31. Ding, D., et al. Post-translational modification of Parkin and its research progress in cancer. Cancer Communications. 39 (1), 77 (2019).
  32. Wang, Y., et al. The Role of Mitochondrial Dynamics and Mitophagy in Carcinogenesis, Metastasis and Therapy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 413 (2020).
  33. Gehrke, S., et al. PINK1 and Parkin control localized translation of respiratory chain component mRNAs on mitochondria outer membrane. Cell Metabolism. 21 (1), 95-108 (2015).
  34. Fu, Z. J., et al. HIF-1α-BNIP3-mediated mitophagy in tubular cells protects against renal ischemia/reperfusion injury. Redox Biology. 36, 101671 (2020).
  35. Jia, Q., et al. Hesperidin promotes gastric motility in rats with functional dyspepsia by regulating Drp1-mediated ICC mitophagy. Frontiers in Pharmacology. 13, 945624 (2022).
  36. Chen, Y. The N-alkylamides induces MGMT gene hypomethylation in gastric epithelium cells malignant transformation. Zhejiang University. , 33-35 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Sirt3Foxo3aParkinLC3 II IP62Tomm20

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены