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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, introduciamo un protocollo che dimostra l'efficacia terapeutica del decotto di Huazhuojiedu (HZJD) nell'alleviare le lesioni precancerose del cancro gastrico utilizzando la regolazione della mitofagia.

Abstract

Questa ricerca mira ad esplorare l'effetto terapeutico e i potenziali meccanismi del decotto di Huazhuojiedu (HZJD) per alleviare le lesioni precancerose del cancro gastrico (PLGC) sia in vivo che in vitro. HZJD è una formula erboristica tradizionale cinese composta da 11 erbe. I ratti Sprague-Dawley (SD) sono stati divisi casualmente in quattro sottogruppi: gruppo di controllo, gruppo modello, gruppo di farmaci positivi e gruppo HZJD. La colorazione con ematossilina-eosina (H&E), la colorazione con ferro diammino-blu alciano (HID-AB), la colorazione con acido alciano-periodico di Schiff (AB-PAS), l'immunoistochimica, l'immunofluorescenza, la RT-qPCR e i saggi Western blot sono stati eseguiti dopo 10 settimane di trattamento con HZJD. In vitro, per rilevare la proliferazione cellulare sono stati utilizzati i saggi del kit di conteggio cellulare-8 (CCK-8) e della 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU). Sono stati eseguiti saggi RT-qPCR e Western blot per valutare i livelli di mitofagia. I risultati hanno indicato che l'HZJD potrebbe ritardare la progressione patologica nei ratti PLGC e ridurre la proliferazione delle cellule PLGC. Il trattamento con HZJD ha aumentato significativamente i livelli di mRNA e di espressione proteica di Sirt3, Foxo3a, Parkin e LC3 II/I, diminuendo al contempo i livelli di mRNA e di espressione proteica di p62 e Tomm20. È stato dimostrato che l'HZJD ha la capacità di invertire il declino dell'attività mitofagica sia in vivo che in vitro. In conclusione, lo studio ha valutato l'impatto dell'HZJD e ha fornito prove riguardo al suo potenziale meccanismo molecolare.

Introduzione

Il cancro gastrico (GC) rimane una delle malattie maligne più comuni che colpiscono l'apparato digerente in tutto il mondo. Si stima che la GC rappresenti circa il 6% di tutti i tumori in tutto il mondo, classificandosi al 5° posto tra i tumori più frequentemente diagnosticati e al 3° tra i decessi correlati alcancro1. La GC è ampiamente riconosciuta come un processo biologico progressivo e in più fasi. Prima dell'insorgenza della GC, la mucosa gastrica subisce spesso diversi anni di lesioni precancerose, denominate lesioni precancerose degli stadi del cancro gastrico (PLGC). La teoria della cascata di Correa è ampiamente accettata e fornisce una spiegazione per la progressione sequenziale dalla mucosa normale alla gastrite cronica non atrofica, alla gastrite atrofica, alla metaplasia intestinale (IM), alla displasia (Dys) e infine al carcinoma2. La PLGC rappresenta una fase cruciale nello sviluppo della GC e l'intervento e il monitoraggio tempestivi della PLGC sono vitali per la prevenzione precoce della GC.

Recenti valutazioni cliniche e ricerche sperimentali hanno confermato che la medicina tradizionale cinese (MTC) sta emergendo come una delle terapie più efficaci per il trattamento del PLGC 3,4. Il decotto HZJD è una formula TCM sviluppata sulla base dell'esperienza clinica e radicata nella teoria della MTC per la rimozione del calore e dell'umidità. Studi precedenti hanno dimostrato gli effetti benefici del decotto di HZJD nel trattamento della PLGC, in particolare nell'alleviare i sintomi clinici e le manifestazioni patologiche 5,6. Attraverso studi di farmacologia di rete, abbiamo identificato i componenti attivi del decotto di HZJD e i loro potenziali bersagli per PLGC7. I risultati di uno studio precedente hanno indicato che il decotto di HZJD aveva la capacità di migliorare la diversità, ottimizzare la struttura della comunità e aumentare l'abbondanza relativa della flora intestinale nei ratti PLGC8. Inoltre, è stato verificato che il decotto di HZJD potrebbe migliorare il PLGC regolando il microbiota intestinale e i suoi metaboliti9. In un recente lavoro, abbiamo dimostrato che il decotto di HZJD potrebbe regolare l'equilibrio dinamico della proliferazione cellulare e dell'apoptosi nelle cellule PLGC sottoregolando l'espressione di lnc 51736810.

Un numero crescente di studi ha confermato che la mitofagia svolge un ruolo importante in vari tipi di cancro. La mitofagia elimina selettivamente i mitocondri danneggiati e depolarizzati e previene ulteriormente l'accumulo eccessivo di specie reattive citotossiche dell'ossigeno (ROS) dal mitocondrio disfunzionale, che a sua volta inibisce la tumorigenesi11. La mitofagia, la degradazione selettiva dei mitocondri danneggiati o disfunzionali, è strettamente legata alla fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS). La compromissione o l'assenza di mitofagia può portare a uno spostamento del metabolismo energetico cellulare verso la glicolisi aerobica, un fenomeno comunemente noto come effetto Warburg. L'aumento della produzione di corpi lattato e chetonici, derivante dall'effetto Warburg, contribuisce alla costruzione di un microambiente tumorale che favorisce la proliferazione cellulare12.

Questo studio presenta un protocollo completo per l'utilizzo del decotto HZJD come approccio terapeutico per mitigare la progressione del PLGC. Attraverso la nostra valutazione, abbiamo osservato un significativo effetto positivo del decotto HZJD, in particolare nella sua capacità di regolare la mitofagia. Lo studio fornisce preziose informazioni sui potenziali meccanismi molecolari del decotto di HZJD nel trattamento del PLGC.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali e la cura degli animali sono state approvate dalle linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Hebei (numero di approvazione: DWLL2019031) e sono state eseguite in conformità con le linee guida etiche. Un totale di 90 ratti maschi di Sprague-Dawley (SD) esenti da patogeni specifici (età = 6 settimane; peso = 150-180 g; vedi Tabella dei materiali) sono stati allevati a temperatura costante (24 °C ± 4 °C) e umidità (50%-60%) con ciclo controllato buio/luce di 12 ore. I ratti sono stati acclimatati al nuovo ambiente per 1 settimana prima di iniziare gli esperimenti.

1. Preparazione per l'esperimento sugli animali

  1. Modello di ratto di PLGC
    1. Assegna casualmente i ratti a un gruppo di controllo (n=20) e a un gruppo modello PLGC (n=70). Fornire ai ratti del gruppo di controllo una dieta standard a base di pellet per roditori e acqua ad libitum. Nutrire i ratti nel gruppo modello PLGC con una dieta irregolare (1 giorno di digiuno, 1 giorno di alimentazione).
    2. Ospita i ratti in gruppi di cinque per gabbia. Fornire al gruppo di controllo 150 g/giorno di mangime per gabbia. Consentire al gruppo modello PLGC il libero accesso al cibo per 23 ore (150 g/giorno/per gabbia). Dopo 23 ore, rimuovere il mangime rimanente.
    3. Fornire ai ratti del gruppo modello PLGC una soluzione di 1-metil-3-nitro-1-nitrosoguanidina (MNNG) (200 μg/mL) da bere liberamente10,13. Fornire ai ratti del gruppo modello PLGC 200 ml di soluzione di MNNG per gabbia. Mettere la soluzione MNNG in bebè opache e sostituirla quotidianamente.
    4. Gasare i ratti nel gruppo modello PLGC con salicilato di sodio al 2% dopo 24 ore di digiuno (una volta ogni 2 giorni mediante sonda gastrica). Per il gavage, utilizzare un ago in silicone (vedi Tabella dei materiali) con una profondità minima dell'ago pari a 6 cm. Eseguire la sonda gastrica con costanza alla stessa ora del mattino tra le 8:30 e le 9:30.
    5. Selezionare casualmente due ratti dal gruppo modello PLGC per l'esame patologico alle settimane 12, 16, 20 e 24 al fine di valutare l'istituzione del modello PLGC. Considerare il modello di successo quando a entrambi i ratti viene diagnosticata la PLGC mediante valutazione patologica come descritto in9.
      1. Questo processo di modellazione dura circa 24 settimane. Consentire che la valutazione patologica venga eseguita in modo indipendente da due patologi senior. Determinare la diagnosi patologica di PLGC nei ratti attraverso la valutazione collaborativa di due patologi. Prendere in considerazione le loro opinioni diagnostiche e utilizzare le linee guida precedenti come riferimento durante il processo di valutazione 14,15,16,17.
  2. Preparazione del decotto HZJD
    1. Preparare il decotto HZJD secondo il metodo descritto alpunto 7.
      NOTA: Le erbe nel decotto HZJD sono state acquistate e autenticate dall'Ospedale di Medicina Tradizionale Cinese di Hebei.
  3. Raggruppamento e intervento farmacologico
    1. Dividi casualmente il gruppo modello PLGC in tre sottogruppi: gruppo modello (n=20), gruppo di farmaci positivi (n=20) e gruppo di decotto di Huazhuojiedu (HZJD, n=20, Tabella 1).
    2. Gasare i ratti nel gruppo di farmaci positivi con 0,7 mg/kg/die di vitamina B12 mediante sonda gastrica18. Trattare i ratti del gruppo HZJD con decotto HZJD a 14,81 g/kg/giorno8. Somministrare ai ratti del gruppo di controllo e del gruppo modello con acqua distillata (10 ml/kg). Tutti e quattro i gruppi ricevono la somministrazione intragastrica una volta al giorno per 10 settimane.
      NOTA: La dose giornaliera raccomandata di decotto di HZJD per l'uomo è di 142 g/giorno10. Utilizzando il metodo di calcolo della superficie corporea, si determina che il dosaggio raccomandato per i ratti è 6,25 volte quello dell'uomo. Pertanto, il dosaggio giornaliero del decotto HZJD per i ratti è di 14,81 g/kg. Il dosaggio è stato aggiustato settimanalmente in base al peso dei ratti. Il volume massimo della sonda non ha superato i 3 ml.
  4. Raccolta campioni
    1. Sacrificare tutti i ratti dopo 24 ore di digiuno (con libero accesso all'acqua) alla settimana 35. Anestetizzare tutti i ratti con isoflurano (5% di induzione, 2% per il mantenimento, portata 1L/min).
    2. Radere la zona addominale e sterilizzare la pelle con etanolo e iodio dopo aver confermato la perdita di stimolazione del dolore. Taglia la pelle addominale dalla cartilagine xifoidea lungo la linea mediana dell'addome con un bisturi.
    3. Separare il tessuto sottocutaneo con una pinza e un bisturi fino a esporre lo stomaco. Sezionare lo stomaco lungo la curvatura maggiore con una forbice e sciacquarlo immediatamente con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
    4. Aprire i tessuti dello stomaco su una piastra di ghiaccio. Raccogliere campioni gastrici (2 mm x 2 mm) dall'antro, dal corpo e dalla curvatura minore della regione angolare. Se ci sono lesioni visibili sullo stomaco, raccogliere ed elaborare quelle parti specifiche come campioni.
    5. Fissare i campioni gastrici in paraformaldeide al 4% per 24 ore. Posizionare i tessuti gastrici rimanenti in criotubi. Congelarli in azoto liquido e conservarli a -80 °C.
    6. Eutanasia dei ratti tramite inalazione di anidride carbonica. Metti le carcasse di ratto in sacchetti sigillati e poi metti i sacchetti nell'armadietto per la conservazione delle carcasse di animali.

2. Esame patologico

  1. Tagliare e levigare i tessuti gastrici fissi con le forbici. Disidratare i tessuti con una serie di alcol gradiente, cioè etanolo al 75% per 30 minuti, etanolo all'85% per 30 minuti, etanolo al 95% per 30 minuti e 2 volte in etanolo anidro per 30 minuti ciascuno. Immergere i tessuti in una soluzione di xilene/etanolo (1:1) per 1 ora e 2 volte in xilene al 100% per 30 minuti ciascuno.
  2. Versare metà della cera fusa nello stampo, quindi inserire rapidamente i tessuti permeabilizzati nello stampo. Metti i fazzoletti nell'altra metà della cera fusa. Segna la scatola incorporata e lascia che la cera si solidifichi completamente.
  3. Utilizzare il microtomo per tagliare a fette con uno spessore di 4 μm. Posizionare le fette sui vetrini.
  4. Mettere le fette 2 volte in xilene al 100% per 10 minuti ciascuna, quindi in soluzione di xilene/etanolo (1:1) per 10 minuti, 2 volte di nuovo in etanolo anidro per 5 minuti, quindi in etanolo al 95% per 5 minuti, seguito da etanolo all'85% per 5 minuti e infine in etanolo al 70% per 5 minuti. Sciacquare le fette con acqua corrente.
  5. Colorare le fette con ematossilina per 5 minuti. Differenziare immergendo in acido cloridrico-etanolo allo 0,5% per 10 s. Macchiare le fette con eosina per 2 minuti.
  6. Sciacquare le fette con acqua distillata. Disidratare le fette con una serie di alcol a gradiente, cioè etanolo al 70% per 30 s, etanolo all'80% per 30 s, etanolo al 95% per 30 s, etanolo anidro per 30 s. Permeabilizzare le fette con xilene al 100% 2x. Sigillare le fette con balsamo neutro.
  7. Mescolare la soluzione HID A e la soluzione HID B con un rapporto di 50:3 per preparare la soluzione di lavoro HID. Colorare le fette con la soluzione di lavoro HID per 24 h.
  8. Sciacquare sotto l'acqua corrente e poi macchiare le fette con l'alcian per 20 min. Controcolorare le fette con la soluzione nucleare rossa rapida per 10 minuti. Disidratare e sigillare le fette come descritto al punto 2.6.
  9. Colorare le fette con l'alciano per 20 min. Incubare le fette in una soluzione acquosa all'1% di acido periodico per 5 minuti. Colorare le fette con Schiff per 20 min.
  10. Incubare i vetrini con ematossilina per 2 minuti per colorare i nuclei. Aggiungere la soluzione di differenziazione acida (fornita con il kit HID) per 5 s. Applicare la soluzione blu Scott per 3 minuti per colorare le diapositive di blu. Disidratare e sigillare le fette come descritto sopra al punto 2.6.
    NOTA: Il processo di colorazione deve essere protetto dalla luce. La temperatura deve essere mantenuta al di sotto di 22 °C quando si utilizza una soluzione acquosa all'1% di acido periodico. Le fette devono essere disidratate e sigillate come descritto al punto 2.6.
  11. Esaminare le fette colorate al microscopio ottico con un ingrandimento di 10x e 20x.

3. Immunoistochimica

  1. Utilizzare le fette ottenute al punto 2.4. Mettere le fette in un tampone di citrato di sodio 0,01 M e scaldare per 10 minuti per eseguire il recupero dell'antigene.
  2. Aggiungere il 3% di perossido di idrogeno per 30 minuti per estinguere la perossidasi endogena e la biotina. Bloccare le fette con il siero di capra per 30 minuti.
  3. Incubare le fette con gli anticorpi primari diluiti contro sirt3 (1:200), foxo3a (1:100) e parkina (1:200) per una notte a 4 °C. Sostituire gli anticorpi primari con PBS per il controllo negativo.
  4. Sciacquare le fette 3 volte per 5 minuti per risciacquo con PBS. Incubare le fette con l'anticorpo secondario corrispondente a temperatura ambiente per 1 ora.
  5. Aggiungere 20 μl di 3,3'-diaminobenzidina (DAB) per 3 min. Disidratare e sigillare le fette come descritto sopra al punto 2.6.
  6. Immagine di tutte le fette con un ingrandimento di 40x al microscopio ottico. Utilizzare il software Image-Pro Plus 6.0 per eseguire l'analisi quantitativa delle immagini.

4. Immunofluorescenza

  1. Utilizzare le fette ottenute al punto 3.1. Ripetere il passaggio 3.3.
  2. Incubare le fette con gli anticorpi primari diluiti contro la COX IV (1:500) e la LC3 (1:500) per una notte a 4 °C. Sciacquare le fette 3 volte per 5 minuti per risciacquo con PBS.
  3. Incubare le fette con le IgG anti-coniglio di capra (1:1000) e le IgG anti-topo di capra (1:1000) a temperatura ambiente per 1,5 h. Sciacquare le fette 3 volte per 5 minuti per risciacquo con PBS.
  4. Aggiungere la soluzione colorante DAPI e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti al buio. Sciacquare le fette 3 volte per 5 minuti per risciacquo con PBS.
  5. Aggiungere la soluzione di colorazione DAPI goccia per goccia e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti al buio. Montare le fette con un mezzo di montaggio a fluorescenza anti-sbiadimento.
  6. Visualizzare e fotografare le fette al microscopio a fluorescenza (vedi Tabella dei materiali) con un ingrandimento di 40x.

5. Analisi del Western blot

  1. Pesare con precisione 100 mg di tessuti gastrici. Aggiungere 1 mL di soluzione tampone RIPA (vedere la Tabella dei materiali). Macinare accuratamente i fazzoletti utilizzando un omogeneizzatore (10.000 x g, 15 s ogni volta per 3x).
  2. Mettere l'omogeneizzato di tessuto sul ghiaccio per 30 minuti. Centrifugare a 12.000 x g per 20 minuti a 4 °C, quindi raccogliere il surnatante.
  3. Quantificare la concentrazione proteica utilizzando il kit per la determinazione della concentrazione proteica dell'acido bicinconinnico (BCA) (vedere la Tabella dei materiali). Regolare la concentrazione proteica del surnatante ottenuto in modo che sia coerente all'interno dei campioni.
  4. Preparare il gel SDS-PAGE composto da un gel separatore al 10% e da un gel impilabile al 5%. Versare il gel di separazione al 10% nella lastra di vetro a 2/3 dell'altezza totale. Aggiungere acqua deionizzata sul gel fino a quando il gel non si solidifica. Versare il gel impilabile al 5% per riempire la lastra di vetro. Inserire il pettine per elettroforesi.
    NOTA: Prestare attenzione per assicurarsi che non ci siano bolle nel gel.
  5. Miscelare il surnatante proteico con un tampone di carico 5x in un rapporto di 1:4. Mettetelo in acqua bollente per 5 minuti per denaturarlo. Conservarlo a -20 °C.
  6. Assemblare il gel SDS-PAGE preparato nel sistema di elettroforesi Western blotting. Aggiungere una nuova soluzione per elettroforesi (vedere la Tabella dei materiali). Caricare 20 μl di campione per pozzetto sul gel. Avviare l'elettroforesi a 80 V per 40 minuti e poi passare a 120 V.
  7. Raccogliere il gel e creare un sandwich di trasferimento come segue: due strati di tampone di spugna, due strati di carta da filtro, gel, membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) (vedi Tabella dei materiali), due strati di carta da filtro, due strati di tampone di spugna (dal polo negativo al polo positivo). Aggiungere il buffer di trasferimento pre-raffreddato. Eseguire il trasferimento a umido a 350 mA per 2 ore.
    NOTA: Prima di assemblare il sandwich di trasferimento, la membrana in PVDF deve essere pretrattata con metanolo. Inoltre, la spugna, la carta da filtro e la membrana in PVDF pretrattata devono essere immerse in anticipo nel tampone di trasferimento (vedere la tabella dei materiali).
  8. Bloccare la membrana con latte scremato al 5% in soluzione salina tamponata con tween 20 (TBST) per 2 ore su uno shaker. Incubare la membrana per una notte a 4 °C con i seguenti anticorpi primari diluiti (Sirt3 = 1:500, Foxo3a = 1:1000, Parkin = 1:2000, P62 = 1:1000, LC3 = 1:1000, Tomm20 = 1:2000, β-actina = 1:5000, GAPDH = 1:5000).
    NOTA: GAPDH è stato scelto come riferimento per la rilevazione di Parkin a causa del peso molecolare di Parkin (50 kDa) vicino a quello della β-actina (42 kDa).
  9. Lavare la membrana 4 volte con TBST per 5 minuti ogni volta. Incubarlo con l'anticorpo secondario diluito (1:5000) a temperatura ambiente per 1 ora.
  10. Far cadere la soluzione di lavoro ECL sul lato proteico delle membrane per 2 minuti. Acquisire le immagini attraverso il sistema di imaging a chemiluminescenza. Utilizzare il software ImageJ per misurare i valori della scala di grigi.

6. Analisi quantitativa della PCR in tempo reale

  1. Pulire tutti i dispositivi sperimentali con pirocarbonato di dietil (DEPC) allo 0,1%, quindi sterilizzarli in anticipo ad alta temperatura e alta pressione.
  2. Pesare 50 mg di tessuti gastrici. Aggiungere 1 mL di Redzol (vedi Tabella dei materiali) e macinare in un omogeneizzatore. Trasferire l'omogeneizzato di tessuto in una provetta da centrifuga priva di RNasi e lasciarla riposare a temperatura ambiente per 10 minuti.
  3. Aggiungere 0,2 ml di triclorometano e mescolare accuratamente. Lasciate riposare a temperatura ambiente per 3 min. Centrifugare a 4 °C e 12.000 x g per 15 min.
  4. Rimuovere con cura la fase acquosa superiore e mescolarla con 0,5 mL di isopropanolo per 10 minuti. Centrifugare 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C per precipitare l'RNA. Scartare il surnatante e quindi lavare il precipitato di RNA 3 volte con etanolo al 75%.
  5. Centrifugare a 7.500 x g per 5 min a 4 °C. Scartare il surnatante e quindi essiccare il precipitato di RNA in un banco da lavoro sterile per 10 minuti. Sciogliere il precipitato in 50 μl di DEPC.
  6. Trascrivere inversamente 1 μg di RNA in cDNA. Aggiungere 1 μl di miscela di RTasi 20x, 4 μl di tampone di reazione RT 5x (vedere la tabella dei materiali) e reintegrare il DEPC fino a un volume totale di 20 μl. Impostare la procedura di reazione come segue: 10 min a 25 °C, 40 min a 42 °C, 10 min a 85 °C, quindi mantenere a 4 °C.
  7. Preparare una miscela di reazione di amplificazione contenente 2 μl di cDNA, 2 μl di primer diretto, 2 μl di primer inverso (Tabella 2), 10 μl di premiscela SYBR 2x (vedere Tabella dei materiali) e 4 μl di DEPC. Impostare la procedura di reazione come segue: 95 °C per 15 s, 60 °C per 10 s e 72 °C per 30 s (40 cicli).
  8. Utilizzare la β-actina come riferimento endogeno. Ottenere i valori Ct. Calcola l'espressione relativa dei geni bersaglio utilizzando il metodo 2-ΔΔCt.

7. Preparazione per esperimenti cellulari

  1. Modello cellulare di PLGC
    1. Coltura delle cellule GES-1 nel terreno 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) combinato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina. Coltura delle cellule a 2 x 105 cellule per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti contenente 1,5 mL di terreno RPMI 1640 senza siero e antibiotici a 37 °C con CO2 al 5%.
    2. Indurre le cellule GES-1 con MNNG per la trasformazione maligna. Impostare la disposizione di modellazione come descritto di seguito.
      1. Il giorno 0, pre-rianimare e far passare le cellule GES-1 per mantenerle nella fase di crescita logaritmica. Inoculare le cellule GES-1 in fase logaritmica in fiasche di coltura e colturarle durante la notte.
      2. Il giorno 1 e il giorno 2, sostituire il terreno contenente MNNG (10 μM/L). Il giorno 3, sostituire il terreno contenente MNNG con un terreno privo di farmaci.
      3. Il giorno 4 e il giorno 6, trattare le cellule con terreno contenente MNNG (5 μM/L) per 24 ore. Il giorno 7, sostituire il terreno contenente MNNG con un terreno privo di farmaci. Rimuovere le numerose cellule morenti e che si liberano e continuare la coltura cellulare.
      4. Il giorno 8 e il giorno 10, trattare le cellule con il terreno contenente MNNG (5 μM/L) per 24 ore. L'11° giorno, costruisci il modello cellulare di PLGC (MC).
        NOTA: Durante il periodo di modellazione, lo stato delle cellule deve essere osservato regolarmente. Se le cellule mostrano uno stato scadente, si raccomanda di trattarle con MNNG per diversi intervalli di tempo, preferibilmente con un intervallo di 2 giorni. In alternativa, le cellule possono essere trattate con una bassa dose di MNNG (3 μM/L). I criteri di diagnosi patologica delle cellule MC possono essere citati da ricerche precedenti per valutare accuratamente lo stato delle cellule 10,19,20,21.
  2. Preparazione del siero contenente farmaci
    1. Nutrire 30 ratti SD (maschio, 220 g) con una dieta standard a base di roditori in pellet e acqua ad libitum fino a quando tutti i ratti pesano più di 350 g. Assegna i ratti in modo casuale al gruppo di siero contenente farmaco positivo (n=10), al gruppo di siero contenente HZJD (n=10) e al gruppo di siero di ratto normale (n=10).
    2. Eseguire la somministrazione del farmaco nei ratti come descritto al punto 1.3.2. Somministrare ai ratti 2 volte al giorno alle 8:00 e alle 20:00. Continuare l'intervento farmacologico per 7 giorni.
    3. Raccogliere i campioni di sangue entro 1 ora dall'ultima somministrazione del giorno 8 (8:00). Porre i campioni in provette anticoagulanti a 4 °C per 1 ora. Centrifugare a 3.000 x g per 15 minuti a 4 °C e quindi raccogliere il surnatante.
  3. Raggruppamento e metodi di intervento degli esperimenti cellulari
    1. Dividi gli esperimenti cellulari come segue: gruppo GES-1 (GES-1), gruppo MC (MC), gruppo di farmaci positivi (farmaco positivo), gruppo di decotto HZJD (HZJD), gruppo di silenziamento Sirt3 (si-Sirt3), gruppo di controllo negativo (si-NC) e silenziamento Sirt3 combinato con gruppo di decotto HZJD (si-Sirt3+HZJD).
    2. Trattare le cellule del gruppo farmacologico positivo e del gruppo HZJD rispettivamente con il 10% di siero contenente vitamina B12 e il 10% di siero contenente HZJD. Somministrare ad altri gruppi il 10% di siero di ratto normale.
      NOTA: Sulla base di ricerche precedenti10, il 10% di siero contenente farmaco è stato selezionato per il trattamento cellulare.
    3. Eseguire la trasfezione Sirt3 si-RNA (vedi Tabella dei materiali) per le cellule del gruppo si-Sirt3 e del gruppo si-Sirt3+HZJD. Impostare un gruppo di controllo negativo che riceve un vettore vuoto, vale a dire si-NC.
    4. Sciogliere 2,5 nM di potenza di siRNA in 125 μL di DEPC per preparare la soluzione di siRNA. Diluire 5 μL di soluzione di siRNA con 250 μL di terreno essenziale minimo e diluire 5 μL di lipofectamina 2000 con 250 μL di terreno essenziale minimo. Mescolali insieme in modo uniforme.
    5. Aggiungere la miscela al terreno RPMI 1640 (1,5 mL/per pozzetto) in una piastra a 6 pozzetti. Incubare a 37 °C con CO2 al 5%. Eseguire l'analisi Western blot per rilevare il livello di espressione proteica di Sirt3 a 48 ore dopo la trasfezione.

8. Saggio CCK-8

  1. Preparare le cellule in sospensione cellulare quando le cellule coprono il 70% del fondo del flacone. Utilizzare il contatore di celle per contare il numero di celle nella sospensione. Regolare la concentrazione per garantire 2.000 cellule/pozzetto e ogni pozzetto contiene 100 μl di terreno RPMI 1640. Seminare le cellule in piastre a 96 pozzetti e mantenerle a 37 °C in un incubatore con CO2 al 5% per 24 ore. Impostare 6 pozzetti di replica per ogni gruppo.
    NOTA: I pozzetti periferici delle piastre da 96 pozzetti che non vengono utilizzati vengono riempiti con 200 μl di PBS per ridurre l'evaporazione durante il periodo di incubazione.
  2. Dopo aver coltivato le cellule per 24 ore, sostituire il terreno di coltura con un diverso terreno di coltura contenente farmaco. Coltura delle cellule per 48 ore con terreno di coltura positivo contenente farmaco e terreno di coltura contenente HZJD.
    NOTA: Il terreno di coltura è trasparente. Osservando il fondo della bottiglia di coltura con la luce, si può vedere che le cellule sono collegate in fogli. Questo fenomeno può dimostrare che le cellule hanno aderito alla parete. Se osservate al microscopio, le cellule aderenti si estendono in navette sul fondo della bottiglia e quando si agita il terreno di coltura, le cellule non si muovono. Le cellule di solito aderiscono alla parete dopo 24 ore di coltura.
  3. Sostituire il terreno di coltura contenente il farmaco con un terreno di coltura fresco. Aggiungere 10 μL di soluzione di CCK-8 (vedi Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto e incubare a 37 °C per 1 ora. Per evitare la formazione di bolle d'aria, aggiungere la soluzione CCK-8 obliquamente alla parete della piastra di coltura.
  4. Rileva il valore OD di ciascun pozzetto utilizzando un lettore di micropiastre a una lunghezza d'onda di 450 nm.

9. Saggio di proliferazione cellulare EdU

  1. Seminare le cellule in piastre a 96 pozzetti come descritto al punto 7.1. Sostituire il terreno di coltura con un altro terreno di coltura contenente farmaco per 48 ore.
    NOTA: Il tempo di trattamento ottimale è stato confermato essere di 48 ore attraverso esperimenti preliminari.
  2. Rimuovere il terreno e lavare le celle con PBS. Aggiungere 100 μl di terreno di coltura per pozzetto. Preparare la soluzione 2x EdU (vedi Tabella dei materiali, 20 μM). Aggiungere 6 μL della soluzione madre EdU a 3 mL di terreno di coltura. Aggiungere 100 μl della soluzione 2x EdU (37 °C preriscaldata) per pozzetto e quindi incubare per 2,5 ore.
    NOTA: La soluzione madre di EdU è stata diluita in un rapporto di 1:500 per ottenere la soluzione di EdU 2x. Il volume effettivo della soluzione 2x EdU era di 2,4 mL per 24 pozzetti.
  3. Rimuovere il mezzo contenente EdU. Aggiungere 200 μl di paraformaldeide al 4% per pozzetto a temperatura ambiente per 15 minuti. Rimuovere la paraformaldeide. Sciacquare le cellule con una soluzione di lavaggio (albumina sierica bovina al 3% [BSA] in PBS) 3 volte per 5 minuti ciascuna.
  4. Rimuovere la soluzione di lavaggio. Aggiungere 200 μL di soluzione di permeabilizzazione (0,3% Triton-X 100 in PBS) per pozzetto a temperatura ambiente per 20 minuti. Rimuovere la soluzione di permeabilizzazione. Sciacquare le celle con soluzione di lavaggio (3% BSA in PBS) 2 volte per 5 minuti ciascuna.
  5. Sciogliere l'additivo con 1,3 ml di acqua deionizzata per completare la soluzione. Preparare la soluzione di reazione contenente 1,72 mL di tampone di reazione, 4 μL di azide 488, 80 μL di CuSO4 e 200 μL di soluzione additiva.
  6. Aggiungere 50 μl di soluzione di reazione per pozzetto. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. Sciacquare le celle con soluzione di lavaggio 3 volte per 5 minuti ciascuna.
  7. Rimuovere la soluzione di lavaggio. Aggiungere 200 μl di 1x soluzione Hoechst 33342 e incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti al buio.
  8. Acquisizione di immagini utilizzando il microscopio a fluorescenza. Utilizzare il software Image-Pro plus 6.0 per eseguire l'analisi quantitativa delle immagini.
    NOTA: Le lunghezze d'onda massime di eccitazione ed emissione di Azide 488 sono rispettivamente di 495 nm e 519 nm. Le lunghezze d'onda massime di eccitazione ed emissione di Hoechst 33342 sono rispettivamente di 346 nm e 460 nm.

10. Rilevamento della mitofagia nelle cellule viventi

  1. Seminare le cellule a 2 x 104 celle per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti con fondo di vetro. Coltura notturna di cellule con terreno RPMI 1640 senza antibiotici a 37 °C con CO2 al 5%.
  2. Preparare la soluzione di lavoro del colorante mtfagia e la soluzione di lavoro del colorante lyso (vedere la tabella dei materiali). Diluire la soluzione di colorante mtfagia con il tampone HEPES di Hanks a una concentrazione di 100 nM/L. Diluire la soluzione di colorante lyso con il tampone HEPES di Hanks a una concentrazione di 100 μM/L.
  3. Rimuovere il terreno di coltura e sciacquare le cellule con il tampone HEPES di Hanks 2x. Aggiungere 500 μL di soluzione di lavoro del colorante mtfagia (100 nM/L) e incubare a 37 °C per 30 min.
  4. Sciacquare le celle con il tampone HEPES di Hanks 2x. Aggiungere 500 μL di soluzione di lavoro del colorante lyso (100 μM/L) e incubare a 37 °C per 30 min.
  5. Sciacquare le celle con il tampone HEPES di Hanks 2x. Determinare il livello di mitofagia mediante microscopia a fluorescenza confocale.
    NOTA: Le cellule sono state visualizzate senza alcuna fissazione prima o dopo la colorazione. Il processo di imaging è stato condotto il più rapidamente possibile per ridurre al minimo eventuali cambiamenti o alterazioni dello stato cellulare.

11. Analisi statistiche

  1. Utilizzare software commerciali per eseguire analisi statistiche. Confronta le differenze tra i diversi gruppi con l'ANOVA unidirezionale seguita dal test post hoc LSD. Presenta i dati come media ± deviazione standard (SD). Impostare la significatività statistica su P<0,05.

Risultati

MNNG induce la progressione di PLGC nel modello animale e promuove la trasformazione morfologica delle cellule GES-1

Dopo l'osservazione macroscopica, la mucosa gastrica dei ratti nel gruppo di controllo appariva uniformemente rosso vivo, liscia e morbida, con le pieghe della mucosa disposte in uno schema lineare. A differenza dei ratti del gruppo di controllo, la mucosa gastrica dei ratti del gruppo modello mostrava pallore e rugosità e le p...

Discussione

La PLGC funge da processo chiave nella progressione dalla gastrite cronica alla GC. La MTC ha dimostrato di essere un trattamento e un intervento promettenti per la PLGC negli ultimi anni24,25. Negli ultimi anni, la MTC è emersa come un approccio promettente per il trattamento e l'intervento della PLGC. Ciò è coerente con la ricerca precedente10. I risultati dell'esame patologico hanno rivelato che il d...

Divulgazioni

Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Questo progetto è stato finanziato dalla Natural Science Foundation della provincia cinese di Hebei (H2020423207).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidineShanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHNR030453
3,3’-diaminobenzidineBeijing Zhong Shan-Golden Bridge Biological Technology Co., Ltd., Beijing, CHNZLI0919
Alcian blue periodic acid schiff staining reagent kitBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNG1285
Anti-fade fluorescence mounting mediumBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNS2110
Bicinchoninic acid protein concentration determination kitWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG2026-1000T
CCK-8 reagent kitBoster Biological Engineering co., Ltd., Wuhan, CHNAR1160
Confocal fluorescence microscopyLeica Instruments Co., Ltd., Weztlar, GERTCS-SP8SR
COX figure-materials-1036 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab202554
DAPI staining solutionBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNC0065
DEPCWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG3004
EdU cell proliferation kitBeyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, CHNC0071S
Electrophoresis solutionBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0139
EthanolTianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN64-17-5
FBSGibco Corporation, Gaithersburg, USA16000044
Fluorescence microscopeOlympus Corporation, Tokyo, JPNBH2-RFCA
Foxo3a antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHN23683
GAPDH antibodyWuhan Sanying Biology Technology Co., Ltd., Wuhan, CHN10494-1-AP
Gel preparation kitBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0138
GES-1 cellProcell Life Science&Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNCL-0563
Goat-anti-mouse IgGCST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN4409
Goat-anti-rabbit IgGAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab150077
Hematoxylin-eosin staining solutionZhuhai Beso Biotechnology Co., Ltd., Shenzhen, CHNBA4027
High iron diamine/alcian blue staining reagent kitBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNG2070
ImageJNational Institutes of Health, Bethesda, USA
Image-Pro Plus 6.0 softwareMedia Cybernetics Inc., Maryland, USA
IsopropanolTianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN67-63-0
LC3 antibodyCST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN83506
Loading bufferBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0198
Microplate readerRayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd., Shenzhen, CHNRT6100
MicrotomeLeica Instruments Co., Ltd., Weztlar, GERRM2245
Mitophagy kitDojindo Laboratories, Kyushu Island, JPNMD01-10
Neutral balsamWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNWG10004160
Optical microscopeOlympus Corporation, Tokyo, JPNBH2-RFCA
P62 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab91526
ParaformaldehydeBiosharp Life Sciences, Anhui, CHNBL539A
Parkin antibodyCST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN32833
Penicillin–streptomycinGibco Corporation, Gaithersburg, USA15140122
phosphate-buffered salineWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG0002-15
PVDF membraneMillipore Corporation, Michigan, USAIPVH00010
RedzolSBS Genetech Co., Ltd., Beijing, CHNFTR-50
Reverse transcription reagent kitIgene Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, CHNQP057
RIPA Buffer solutionBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNR002
Roswell Park Memorial InstituteGibco Corporation, Gaithersburg, USA11875093
Silicone needleZhongke Life Biotechnology Co., Ltd., Beijing, CHNTFEP-2
siRNAWuhan Genecreate Biological Engineering Co., Ltd. ,Wuhan,CHN
Sirt3 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHN189860
Sodium salicylateShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHNS104176
Sprague-Dawley ratBeijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd., Beijing, CHN110322210102553975
SYBR quantitative PCR kitWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG3320-15
Tomm20 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab186735
Transferring bufferBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0141
TrichloromethaneShanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHN821112
Tris-buffered saline with Tween 20Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG0004
VDAC1 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab15895
XyleneTianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN1330-20-7
β-actin antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab8226

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