JoVE Logo
Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo que demuestra la eficacia terapéutica de la decocción de Huazhuojiedu (HZJD) en el alivio de las lesiones precancerosas del cáncer gástrico mediante la regulación de la mitofagia.

Resumen

Esta investigación tiene como objetivo explorar el efecto terapéutico y los posibles mecanismos de la decocción de Huazhuojiedu (HZJD) para aliviar las lesiones precancerosas del cáncer gástrico (PLGC) tanto in vivo como in vitro. HZJD es una fórmula herbal tradicional china que consta de 11 hierbas. Las ratas Sprague-Dawley (SD) se dividieron aleatoriamente en cuatro subgrupos: grupo control, grupo modelo, grupo positivo para el fármaco y grupo HZJD. Después de 10 semanas de tratamiento con HZJD, se realizaron tinciones con hematoxilina-eosina (H&E), tinción con azul de diamina-alcián (HID-AB), tinción de Schiff con azul alcián y ácido peryódico alcián (AB-PAS), inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, RT-qPCR y Western blot. Para detectar la proliferación celular se utilizaron in vitro el kit de recuento celular 8 (CCK-8) y los ensayos de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU). Se realizaron ensayos de RT-qPCR y Western blot para evaluar los niveles de mitofagia. Los resultados indicaron que la HZJD podría retrasar la progresión patológica en ratas PLGC y reducir la proliferación de células PLGC. El tratamiento con HZJD aumentó significativamente los niveles de expresión de ARNm y proteínas de Sirt3, Foxo3a, Parkin y LC3 II/I, mientras que disminuyó los niveles de expresión de ARNm y proteínas de p62 y Tomm20. Se descubrió que HZJD tiene la capacidad de revertir la disminución de la actividad de la mitofagia tanto in vivo como in vitro. En conclusión, el estudio evaluó el impacto de la HZJD y aportó evidencias sobre su posible mecanismo molecular.

Introducción

El cáncer gástrico (CG) sigue siendo una de las enfermedades malignas más comunes que afectan al sistema digestivo en todo el mundo. Se estima que el CG representa aproximadamente el 6% de todos los cánceres en todo el mundo, ocupando el5º lugar entre los cánceres más frecuentemente diagnosticados y el3º entre las muertes relacionadas con el cáncer1. La GC es ampliamente reconocida como un proceso biológico progresivo de varios pasos. Antes de la aparición de la CG, la mucosa gástrica a menudo experimenta varios años de lesiones precancerosas, denominadas lesiones precancerosas de cáncer gástrico (PLGC). La teoría de la cascada de Correa es ampliamente aceptada y proporciona una explicación para la progresión secuencial de la mucosa normal a la gastritis crónica no atrófica, gastritis atrófica, metaplasia intestinal (MI), displasia (Dys) y, finalmente, carcinoma2. El PLGC representa una etapa crucial en el desarrollo de la CG, y la intervención y el seguimiento oportunos de la PLGC son vitales para la prevención temprana de la misma.

Recientes evaluaciones clínicas e investigaciones experimentales han confirmado que la medicina tradicional china (MTC) está emergiendo como una de las terapias más efectivas para el tratamiento de la PLGC 3,4. La decocción de HZJD es una fórmula de MTC desarrollada sobre la base de la experiencia clínica y basada en la teoría de la MTC de eliminación de calor y humedad. Estudios previos han demostrado los efectos beneficiosos de la decocción de HZJD en el tratamiento de la PLGC, particularmente en el alivio de los síntomas clínicos y las manifestaciones patológicas 5,6. A través de estudios relacionados con la farmacología en red, identificamos los componentes activos de la decocción de HZJD, así como sus posibles objetivos para PLGC7. Los hallazgos de un estudio previo indicaron que la decocción de HZJD tenía la capacidad de mejorar la diversidad, optimizar la estructura de la comunidad y aumentar la abundancia relativa de flora intestinal en ratas PLGC8. Además, se comprobó que la decocción de HZJD podría mejorar el PLGC mediante la regulación de la microbiota intestinal y sus metabolitos9. En un trabajo reciente, demostramos que la decocción de HZJD podría regular el equilibrio dinámico de la proliferación celular y la apoptosis en células PLGC mediante la regulación negativa de la expresión de lnc 51736810.

Cada vez son más los estudios que confirman que la mitofagia desempeña un papel importante en varios tipos de cáncer. La mitofagia elimina selectivamente las mitocondrias dañadas y despolarizadas y previene aún más la acumulación excesiva de especies reactivas de oxígeno (ROS) citotóxicas de la mitocondria disfuncional, que a su vez inhibe la tumorigénesis11. La mitofagia, la degradación selectiva de las mitocondrias dañadas o disfuncionales, está estrechamente relacionada con la fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS). El deterioro o la ausencia de mitofagia puede conducir a un cambio en el metabolismo energético celular hacia la glucólisis aeróbica, un fenómeno comúnmente conocido como el efecto Warburg. El aumento de la producción de lactato y cuerpos cetónicos, resultante del efecto Warburg, contribuye a la construcción de un microambiente tumoral propicio para la proliferación celular12.

Este estudio presenta un protocolo integral para utilizar la decocción de HZJD como enfoque terapéutico para mitigar la progresión de PLGC. A través de nuestra evaluación, observamos un efecto positivo significativo de la decocción de HZJD, particularmente en su capacidad para regular la mitofagia. El estudio proporciona información valiosa sobre los posibles mecanismos moleculares de la decocción de HZJD en el tratamiento de PLGC.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales y el cuidado de los animales fueron aprobados por las Directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Medicina Tradicional China de Hebei (número de aprobación: DWLL2019031) y se realizaron de acuerdo con las directrices éticas. Un total de 90 ratas macho Sprague-Dawley (SD) libres de patógenos específicos (edad = 6 semanas; peso = 150-180 g; ver Tabla de Materiales) fueron criadas a temperatura constante (24 °C ± 4 °C) y humedad (50%-60%) bajo un ciclo de luz/oscuridad controlado de 12 h. Las ratas se aclimataron al nuevo entorno durante 1 semana antes de comenzar los experimentos.

1. Preparación para el experimento con animales

  1. Modelo de rata de PLGC
    1. Asigne aleatoriamente las ratas a un grupo de control (n = 20) y a un grupo modelo PLGC (n = 70). Suministre a las ratas del grupo de control una dieta estándar de pellets para roedores y agua ad libitum. Alimente a las ratas en el grupo modelo PLGC con una dieta irregular (1 día de ayuno, 1 día de alimentación).
    2. Aloja a las ratas en grupos de cinco por jaula. Proporcionar al grupo de control 150 g/día de alimento por jaula. Permitir al grupo modelo PLGC el libre acceso a los alimentos durante 23 h (150 g/día/por jaula). Después de 23 h, retire el alimento restante.
    3. Proporcionar a las ratas del grupo modelo PLGC una solución de 1-metil-3-nitro-1-nitrosoguanidina (MNNG) (200 μg/mL) para beber gratuitamente10,13. Proporcione a las ratas del grupo modelo PLGC 200 ml de solución de MNNG por jaula. Coloque la solución de MNNG en botellas opacas para beber y reemplácelas diariamente.
    4. Sonda nasogástrica a las ratas del grupo modelo PLGC con salicilato de sodio al 2% después de 24 h de ayuno (una vez cada 2 días por sonda nasogástrica). Para la sonda nasogástrica, utilice una aguja de silicona (véase la tabla de materiales) con una profundidad mínima de la aguja igual a 6 cm. Realice el sonda nasogástrica de manera constante a la misma hora por la mañana entre las 8:30 a.m. y las 9:30 a.m.
    5. Seleccionar aleatoriamente dos ratas del grupo del modelo PLGC para el examen anatomopatológico en las semanas 12, 16, 20 y 24 con el fin de evaluar el establecimiento del modelo PLGC. Se considera que el modelo es exitoso cuando ambas ratas son diagnosticadas con PLGC mediante una evaluación patológica como se describe enel punto 9.
      1. Este proceso de modelado dura unas 24 semanas. Permitir que la evaluación patológica sea realizada de forma independiente por dos patólogos senior. Determinar el diagnóstico anatomopatológico de PLGC en ratas a través de la evaluación colaborativa de dos patólogos. Tener en cuenta sus opiniones diagnósticas y utilizar las directrices anteriores como referencia durante el proceso de evaluación 14,15,16,17.
  2. Preparación de la decocción de HZJD
    1. Prepare la decocción de HZJD de acuerdo con el método descrito en7.
      NOTA: Las hierbas en la decocción de HZJD fueron compradas y autenticadas por el Hospital de Medicina Tradicional China de Hebei.
  3. Agrupamiento e intervención farmacológica
    1. Divida aleatoriamente el grupo modelo de PLGC en tres subgrupos: grupo modelo (n = 20), grupo de fármaco positivo (n = 20) y grupo de decocción de Huazhuojiedu (HZJD, n = 20, Tabla 1).
    2. Sonda nasogástrica a las ratas del grupo positivo del fármaco con 0,7 mg/kg/día de vitamina B12 por sonda nasogástrica18. Tratar a las ratas del grupo HZJD con una decocción de HZJD a 14,81 g/kg/día8. Administrar a las ratas del grupo control y del grupo modelo agua destilada (10 mL/kg). Los cuatro grupos reciben la administración intragástrica una vez al día durante 10 semanas.
      NOTA: La dosis diaria recomendada de decocción de HZJD para humanos es de 142 g/día10. Utilizando el método de cálculo de la superficie corporal, se determina que la dosis recomendada para las ratas es 6,25 veces mayor que la de los humanos. Por lo tanto, la dosis diaria de decocción de HZJD para ratas es de 14,81 g/kg. La dosis se ajustó semanalmente de acuerdo con el peso de las ratas. El volumen máximo de sonda nasogástrica no superó los 3 mL.
  4. Recogida de muestras
    1. Sacrificar todas las ratas después de 24 h de ayuno (con libre acceso al agua) en la semana 35. Anestesiar a todas las ratas con isoflurano (5% de inducción, 2% de mantenimiento, caudal de 1L/min).
    2. Afeitar la zona abdominal y esterilizar la piel con etanol y yodo después de confirmar la pérdida de la estimulación del dolor. Corta la piel abdominal del cartílago xifoides a lo largo de la línea media del abdomen con un bisturí.
    3. Separe el tejido subcutáneo con pinzas y un bisturí hasta exponer el estómago. Diseccione el estómago a lo largo de la curvatura mayor con una tijera y enjuáguelo inmediatamente con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    4. Despliega los tejidos del estómago en una placa de hielo. Recoja muestras gástricas (2 mm x 2 mm) del antro, el cuerpo y la curvatura menor de la región angular. Si hay lesiones visibles en el estómago, recoja y procese esas porciones específicas como muestras.
    5. Fijar muestras gástricas en paraformaldehído al 4% durante 24 h. Coloque los tejidos gástricos restantes en criotubos. Congélelos en nitrógeno líquido y luego guárdelos a -80 °C.
    6. Eutanasia a las ratas mediante la inhalación de dióxido de carbono. Coloque los cadáveres de ratas en bolsas selladas y luego coloque las bolsas en el gabinete de almacenamiento de cadáveres de animales.

2. Examen anatomopatológico

  1. Recorta y alisa los tejidos gástricos fijados con unas tijeras. Deshidrate tejidos con una serie de alcohol de gradiente, es decir, etanol al 75% durante 30 minutos, etanol al 85% durante 30 minutos, etanol al 95% durante 30 minutos y 2 veces en etanol anhidro durante 30 minutos cada uno. Sumerja los pañuelos en una solución de xileno/etanol (1:1) durante 1 h y 2 veces en xileno al 100% durante 30 minutos cada uno.
  2. Vierta la mitad de la cera fundida en el molde y luego coloque los tejidos permeabilizados en el molde rápidamente. Coloca los pañuelos en la otra mitad de la cera fundida. Marque la caja incrustada y deje que la cera se solidifique por completo.
  3. Utilice el micrótomo para cortar en rodajas con un grosor de 4 μm. Coloque las rodajas en los portaobjetos.
  4. Coloque las rodajas 2 veces en xileno al 100% durante 10 minutos cada una, luego en una solución de xileno/etanol (1:1) durante 10 minutos, 2 veces nuevamente en etanol anhidro durante 5 minutos, luego en etanol al 95% durante 5 minutos, seguido de etanol al 85% durante 5 minutos y finalmente en etanol al 70% durante 5 minutos. Enjuague las rodajas con agua corriente.
  5. Tiñe las rodajas con hematoxilina durante 5 min. Diferencie sumergiendo en ácido clorhídrico-etanol al 0,5% durante 10 s. Tiñe las rodajas con eosina durante 2 min.
  6. Enjuaga las rodajas con agua destilada. Deshidratar las lonchas con una serie de alcohol de gradiente, es decir, 70% de etanol durante 30 s, 80% de etanol durante 30 s, 95% de etanol durante 30 s, etanol anhidro durante 30 s. Permeabilizar las rodajas con xileno 100% 2x. Sella las rodajas con bálsamo neutro.
  7. Mezcle la solución HID A y la solución HID B en una proporción de 50:3 para preparar la solución de trabajo HID. Teñir las rodajas con la solución de trabajo HID durante 24 h.
  8. Enjuague con agua corriente y luego tiña las rodajas con alcián durante 20 min. Contramanche las rodajas con la solución de rojo rápido nuclear durante 10 min. Deshidrate y selle las rodajas como se describe en el paso 2.6.
  9. Tiñe las rodajas con alcián durante 20 min. Incubar las rodajas en una solución acuosa al 1% de ácido peryódico durante 5 min. Tiñe las rodajas con Schiff durante 20 min.
  10. Incubar los portaobjetos con hematoxilina durante 2 min para teñir los núcleos. Añada la solución de diferenciación ácida (suministrada con el kit HID) durante 5 s. Aplica la solución azul Scott durante 3 minutos para colorear las diapositivas de azul. Deshidrate y selle las rodajas como se describe anteriormente en el paso 2.6.
    NOTA: El proceso de tinción debe protegerse de la luz. La temperatura debe mantenerse por debajo de 22 °C cuando se utiliza una solución acuosa de ácido peryódico al 1%. Las rodajas deben estar deshidratadas y selladas como se describe en el paso 2.6.
  11. Examine las rodajas teñidas bajo un microscopio óptico con aumentos de 10x y 20x.

3. Inmunohistoquímica

  1. Utilice las rodajas obtenidas en el paso 2.4. Coloque las rodajas en un tampón de citrato de sodio de 0,01 M y caliente durante 10 minutos para realizar la recuperación de antígenos.
  2. Añadir un 3% de peróxido de hidrógeno durante 30 minutos para apagar la peroxidasa endógena y la biotina. Bloquea las rodajas con suero de cabra durante 30 min.
  3. Incubar los cortes con los anticuerpos primarios diluidos contra sirt3 (1:200), foxo3a (1:100) y parkin (1:200) durante la noche a 4 °C. Sustituir los anticuerpos primarios por PBS para el control negativo.
  4. Enjuague las rodajas 3 veces durante 5 minutos por enjuague con PBS. Incubar las rodajas con el anticuerpo secundario correspondiente a temperatura ambiente durante 1 h.
  5. Añadir 20 μL de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) durante 3 min. Deshidrate y selle las rodajas como se describe anteriormente en el paso 2.6.
  6. Visualice todos los cortes con un aumento de 40x bajo el microscopio óptico. Utilice el software Image-Pro Plus 6.0 para realizar análisis cuantitativos de imágenes.

4. Inmunofluorescencia

  1. Utilice las lonchas obtenidas en el paso 3.1. Repita el paso 3.3.
  2. Incubar los cortes con los anticuerpos primarios diluidos contra COX IV (1:500) y LC3 (1:500) durante la noche a 4 °C. Enjuague las rodajas 3 veces durante 5 minutos por enjuague con PBS.
  3. Incubar las lonchas con la IgG anti-conejo de cabra (1:1000) y IgG anti-ratón de cabra (1:1000) a temperatura ambiente durante 1,5 h. Enjuague las rodajas 3 veces durante 5 minutos por enjuague con PBS.
  4. Agregue la solución de tinción DAPI e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos en la oscuridad. Enjuague las rodajas 3 veces durante 5 minutos por enjuague con PBS.
  5. Agregue gota a gota la solución de tinción DAPI e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos en la oscuridad. Monte las rodajas con un medio de montaje de fluorescencia antidecoloración.
  6. Visualice y fotografíe las rodajas bajo un microscopio de fluorescencia (consulte la Tabla de materiales) con un aumento de 40x.

5. Análisis de Western blot

  1. Pesar 100 mg de tejidos gástricos con precisión. Agregue 1 mL de solución tampón RIPA (ver Tabla de Materiales). Muele bien los tejidos con un homogeneizador (10.000 x g, 15 s cada vez durante 3 veces).
  2. Colocar el homogeneizado de tejido en hielo durante 30 min. Centrifugar a 12.000 x g durante 20 min a 4 °C y, a continuación, recoger el sobrenadante.
  3. Cuantifique la concentración de proteínas utilizando el kit de determinación de la concentración de proteínas de ácido bicinconínico (BCA) (consulte la tabla de materiales). Ajuste la concentración de proteínas del sobrenadante obtenido para que sea consistente dentro de las muestras.
  4. Prepare el gel SDS-PAGE que consta de un 10% de gel separador y un 5% de gel apilante. Vierta el gel de separación al 10% en la placa de vidrio hasta 2/3 de la altura total. Agregue agua desionizada sobre el gel hasta que el gel se solidifique. Vierta el gel apilante al 5% para llenar la placa de vidrio. Inserte el peine de electroforesis.
    NOTA: Se debe tener cuidado para asegurarse de que no haya burbujas en el gel.
  5. Mezcle el sobrenadante de proteína con un tampón de carga 5x en una proporción de 1:4. Ponlo en agua hirviendo durante 5 minutos para que se desnaturalice. Guárdelo a -20 °C.
  6. Ensamble el gel SDS-PAGE preparado en el sistema de electroforesis Western blot. Agregue una solución de electroforesis nueva (consulte la tabla de materiales). Cargue 20 μL de muestra por pocillo en el gel. Inicie la electroforesis a 80 V durante 40 min y luego cambie a 120 V.
  7. Recoja el gel y cree un sándwich de transferencia de la siguiente manera: dos capas de almohadilla de esponja, dos capas de papel de filtro, gel, membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (consulte la tabla de materiales), dos capas de papel de filtro, dos capas de almohadilla de esponja (desde el polo negativo hasta el polo positivo). Agregue un búfer de transferencia preenfriado. Realice la transferencia húmeda a 350 mA durante 2 h.
    NOTA: Antes de ensamblar el sándwich de transferencia, la membrana de PVDF debe tratarse previamente con metanol. Además, la esponja, el papel de filtro y la membrana de PVDF pretratada deben sumergirse en el tampón de transferencia (consulte la Tabla de materiales) con anticipación.
  8. Bloquee la membrana con leche descremada al 5% en solución salina tamponada con tween 20 (TBST) durante 2 h en un agitador. Incubar la membrana durante la noche a 4 °C con los siguientes anticuerpos primarios diluidos (Sirt3 = 1:500, Foxo3a = 1:1000, Parkin = 1:2000, P62 = 1:1000, LC3 = 1:1000, Tomm20 = 1:2000, β-actina = 1:5000, GAPDH = 1:5000).
    NOTA: Se seleccionó GAPDH como referencia para la detección de parkina debido a que el peso molecular de la parkina (50 kDa) es cercano al de la β-actina (42 kDa).
  9. Lave la membrana 4 veces con TBST durante 5 minutos cada vez. Incubar con el anticuerpo secundario diluido (1:5000) a temperatura ambiente durante 1 h.
  10. Deje caer la solución de trabajo ECL en el lado de la proteína de las membranas durante 2 minutos. Adquiera las imágenes a través del sistema de imágenes de quimioluminiscencia. Utilice el software ImageJ para medir los valores de la escala de grises.

6. Análisis cuantitativo de PCR en tiempo real

  1. Limpie todos los dispositivos experimentales con pirocarbonato de dietilo al 0,1% (DEPC) y luego esterilícelos a alta temperatura y alta presión con anticipación.
  2. Pesar 50 mg de tejidos gástricos. Agregue 1 mL de Redzol (ver Tabla de Materiales) y mola en un homogeneizador. Transfiera el homogeneizado de tejido a un tubo de centrífuga libre de ARNasa y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
  3. Agregue 0,2 mL de triclorometano y mezcle bien. Déjalo reposar a temperatura ambiente durante 3 min. Centrifugar a 4 °C y 12.000 x g durante 15 min.
  4. Retirar la fase acuosa superior con cuidado y mezclarla con 0,5 mL de isopropanol durante 10 min. Centrifugar 12.000 x g durante 10 min a 4 °C para precipitar el ARN. Deseche el sobrenadante y luego lave el precipitado de ARN 3 veces con etanol al 75%.
  5. Centrifugar a 7.500 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y luego seque el precipitado de ARN en un banco de trabajo estéril durante 10 min. Disuelva el precipitado en 50 μL de DEPC.
  6. Transcriba inversamente 1 μg de ARN en ADNc. Añada 1 μL de mezcla RTasa 20x, 4 μL de tampón de reacción RT 5x (consulte la Tabla de materiales) y reponga el DEPC hasta un volumen total de 20 μL. Ajuste el procedimiento de reacción de la siguiente manera: 10 min a 25 °C, 40 min a 42 °C, 10 min a 85 °C y, a continuación, manténgalo a 4 °C.
  7. Prepare la mezcla de reacción de amplificación que contenga 2 μL de ADNc, 2 μL de cebador directo, 2 μL de cebador inverso (Tabla 2), 10 μL de premezcla SYBR 2x (consulte la Tabla de materiales) y 4 μL de DEPC. Ajuste el procedimiento de reacción de la siguiente manera: 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 10 s y 72 °C durante 30 s (40 ciclos).
  8. Utilice la β-actina como referencia endógena. Obtenga los valores de Ct. Calcule la expresión relativa de los genes diana utilizando el método 2-ΔΔCt.

7. Preparación para experimentos celulares

  1. Modelo de célula de PLGC
    1. Cultivo de las células GES-1 en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 combinado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina. Cultive las células a 2 x 105 células por pocillo en una placa de 6 pocillos que contenga 1,5 mL de medio RPMI 1640 sin suero y antibióticos a 37 °C con 5% de CO2.
    2. Inducir las células GES-1 con MNNG para la transformación maligna. Establezca la disposición de modelado como se describe a continuación.
      1. En el día 0, pre-resucitar y pasar las células GES-1 para mantenerlas en la fase de crecimiento logarítmico. Inocular las células GES-1 en fase logarítmica en matraces de cultivo y cultivarlas durante la noche.
      2. El día 1 y el día 2, sustituya el medio que contiene MNNG (10 μM/L). El día 3, reemplace el medio que contiene MNNG por un medio libre de medicamentos.
      3. El día 4 y el día 6, tratar las células con medio que contenga MNNG (5 μM/L) durante 24 h. El día 7, reemplace el medio que contiene MNNG por un medio libre de medicamentos. Retire las numerosas células moribundas y desprendidas y continúe con el cultivo celular.
      4. El día 8 y el día 10, tratar las células con el medio que contiene MNNG (5 μM/L) durante 24 h. En el día 11, construya el modelo de celda de PLGC (MC).
        NOTA: Durante el período de modelado, el estado de las células debe observarse regularmente. Si las células muestran un mal estado, se recomienda tratarlas con MNNG durante diferentes intervalos de tiempo, preferiblemente con un intervalo de 2 días. Alternativamente, las células se pueden tratar con una dosis baja de MNNG (3 μM/L). Los criterios de diagnóstico patológico de las células MC pueden ser referenciados a partir de investigaciones previas para evaluar con precisión el estado de las células 10,19,20,21.
  2. Preparación de suero que contiene medicamentos
    1. Alimente a 30 ratas SD (machos, 220 g) con una dieta estándar de pellets para roedores y agua ad libitum hasta que todas las ratas pesen más de 350 g. Asigne las ratas aleatoriamente al grupo de suero positivo que contiene fármaco (n = 10), al grupo de suero que contiene HZJD (n = 10) y al grupo de suero de rata normal (n = 10).
    2. Realice la administración del fármaco en ratas como se describe en el paso 1.3.2. Administre las ratas 2 veces al día a las 8:00 a.m. y 8:00 p.m. Continúe la intervención farmacológica durante 7 días.
    3. Recoja las muestras de sangre dentro de 1 h después de la última administración el día 8 (8:00 a.m.). Colocar las muestras en tubos anticoagulantes a 4 °C durante 1 h. Centrifugar a 3.000 x g durante 15 min a 4 °C y recoger el sobrenadante.
  3. Métodos de agrupamiento e intervención de experimentos celulares
    1. Divida los experimentos celulares de la siguiente manera: grupo GES-1 (GES-1), grupo MC (MC), grupo de fármaco positivo (fármaco positivo), grupo de decocción HZJD (HZJD), grupo de silenciamiento de Sirt3 (si-Sirt3), grupo de control negativo (si-NC) y silenciamiento de Sirt3 combinado con grupo de decocción de HZJD (si-Sirt3 + HZJD).
    2. Tratar las células del grupo de fármaco positivo y del grupo HZJD con un suero que contenga un 10% de vitamina B12 y un suero que contenga HZJD al 10%, respectivamente. Administrar otros grupos con un 10% de suero normal para ratas.
      NOTA: Sobre la base de investigaciones previas10, se seleccionó un 10% de suero que contenía fármacos para el tratamiento celular.
    3. Realice la transfección de si-RNA de Sirt3 (consulte la tabla de materiales) para las células del grupo si-Sirt3 y del grupo si-Sirt3 + HZJD. Configure un grupo de control negativo que reciba un vector vacío, es decir, si-NC.
    4. Disuelva la potencia de siRNA de 2,5 nM en 125 μL de DEPC para preparar la solución de siRNA. Diluir 5 μL de solución de siRNA con 250 μL de medio esencial mínimo y diluir 5 μL de lipofectamina 2000 con 250 μL de medio esencial mínimo. Mézclalos uniformemente.
    5. Agregue la mezcla al medio RPMI 1640 (1.5 mL/por pocillo) en una placa de 6 pocillos. Incubar a 37 °C con 5% de CO2. Realizar el análisis de Western blot para detectar el nivel de expresión de la proteína Sirt3 a las 48 h después de la transfección.

8. Ensayo CCK-8

  1. Prepare las células en suspensión celular cuando las células cubran el 70% del fondo de la botella. Utilice el contador de celdas para contar el número de celdas en la suspensión. Ajuste la concentración para asegurar 2.000 células/pocillo, y cada pocillo contiene 100 μL de medio RPMI 1640. Siembre las células en placas de 96 pocillos y manténgalas a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2 durante 24 h. Configure 6 pozos de réplica para cada grupo.
    NOTA: Los pocillos periféricos de las placas de 96 pocillos que no se están utilizando se llenan con 200 μL de PBS para reducir la evaporación durante el período de incubación.
  2. Después de cultivar las células durante 24 horas, sustituya el medio de cultivo por otro medio de cultivo que contenga fármaco. Cultive las células durante 48 h con un medio de cultivo positivo que contenga fármaco y un medio de cultivo que contenga HZJD.
    NOTA: El medio de cultivo es claro. Al observar el fondo del frasco de cultivo con luz, se puede ver que las células están conectadas en láminas. Este fenómeno puede demostrar que las células se han adherido a la pared. Cuando se observan bajo un microscopio, las células adherentes se extienden en lanzaderas en el fondo del frasco y al agitar el medio de cultivo, las células no se mueven. Las células suelen adherirse a la pared después de 24 h de cultivo.
  3. Reemplace el medio de cultivo que contiene fármaco por un medio de cultivo nuevo. Añadir 10 μL de solución CCK-8 (ver Tabla de Materiales) a cada pocillo e incubar a 37 °C durante 1 h. Para evitar la formación de burbujas de aire, agregue la solución CCK-8 oblicuamente a la pared de la placa de cultivo.
  4. Detecte el valor OD de cada pocillo utilizando un lector de microplacas a una longitud de onda de 450 nm.

9. Ensayo de proliferación celular EdU

  1. Siembre las células en placas de 96 pocillos como se describe en el paso 7.1. Sustituya el medio de cultivo por otro medio de cultivo que contenga fármaco durante 48 h.
    NOTA: Se confirmó que el tiempo óptimo de tratamiento era de 48 h a través de experimentos preliminares.
  2. Retire el medio y lave las células con PBS. Añadir 100 μL de medio de cultivo por pocillo. Prepare la solución de EdU 2x (consulte la tabla de materiales, 20 μM). Añadir 6 μL de la solución madre de EdU a 3 mL de medio de cultivo. Añadir 100 μL de la solución 2x EdU (37 °C precalentada) por pocillo y luego incubar durante 2,5 h.
    NOTA: La solución madre de EdU se diluyó en una proporción de 1:500 para obtener la solución de EdU 2x. El volumen real de la solución de EdU 2x fue de 2,4 mL para 24 pocillos.
  3. Retire el medio que contiene EdU. Añadir 200 μL de paraformaldehído al 4% por pocillo a temperatura ambiente durante 15 min. Retire el paraformaldehído. Enjuague las células con solución de lavado (albúmina sérica bovina [BSA] al 3% en PBS) 3 veces durante 5 minutos cada una.
  4. Retire la solución de lavado. Añadir 200 μL de solución de permeabilización (Triton-X 100 % al 0,3% en PBS) por pocillo a temperatura ambiente durante 20 min. Retire la solución de permeabilización. Enjuague las celdas con solución de lavado (3% BSA en PBS) 2 veces durante 5 minutos cada una.
  5. Disuelva el aditivo con 1,3 mL de agua desionizada para completar la solución. Prepare la solución de reacción que contenga 1,72 mL de tampón de reacción, 4 μL de azida 488, 80 μL de CuSO4 y 200 μL de solución aditiva.
  6. Añadir 50 μL de solución de reacción por pocillo. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. Enjuague las celdas con solución de lavado 3 veces durante 5 minutos cada una.
  7. Retire la solución de lavado. Añada 200 μl de 1 solución Hoechst 33342 e incube las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos en la oscuridad.
  8. Adquisición de imágenes utilizando el microscopio de fluorescencia. Utilice el software Image-Pro plus 6.0 para realizar análisis cuantitativos de imágenes.
    NOTA: Las longitudes de onda máximas de excitación y emisión de Azide 488 son 495 nm y 519 nm, respectivamente. Las longitudes de onda máximas de excitación y emisión de Hoechst 33342 son 346 nm y 460 nm, respectivamente.

10. Detección de mitofagia en células vivas

  1. Siembre las celdas en 2 x 104 celdas por pocillo en una placa de 24 pocillos con fondo de vidrio. Cultivo nocturno de células con medio RPMI 1640 sin antibióticos a 37 °C con 5% de CO2.
  2. Prepare la solución de trabajo del tinte mtphagy y la solución de trabajo del tinte liso (consulte la Tabla de materiales). Diluir la solución de colorante mtofhagy con el tampón HEPES de Hanks a una concentración de 100 nM/L. Diluir la solución de colorante liso con el tampón HEPES de Hanks a una concentración de 100 μM/L.
  3. Retire el medio de cultivo y enjuague las células con el tampón HEPES 2x de Hanks. Añadir 500 μL de solución de trabajo de colorante mtphagy (100 nM/L) e incubar a 37 °C durante 30 min.
  4. Enjuague las celdas con el tampón HEPES de Hanks 2 veces. Añadir 500 μL de solución de trabajo de colorante liso (100 μM/L) e incubar a 37 °C durante 30 min.
  5. Enjuague las celdas con el tampón HEPES de Hanks 2 veces. Determinar el nivel de mitofagia mediante microscopía de fluorescencia confocal.
    NOTA: Las células se obtuvieron sin ninguna fijación antes o después de la tinción. El proceso de obtención de imágenes se llevó a cabo lo más rápido posible para minimizar cualquier cambio o alteración potencial en el estado celular.

11. Análisis estadísticos

  1. Utilizar software comercial para realizar análisis estadísticos. Comparar las diferencias entre los diferentes grupos con ANOVA de un factor seguido de la prueba post hoc de LSD. Presentar los datos como media ± desviación estándar (DE). Establezca la significación estadística en P<0.05.

Resultados

MNNG induce la progresión de PLGC en un modelo animal y promueve la transformación morfológica de las células GES-1

Tras la observación macroscópica, la mucosa gástrica de las ratas del grupo de control apareció de color rojo brillante, lisa y blanda, con los pliegues mucosos dispuestos en un patrón lineal. A diferencia de las ratas del grupo control, la mucosa gástrica de las ratas del grupo modelo presentaba palidez y rugosidad, y ...

Discusión

La PLGC es un proceso clave en la progresión de la gastritis crónica a la CG. En los últimos años, se ha demostrado que la medicina tradicional china es un tratamiento e intervención prometedores para el PLGC24,25. En los últimos años, la medicina tradicional china se ha convertido en un enfoque prometedor para el tratamiento y la intervención de la PLGC. Esto es consistente con investigaciones previas10...

Divulgaciones

Todos los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este proyecto fue financiado por la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Hebei de China (H2020423207).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidineShanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHNR030453
3,3’-diaminobenzidineBeijing Zhong Shan-Golden Bridge Biological Technology Co., Ltd., Beijing, CHNZLI0919
Alcian blue periodic acid schiff staining reagent kitBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNG1285
Anti-fade fluorescence mounting mediumBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNS2110
Bicinchoninic acid protein concentration determination kitWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG2026-1000T
CCK-8 reagent kitBoster Biological Engineering co., Ltd., Wuhan, CHNAR1160
Confocal fluorescence microscopyLeica Instruments Co., Ltd., Weztlar, GERTCS-SP8SR
COX figure-materials-1036 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab202554
DAPI staining solutionBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNC0065
DEPCWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG3004
EdU cell proliferation kitBeyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, CHNC0071S
Electrophoresis solutionBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0139
EthanolTianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN64-17-5
FBSGibco Corporation, Gaithersburg, USA16000044
Fluorescence microscopeOlympus Corporation, Tokyo, JPNBH2-RFCA
Foxo3a antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHN23683
GAPDH antibodyWuhan Sanying Biology Technology Co., Ltd., Wuhan, CHN10494-1-AP
Gel preparation kitBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0138
GES-1 cellProcell Life Science&Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNCL-0563
Goat-anti-mouse IgGCST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN4409
Goat-anti-rabbit IgGAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab150077
Hematoxylin-eosin staining solutionZhuhai Beso Biotechnology Co., Ltd., Shenzhen, CHNBA4027
High iron diamine/alcian blue staining reagent kitBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNG2070
ImageJNational Institutes of Health, Bethesda, USA
Image-Pro Plus 6.0 softwareMedia Cybernetics Inc., Maryland, USA
IsopropanolTianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN67-63-0
LC3 antibodyCST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN83506
Loading bufferBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0198
Microplate readerRayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd., Shenzhen, CHNRT6100
MicrotomeLeica Instruments Co., Ltd., Weztlar, GERRM2245
Mitophagy kitDojindo Laboratories, Kyushu Island, JPNMD01-10
Neutral balsamWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNWG10004160
Optical microscopeOlympus Corporation, Tokyo, JPNBH2-RFCA
P62 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab91526
ParaformaldehydeBiosharp Life Sciences, Anhui, CHNBL539A
Parkin antibodyCST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN32833
Penicillin–streptomycinGibco Corporation, Gaithersburg, USA15140122
phosphate-buffered salineWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG0002-15
PVDF membraneMillipore Corporation, Michigan, USAIPVH00010
RedzolSBS Genetech Co., Ltd., Beijing, CHNFTR-50
Reverse transcription reagent kitIgene Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, CHNQP057
RIPA Buffer solutionBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNR002
Roswell Park Memorial InstituteGibco Corporation, Gaithersburg, USA11875093
Silicone needleZhongke Life Biotechnology Co., Ltd., Beijing, CHNTFEP-2
siRNAWuhan Genecreate Biological Engineering Co., Ltd. ,Wuhan,CHN
Sirt3 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHN189860
Sodium salicylateShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHNS104176
Sprague-Dawley ratBeijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd., Beijing, CHN110322210102553975
SYBR quantitative PCR kitWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG3320-15
Tomm20 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab186735
Transferring bufferBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0141
TrichloromethaneShanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHN821112
Tris-buffered saline with Tween 20Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG0004
VDAC1 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab15895
XyleneTianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN1330-20-7
β-actin antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab8226

Referencias

  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  2. He, J., et al. Helicobacter pylori infection induces stem cell-like properties in Correa cascade of gastric cancer. Cancer Letters. 542, 215764 (2022).
  3. Xu, W., Li, B., Xu, M., Yang, T., Hao, X. Traditional Chinese medicine for precancerous lesions of gastric cancer: A review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 146, 112542 (2022).
  4. Yang, L., et al. A Systematic Review of the Mechanisms Underlying Treatment of Gastric Precancerous Lesions by Traditional Chinese Medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, 9154738 (2020).
  5. Ping, Z., Yan, W., Jing, L., Qian, J., Xin, H. The Effect of Huazhuo Jiedu recipe on Epithelial -Mesenchymal-Transition in Chronic Erosive Gastritis Patients with Zhuoduneiyun syndrome. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (6), 154-158 (2019).
  6. Yan, W., Jing, L., Pan, Z. The effect of Huazhuojiedu formula on HGF/c-Met signal pathway in patients with chronic erosive gastritis. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 33 (02), 186-189 (2017).
  7. Hao, X., et al. Integrating Network Pharmacology and Experimental Validation to Investigate the Mechanisms of Huazhuojiedu Decoction to Treat Chronic Atrophic Gastritis. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, 2638362 (2020).
  8. Zhou, P., et al. 16S rRNA sequencing-based evaluation of the protective effects of Hua-Zhuo-Jie-Du on rats with chronic atrophic gastritis. BMC Complementary Medicine and Therapies. 22 (1), 71 (2022).
  9. Zhou, P., et al. Determination of the protective effects of Hua-Zhuo-Jie-Du in chronic atrophic gastritis by regulating intestinal microbiota and metabolites: combination of liquid chromatograph mass spectrometer metabolic profiling and 16S rRNA gene sequencing. Chinese Medicine. 16 (1), 37 (2021).
  10. Hao, X., Zhou, P., Yang, Z., Yang, T., Wang, Y. The therapeutic effect of Huazhuojiedu decoction on precancerous lesions in a gastric cancer model via the regulation of lnc 517368. Journal of Ethnopharmacology. 283, 114635 (2022).
  11. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).
  12. Zhang, C., et al. Parkin, a p53 target gene, mediates the role of p53 in glucose metabolism and the Warburg effect. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16259-16264 (2011).
  13. Cai, T., et al. Protective effects of Weipixiao decoction against MNNG-induced gastric precancerous lesions in rats. Biomedicine & Pharmacotherapy. 120, 109427 (2019).
  14. Shah, S. C., Piazuelo, M. B., Kuipers, E. J., Li, D. AGA Clinical Practice Update on the Diagnosis and Management of Atrophic Gastritis: Expert Review. Gastroenterology. 161 (4), 1325-1332 (2021).
  15. Pimentel-Nunes, P., et al. Management of epithelial precancerous conditions and lesions in the stomach (MAPS II): European Society of Gastrointestinal Endoscopy (ESGE), European Helicobacter and Microbiota Study Group (EHMSG), European Society of Pathology (ESP), and Sociedade Portuguesa de Endoscopia Digestiva (SPED) guideline update 2019. Endoscopy. 51 (4), 365-388 (2019).
  16. Nagtegaal, I. D., et al. The 2019 WHO classification of tumours of the digestive system. Histopathology. 76 (2), 182-188 (2020).
  17. Kushima, R. The updated WHO classification of digestive system tumours-gastric adenocarcinoma and dysplasia. Der Pathologe. 43 (1), 8-15 (2022).
  18. Yang, P., et al. Weipiling decoction alleviates N-methyl-N-nitro-N'-nitrosoguanidine-induced gastric precancerous lesions via NF-κB signalling pathway inhibition. Chinese Medicine. 17 (1), 104 (2022).
  19. Xu, J., et al. Xiao Tan He Wei Decoction reverses MNNG-induced precancerous lesions of gastric carcinoma in vivo and vitro: Regulation of apoptosis through NF-κB pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 108, 95-102 (2018).
  20. Li, S. Study on the mechanism of regulating NF-kB activity and inhibiting the migration of gastric "inflammation-cancer" transformed cells by invigorating spleen, removing blood stasis and detoxifying. Guangzhou University of Chinese Medicine. , 17-19 (2021).
  21. Liu, H. Research Progress of Cell Models of Gastric Cancer Precancerous Lesions. Traditional Chinese Drug Research and Clinical Pharmacology. 27 (4), 592-596 (2016).
  22. Zheng, J., et al. Chronic stress accelerates the process of gastric precancerous lesions in rats. Journal of Cancer. 12 (14), 4121-4133 (2021).
  23. Yu, W., et al. Sirt3 deficiency exacerbates diabetic cardiac dysfunction: Role of Foxo3A-Parkin-mediated mitophagy. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (8), 1973-1983 (2017).
  24. Cao, Y., et al. Efficacy of Banxia Xiexin decoction for chronic atrophic gastritis: A systematic review and meta-analysis. PLoS One. 15 (10), e0241202 (2020).
  25. Yin, J., et al. Weiqi Decoction Attenuated Chronic Atrophic Gastritis with Precancerous Lesion through Regulating Microcirculation Disturbance and HIF-1α Signaling Pathway. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 2651037 (2019).
  26. Zhang, J., Wang, X., Wang, F., Tang, X. Xiangsha Liujunzi Decoction improves gastrointestinal motility in functional dyspepsia with spleen deficiency syndrome by restoring mitochondrial quality control homeostasis. Phytomedicine. 105, 154374 (2022).
  27. Shida, M., et al. Impaired mitophagy activates mtROS/HIF-1α interplay and increases cancer aggressiveness in gastric cancer cells under hypoxia. International Journal of Oncology. 48 (4), 1379-1390 (2016).
  28. Zhou, X. Y., et al. Inhibition of autophagy blocks cathepsins-tBid-mitochondrial apoptotic signaling pathway via stabilization of lysosomal membrane in ischemic astrocytes. Cell Death & Disease. 8 (2), e2618 (2017).
  29. He, R., Peng, J., Yuan, P., Xu, F., Wei, W. Divergent roles of BECN1 in LC3 lipidation and autophagosomal function. Autophagy. 11 (5), 740-747 (2015).
  30. Fernández-Coto, D. L., et al. Quantitative proteomics reveals proteins involved in the progression from non-cancerous lesions to gastric cancer. Journal of Proteomics. 186, 15-27 (2018).
  31. Ding, D., et al. Post-translational modification of Parkin and its research progress in cancer. Cancer Communications. 39 (1), 77 (2019).
  32. Wang, Y., et al. The Role of Mitochondrial Dynamics and Mitophagy in Carcinogenesis, Metastasis and Therapy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 413 (2020).
  33. Gehrke, S., et al. PINK1 and Parkin control localized translation of respiratory chain component mRNAs on mitochondria outer membrane. Cell Metabolism. 21 (1), 95-108 (2015).
  34. Fu, Z. J., et al. HIF-1α-BNIP3-mediated mitophagy in tubular cells protects against renal ischemia/reperfusion injury. Redox Biology. 36, 101671 (2020).
  35. Jia, Q., et al. Hesperidin promotes gastric motility in rats with functional dyspepsia by regulating Drp1-mediated ICC mitophagy. Frontiers in Pharmacology. 13, 945624 (2022).
  36. Chen, Y. The N-alkylamides induces MGMT gene hypomethylation in gastric epithelium cells malignant transformation. Zhejiang University. , 33-35 (2015).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Decocci n de HuazhuojieduC ncer g stricoLesiones precancerosasMitofagiaRatas Sprague DawleyProliferaci n celularSirt3Foxo3aParkinLC3 II IP62Tomm20Western BlotRT qPCRInmunohistoqu mica

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados