JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, mitofaji regülasyonu kullanarak mide kanserinin prekanseröz lezyonlarını hafifletmede Huazhuojiedu kaynağının (HZJD) terapötik etkinliğini gösteren bir protokol sunuyoruz.

Özet

Bu araştırma, mide kanserinin (PLGC) prekanseröz lezyonlarını hem in vivo hem de in vitro olarak hafifletmek için Huazhuojiedu kaynatma (HZJD) tedavisinin terapötik etkisini ve potansiyel mekanizmalarını araştırmayı amaçlamaktadır. HZJD, 11 bitkiden oluşan geleneksel bir Çin bitkisel formülüdür. Sprague-Dawley (SD) cinsi sıçanlar rastgele dört alt gruba ayrıldı: kontrol grubu, model grubu, pozitif ilaç grubu ve HZJD grubu. Hematoksilen-eozin (H&E) boyaması, yüksek demir diamin-alcian mavisi (HID-AB) boyaması, alcian mavisi-periyodik asit Schiff (AB-PAS) boyaması, immünohistokimya, immünofloresan, RT-qPCR ve Western blot testleri 10 haftalık HZJD tedavisinden sonra yapıldı. İn vitro olarak, hücre proliferasyonunu tespit etmek için hücre sayma kiti-8 (CCK-8) ve 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) testleri kullanıldı. Mitofaji düzeylerini değerlendirmek için RT-qPCR ve Western blot testleri yapıldı. Sonuçlar, HZJD'nin PLGC sıçanlarında patolojik ilerlemeyi geciktirebileceğini ve PLGC hücre proliferasyonunu azaltabileceğini gösterdi. HZJD ile tedavi, Sirt3, Foxo3a, Parkin ve LC3 II/I'nin mRNA ve protein ekspresyon seviyelerini önemli ölçüde artırırken, p62 ve Tomm20'nin mRNA ve protein ekspresyon seviyelerini azalttı. HZJD'nin hem in vivo hem de in vitro mitofaji aktivitesindeki düşüşü tersine çevirme yeteneğine sahip olduğu bulundu. Sonuç olarak, çalışma HZJD'nin etkisini değerlendirdi ve potansiyel moleküler mekanizması hakkında kanıt sağladı.

Giriş

Mide kanseri (GK), dünya çapında sindirim sistemini etkileyen en yaygın malign hastalıklardan biri olmaya devam etmektedir. GC'nin dünya çapında tüm kanserlerin yaklaşık %6'sını oluşturduğu, en sık teşhis edilen kanserler arasında 5. sırada, kansere bağlı ölümler arasında ise 3. sırada yer aldığı tahmin edilmektedir1. GC, yaygın olarak ilerleyici, çok aşamalı bir biyolojik süreç olarak kabul edilmektedir. GC'nin başlangıcından önce, mide mukozası sıklıkla mide kanseri (PLGC) evrelerinin prekanseröz lezyonları olarak adlandırılan birkaç yıl prekanseröz lezyonlara maruz kalır. Correa kaskad teorisi yaygın olarak kabul görmektedir ve normal mukozadan kronik atrofik olmayan gastrite, atrofik gastrite, intestinal metaplaziye (IM), displaziye (Dys) ve nihayetinde karsinoma2. PLGC, GC gelişiminde çok önemli bir aşamayı temsil eder ve PLGC'ye zamanında müdahale ve izleme, GC'nin erken önlenmesi için hayati önem taşır.

Son klinik değerlendirmeler ve deneysel araştırmalar, geleneksel Çin tıbbının (TCM) PLGC 3,4'ü tedavi etmek için en etkili tedavilerden biri olarak ortaya çıktığını doğrulamıştır. HZJD kaynatma, klinik deneyime dayalı olarak geliştirilmiş ve TCM'nin ısı ve nem giderme teorisine dayanan bir TCM formülüdür. Önceki çalışmalar, HZJD kaynatma işleminin PLGC tedavisinde, özellikle klinik semptomları ve patolojik belirtileri hafifletmede yararlı etkilerini göstermiştir 5,6. Ağ farmakolojisi ile ilgili çalışmalar sayesinde, HZJD kaynatma işleminin aktif bileşenlerini ve bunların PLGC7 için potansiyel hedeflerini belirledik. Önceki bir çalışmadan elde edilen bulgular, HZJD kaynatma işleminin PLGC sıçanlarında çeşitliliği artırma, topluluk yapısını optimize etme ve bağırsak florasının nispi bolluğunu artırma yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir8. Ayrıca, HZJD kaynatma işleminin bağırsak mikrobiyotasını ve metabolitlerini düzenleyerek PLGC'yi iyileştirebileceği doğrulanmıştır9. Son çalışmalarda, HZJD kaynatmanın, lnc 51736810'un ekspresyonunu aşağı regüle ederek PLGC hücrelerinde hücre proliferasyonu ve apoptozun dinamik dengesini düzenleyebileceğini gösterdik.

Artan sayıda çalışma, mitofajinin çeşitli kanserlerde önemli bir rol oynadığını doğrulamıştır. Mitofaji, hasarlı ve depolarize mitokondriyi seçici olarak ortadan kaldırır ve ayrıca işlevsiz mitokondriden sitotoksik reaktif oksijen türlerinin (ROS) aşırı birikimini önler ve bu da tümörijeneziinhibe eder 11. Hasarlı veya işlevsiz mitokondrinin seçici bozunması olan mitofaji, karmaşık bir şekilde mitokondriyal oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) ile bağlantılıdır. Mitofajinin bozulması veya yokluğu, hücresel enerji metabolizmasında, yaygın olarak Warburg etkisi olarak bilinen bir fenomen olan aerobik glikolize doğru bir kaymaya yol açabilir. Warburg etkisinden kaynaklanan artan laktat ve keton cisimleri üretimi, hücre proliferasyonuna elverişli bir tümör mikro çevresinin inşasına katkıda bulunur12.

Bu çalışma, PLGC'nin ilerlemesini azaltmak için terapötik bir yaklaşım olarak HZJD kaynatma'yı kullanmak için kapsamlı bir protokol sunmaktadır. Değerlendirmemiz sayesinde, HZJD kaynatmanın, özellikle mitofajiyi düzenleme kabiliyetinde önemli bir olumlu etkisi olduğunu gözlemledik. Çalışma, PLGC tedavisinde HZJD kaynatma işleminin potansiyel moleküler mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sunmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm deneysel işlemler ve hayvan bakımı, Hebei Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Yönergeleri (onay numarası: DWLL2019031) tarafından onaylanmış ve etik kurallara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Toplam 90 spesifik patojen içermeyen erkek Sprague-Dawley (SD) sıçan (yaş = 6 hafta; ağırlık = 150-180 g; Malzeme Tablosuna bakınız) sabit sıcaklıkta (24 °C ± 4 °C) ve nemde (%50-%60) 12 saatlik kontrollü karanlık/aydınlık döngü altında yetiştirildi. Sıçanlar, deneylere başlamadan önce 1 hafta boyunca yeni ortama alıştırıldı.

1. Hayvan deneyi için hazırlık

  1. PLGC'nin sıçan modeli
    1. Sıçanları rastgele bir kontrol grubuna (n = 20) ve bir PLGC model grubuna (n = 70) atayın. Kontrol grubundaki sıçanlara standart bir kemirgen pelet diyeti ve su ad libitum sağlayın. PLGC model grubundaki sıçanlar düzensiz diyetle (1 gün açlık, 1 gün beslenme) beslenmelidir.
    2. Fareleri kafes başına beşli gruplar halinde barındırın. Kontrol grubuna kafes başına 150 g/gün yem verin. PLGC model grubunun 23 saat (150 g/gün/kafes başına) yiyeceğe ücretsiz erişimine izin verin. 23 saat sonra kalan beslemeyi çıkarın.
    3. PLGC model grubundaki sıçanlara serbest içme için 1-metil-3-nitro-1-nitrosoguanidin (MNNG) çözeltisi (200 μg/mL) sağlayın10,13. PLGC model grubundaki sıçanlara kafes başına 200 mL MNNG çözeltisi sağlayın. MNNG solüsyonunu opak içme şişelerine koyun ve günlük olarak değiştirin.
    4. PLGC model grubundaki sıçanları 24 saatlik açlıktan sonra (gavaj ile her 2 günde bir)% 2 sodyum salisilat ile gavajlayın. Gavaj için, minimum iğne derinliği 6 cm'ye eşit olan bir silikon iğne ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın. Sabahları 08:30 ile 09:30 saatleri arasında aynı saatte sürekli olarak gavaj yapın.
    5. PLGC modelinin kurulmasını değerlendirmek için 12, 16, 20 ve 24. haftalarda patolojik inceleme için PLGC model grubundan rastgele iki sıçan seçin. Her iki sıçan da9'da tarif edildiği gibi patolojik değerlendirme ile PLGC teşhisi konduğunda modelin başarılı olduğunu düşünün.
      1. Bu modelleme süreci yaklaşık 24 hafta sürer. Patolojik değerlendirmenin iki kıdemli patolog tarafından bağımsız olarak yapılmasına izin verin. İki patoloğun işbirlikçi değerlendirmesi ile sıçanlarda PLGC'nin patolojik tanısını belirleyin. Tanısal görüşlerini dikkate alın ve değerlendirme sürecinde önceki yönergeleri referans olarak kullanın 14,15,16,17.
  2. HZJD kaynatma işleminin hazırlanması
    1. HZJD kaynatma işlemini7'de açıklanan yönteme göre hazırlayın.
      NOT: HZJD kaynatma içindeki otlar, Hebei Geleneksel Çin Tıbbı Hastanesi tarafından satın alındı ve doğrulandı.
  3. Gruplama ve İlaç Müdahalesi
    1. PLGC model grubunu rastgele üç alt gruba ayırın: model grubu (n = 20), pozitif ilaç grubu (n = 20) ve Huazhuojiedu kaynatma grubu (HZJD, n = 20, Tablo 1).
    2. Pozitif ilaç grubundaki sıçanları 0.7 mg / kg / gün B12 vitamini ile gavaj18 ile gavajlayın. HZJD grubundaki sıçanları 14.81 g / kg / gün8'de HZJD kaynatma ile tedavi edin. Kontrol grubundaki ve model grubundaki sıçanları distile su (10 mL / kg) ile uygulayın. Dört grubun tümü 10 hafta boyunca günde bir kez intragastrik uygulama alır.
      NOT: İnsanlar için günlük önerilen HZJD kaynatma dozu 142 g / gün10'dur. Vücut yüzey alanı hesaplama yöntemi kullanılarak, sıçanlar için önerilen dozun insanlarınkinin 6.25 katı olduğu belirlenmiştir. Bu nedenle, sıçanlar için günlük HZJD kaynatma dozu 14.81 g / kg'dır. Dozaj, sıçanların ağırlığına göre haftalık olarak ayarlandı. Maksimum gavaj hacmi 3 mL'yi geçmedi.
  4. Numune toplama
    1. 35. haftada 24 saat oruç tuttuktan sonra (suya ücretsiz erişim ile) tüm fareleri kurban edin. Tüm sıçanları izofluran ile uyuşturun (% 5 indüksiyon,% 2 bakım için, 1L / dak akış hızı).
    2. Karın bölgesini tıraş edin ve ağrı stimülasyonu kaybını doğruladıktan sonra cildi etanol ve iyot ile sterilize edin. Karın derisini ksifoid kıkırdaktan karnın orta hattı boyunca bir neşter ile kesin.
    3. Künt, mideyi açığa çıkarana kadar deri altı dokusunu forseps ve neşter ile ayırın. Mideyi daha büyük eğrilik boyunca bir makasla inceleyin ve hemen fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın.
    4. Mide dokularını bir buz tabağı üzerinde açın. Antrumdan, korpustan ve açısal bölgenin daha küçük eğriliğinden mide örneklerini (2 mm x 2 mm) toplayın. Midede gözle görülür herhangi bir lezyon varsa, bu belirli kısımları örnek olarak toplayın ve işleyin.
    5. Mide örneklerini 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin. Kalan mide dokularını kriyotüplere yerleştirin. Bunları sıvı nitrojen içinde dondurun ve ardından -80 °C'de saklayın.
    6. Sıçanları karbondioksit soluyarak ötenazi yapın. Sıçan leşlerini kapalı torbalara koyun ve ardından torbaları hayvan karkası saklama dolabına koyun.

2. Patolojik inceleme

  1. Sabit mide dokularını makasla kesin ve düzeltin. Dokuları gradyan bir alkol serisi ile dehidre edin, yani 30 dakika boyunca% 75 etanol, 30 dakika boyunca% 85 etanol, 30 dakika boyunca% 95 etanol ve her biri 30 dakika boyunca susuz etanol içinde 2x. Dokuları 1 saat boyunca ksilen / etanol çözeltisine (1: 1) ve her biri 30 dakika boyunca 2x% 100 ksilen içine daldırın.
  2. Erimiş balmumunun yarısını kalıba dökün ve ardından geçirgen dokuları hızlı bir şekilde kalıba koyun. Dokuları erimiş balmumunun diğer yarısına yerleştirin. Gömülü kutuyu işaretleyin ve balmumunun tamamen katılaşmasına izin verin.
  3. 4 μm kalınlığında dilimler halinde kesmek için mikrotom kullanın. Dilimleri slaytların üzerine yerleştirin.
  4. Dilimleri 2x %100 ksilen içine her biri 10 dakika, daha sonra 10 dakika ksilen/etanol çözeltisi (1:1), 2x tekrar susuz etanol içinde 5 dakika, sonra 5 dakika boyunca %95 etanol, ardından 5 dakika boyunca %85 etanol ve son olarak 5 dakika boyunca %70 etanol içine yerleştirin. Dilimleri akan su ile durulayın.
  5. Dilimleri 5 dakika hematoksilen ile boyayın. 10 saniye boyunca% 0.5 hidroklorik asit-etanole batırarak farklılaştırın. Dilimleri 2 dakika eozin ile boyayın.
  6. Dilimleri damıtılmış suyla durulayın. Dilimleri gradyan bir alkol serisiyle kurutun, yani 30 saniye boyunca %70 etanol, 30 saniye boyunca %80 etanol, 30 saniye boyunca %95 etanol, 30 saniye boyunca susuz etanol. Dilimleri %100 ksilen 2x ile geçirgenleştirin. Dilimleri nötr balzamla kapatın.
  7. HID çalışma çözeltisini hazırlamak için HID çözeltisi A ve HID çözeltisi B'yi 50:3 oranında karıştırın. Dilimleri 24 saat boyunca HID çalışma solüsyonu ile boyayın.
  8. Akan su altında durulayın ve dilimleri 20 dakika boyunca alcian ile boyayın. Dilimleri nükleer hızlı kırmızı çözelti ile 10 dakika boyunca boyayın. Dilimleri adım 2.6'da açıklandığı gibi kurutun ve kapatın.
  9. Dilimleri 20 dakika alcian ile boyayın. Dilimleri% 1 sulu periyodik asit çözeltisinde 5 dakika inkübe edin. Dilimleri Schiff ile 20 dakika boyayın.
  10. Çekirdekleri boyamak için slaytları hematoksilen ile 2 dakika inkübe edin. Asidik farklılaşma solüsyonunu (HID kiti ile birlikte verilir) 5 saniye boyunca ekleyin. Slaytları maviye boyamak için Scott mavisi çözümünü 3 dakika boyunca uygulayın. Dilimleri yukarıda adım 2.6'da açıklandığı gibi kurutun ve kapatın.
    NOT: Boyama işlemi ışıktan korunmalıdır. % 1 sulu periyodik asit çözeltisi kullanıldığında sıcaklık 22 ° C'nin altında tutulmalıdır. Dilimler, adım 2.6'da açıklandığı gibi kurutulmalı ve kapatılmalıdır.
  11. Lekeli dilimleri optik mikroskop altında 10x ve 20x büyütmede inceleyin.

3. İmmünohistokimya

  1. Adım 2.4'te elde edilen dilimleri kullanın. Dilimleri 0.01 M sodyum sitrat tamponuna koyun ve antijen alımını gerçekleştirmek için 10 dakika ısıtın.
  2. Endojen peroksidaz ve biotin'i söndürmek için 30 dakika boyunca% 3 hidrojen peroksit ekleyin. Dilimleri 30 dakika boyunca keçi serumu ile bloke edin.
  3. Dilimleri sirt3 (1:200), foxo3a (1:100) ve parkine (1:200) karşı seyreltilmiş primer antikorlarla gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Negatif kontrol için primer antikorları PBS ile değiştirin.
  4. Dilimleri PBS ile durulama başına 3 dakika boyunca 5 kez durulayın. Dilimleri karşılık gelen ikincil antikor ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  5. 3 dakika boyunca 20 μL 3,3'-diaminobenzidin (DAB) ekleyin. Dilimleri yukarıda adım 2.6'da açıklandığı gibi kurutun ve kapatın.
  6. Tüm dilimleri optik mikroskop altında 40x büyütme ile görüntüleyin. Kantitatif görüntü analizi yapmak için Image-Pro Plus 6.0 yazılımını kullanın.

4. İmmünofloresan

  1. Adım 3.1'de elde edilen dilimleri kullanın. Adım 3.3'ü tekrarlayın.
  2. Dilimleri COX IV (1:500) ve LC3'e (1:500) karşı seyreltilmiş primer antikorlarla gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Dilimleri PBS ile durulama başına 3 dakika boyunca 5 kez durulayın.
  3. Dilimleri keçi tavşan önleyici IgG (1:1000) ve keçi fare karşıtı IgG (1:1000) ile oda sıcaklığında 1,5 saat kuluçkaya yatırın. Dilimleri PBS ile durulama başına 3 dakika boyunca 5 kez durulayın.
  4. DAPI boyama solüsyonu ekleyin ve karanlıkta 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Dilimleri PBS ile durulama başına 3 dakika boyunca 5 kez durulayın.
  5. Damla damla DAPI boyama solüsyonu ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Dilimleri solma önleyici floresan montaj ortamı ile monte edin.
  6. Dilimleri bir floresan mikroskobu altında 40x büyütmede görselleştirin ve fotoğraflayın ( Malzeme Tablosuna bakın).

5. Batı lekesi analizi

  1. 100 mg mide dokusunu tam olarak tartın. 1 mL RIPA tampon çözeltisi ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Bir homojenizatör kullanarak dokuları iyice öğütün (10.000 x g, her seferinde 3x için 15 s).
  2. Doku homojenatını 30 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin ve ardından süpernatanı toplayın.
  3. Bikinkoninik asit (BCA) protein konsantrasyonu belirleme kitini kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün (bkz. Malzeme Tablosu). Elde edilen süpernatantın protein konsantrasyonunu numuneler içinde tutarlı olacak şekilde ayarlayın.
  4. %10 ayırma jeli ve %5 istifleme jelinden oluşan SDS-PAGE jeli hazırlayın. % 10'luk ayırma jelini toplam yüksekliğin 2 / 3'ü kadar cam plakaya dökün. Jel katılaşana kadar jelin üzerine deiyonize su ekleyin. Cam plakayı doldurmak için% 5 istifleme jelini dökün. Elektroforez tarağını yerleştirin.
    NOT: Jelde kabarcık olmamasına dikkat edilmelidir.
  5. Protein süpernatantı 1:4 oranında 5x yükleme tamponu ile karıştırın. Denatüre olması için 5 dakika kaynar suya koyun. -20 °C'de saklayınız.
  6. Hazırlanan SDS-PAGE jelini Western blotting elektroforez sistemine monte edin. Taze elektroforez çözeltisi ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Jel üzerine oyuk başına 20 μL numune yükleyin. Elektroforezi 40 dakika boyunca 80 V'ta başlatın ve ardından 120 V'a geçin.
  7. Jeli toplayın ve aşağıdaki gibi bir transfer sandviçi oluşturun: iki kat sünger ped, iki kat filtre kağıdı, jel, poliviniliden florür (PVDF) membran (Malzeme Tablosuna bakınız), iki kat filtre kağıdı, iki kat sünger ped (negatif kutuptan pozitif kutba). Önceden soğutulmuş transfer tamponu ekleyin. 2 saat boyunca 350 mA'da ıslak transfer gerçekleştirin.
    NOT: Transfer sandviçini monte etmeden önce, PVDF membranı metanol ile ön işleme tabi tutulmalıdır. Ek olarak, sünger, filtre kağıdı ve ön işlem görmüş PVDF membranı önceden transfer tamponuna daldırılmalıdır (Malzeme Tablosuna bakınız).
  8. Membranı, bir çalkalayıcı üzerinde 2 saat boyunca tween 20 (TBST) ile tris-tamponlu tuzlu su içinde %5 yağsız sütle bloke edin. Membranı gece boyunca 4 ° C'de aşağıdaki seyreltilmiş birincil antikorlarla inkübe edin (Sirt3 = 1:500, Foxo3a = 1:1000, Parkin = 1:2000, P62 = 1:1000, LC3 = 1:1000, Tomm20 = 1:2000, β-aktin = 1:5000, GAPDH = 1:5000).
    NOT: Parkin'in moleküler ağırlığının (50 kDa) β-aktininkine (42 kDa) yakın olması nedeniyle Parkin'in tespiti için referans olarak GAPDH seçilmiştir.
  9. Membranı 4x'i TBST ile her seferinde 5 dakika yıkayın. Seyreltilmiş ikincil antikor (1:5000) ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  10. ECL çalışma solüsyonunu membranların protein tarafına 2 dakika boyunca bırakın. Görüntüleri kemilüminesans görüntüleme sistemi aracılığıyla elde edin. Gri tonlama değerlerini ölçmek için ImageJ yazılımını kullanın.

6. Kantitatif gerçek zamanlı PCR analizi

  1. Tüm deney cihazlarını% 0.1 dietil pirokarbonat (DEPC) ile temizleyin ve ardından önceden yüksek sıcaklık ve yüksek basınçta sterilize edin.
  2. 50 mg mide dokusu ağırlığında. 1 mL Redzol ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve bir homojenizatörde öğütün. Doku homojenatını RNaz içermeyen bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.
  3. 0.2 mL triklorometan ekleyin ve iyice karıştırın. 3 dakika oda sıcaklığında bekletin. 4 °C ve 12.000 x g'da 15 dakika santrifüjleyin.
  4. Üst sulu fazı dikkatlice çıkarın ve 10 dakika boyunca 0,5 mL izopropanol ile karıştırın. RNA'yı çökeltmek için 12.000 x g'yi 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve ardından RNA çökeltisini 3x %75 etanol ile yıkayın.
  5. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 7.500 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve ardından steril bir tezgahta 10 dakika boyunca kuru RNA çökeltisini yapın. Çökeltiyi 50 μL DEPC içinde çözün.
  6. 1 μg RNA'yı cDNA'ya ters transkribe edin. 1 μL 20x RTase karışımı, 4 μL 5x RT reaksiyon tamponu ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve DEPC'yi toplam 20 μL hacme kadar doldurun. Reaksiyon prosedürünü şu şekilde ayarlayın: 25 °C'de 10 dakika, 42 °C'de 40 dakika, 85 °C'de 10 dakika ve ardından 4 °C'de tutun.
  7. 2 μL cDNA, 2 μL ileri primer, 2 μL ters primer (Tablo 2), 10 μL 2x SYBR ön karışımı (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 4 μL DEPC içeren amplifikasyon reaksiyonu karışımını hazırlayın. Reaksiyon prosedürünü şu şekilde ayarlayın: 95 saniye boyunca 15 °C, 60 saniye boyunca 10 °C ve 72 °C için 30 saniye (40 döngü).
  8. Endojen referans olarak β-aktin kullanın. Ct değerlerini elde edin. 2-ΔΔCt yöntemini kullanarak hedef genlerin göreceli ifadesini hesaplayın.

7. Hücre deneyleri için hazırlık

  1. PLGC'nin hücre modeli
    1. GES-1 hücrelerini% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin ile birlikte Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamında kültürleyin. Hücreleri, serum ve antibiyotik içermeyen 1.5 mL RPMI 1640 ortamı içeren 6 oyuklu bir plakada 2 x 105 hücrede, serum ve antibiyotiksiz, 37 ° C'de% 5 CO2 ile kültürleyin.
    2. Malign transformasyon için GES-1 hücrelerini MNNG ile indükleyin. Modelleme düzenlemesini aşağıda açıklandığı gibi ayarlayın.
      1. 0. günde, logaritmik büyüme fazında tutmak için GES-1 hücrelerini önceden resüsitasyon yapın ve geçirin. Log faz GES-1 hücrelerini kültür şişelerine aşılayın ve gece boyunca kültürleyin.
      2. 1. ve 2. günlerde, MNNG (10 μM/L) içeren ortamı değiştirin. 3. günde, MNNG içeren ortamı ilaçsız ortamla değiştirin.
      3. 4. ve 6. günlerde, hücreleri 24 saat boyunca MNNG (5 μM / L) içeren ortamla tedavi edin. 7. günde, MNNG içeren ortamı ilaçsız ortamla değiştirin. Çok sayıda ölen ve dökülen hücreyi çıkarın ve hücre kültürüne devam edin.
      4. 8. ve 10. günlerde, hücreleri 24 saat boyunca MNNG (5 μM / L) içeren ortamla tedavi edin. 11. günde, PLGC'nin (MC) hücre modelini oluşturun.
        NOT: Modelleme süresi boyunca hücrelerin durumu düzenli olarak gözlemlenmelidir. Hücreler kötü bir durum gösteriyorsa, farklı zaman aralıklarıyla, tercihen 2 günlük aralıklarla MNNG ile tedavi edilmesi önerilir. Alternatif olarak, hücreler düşük dozda MNNG (3 μM/L) ile tedavi edilebilir. MC hücrelerinin patolojik tanı kriterleri, hücrelerin durumunu doğru bir şekilde değerlendirmek için önceki araştırmalardan referans alınabilir 10,19,20,21.
  2. İlaç içeren serumun hazırlanması
    1. 30 SD sıçanı (erkek, 220 g) standart bir kemirgen pelet diyeti ile besleyin ve tüm sıçanlar 350 g'dan daha ağır olana kadar su ad libitum ile besleyin. Sıçanları rastgele pozitif ilaç içeren serum grubuna (n = 10), HZJD içeren serum grubuna (n = 10) ve normal sıçan serum grubuna (n = 10) atayın.
    2. Sıçanlarda adım 1.3.2'de tarif edildiği gibi ilaç uygulamasını gerçekleştirin. Fareleri günde 2 kez 08:00 ve 20:00'de uygulayın. İlaç müdahalesine 7 gün boyunca devam edin.
    3. Kan örneklerini 8. gündeki son uygulamadan sonraki 1 saat içinde toplayın (8:00). Numuneleri 1 saat boyunca 4 ° C'de antikoagülan tüplere yerleştirin. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin ve ardından süpernatanı toplayın.
  3. Hücre deneylerinin gruplandırılması ve müdahale yöntemleri
    1. Hücre deneylerini şu şekilde bölün: GES-1 grubu (GES-1), MC grubu (MC), pozitif ilaç grubu (pozitif ilaç), HZJD kaynatma grubu (HZJD), Sirt3 susturma grubu (si-Sirt3), negatif kontrol grubu (si-NC) ve HZJD kaynatma grubu (si-Sirt3+HZJD) ile birleştirilmiş Sirt3 susturma.
    2. Pozitif ilaç grubu ve HZJD grubundaki hücreleri sırasıyla% 10 B12 vitamini içeren serum ve% 10 HZJD içeren serum ile tedavi edin. Diğer gruplara% 10 normal sıçan serumu uygulayın.
      NOT: Önceki araştırmalara dayanarak, hücre tedavisi için%10,%10 ilaç içeren serum seçilmiştir.
    3. si-Sirt3 grubu ve si-Sirt3+HZJD grubundaki hücreler için Sirt3 si-RNA (Malzeme Tablosuna bakınız) transfeksiyonunu gerçekleştirin. Boş bir vektör, yani si-NC alan bir negatif kontrol grubu ayarlayın.
    4. siRNA çözeltisi hazırlamak için 2.5 nM siRNA gücünü 125 μL DEPC'de çözün. 5 μL siRNA çözeltisini 250 μL minimum esansiyel ortam ile seyreltin ve 5 μL lipofektamin 2000'i 250 μL minimum esansiyel ortam ile seyreltin. Onları eşit şekilde karıştırın.
    5. Karışımı 6 oyuklu bir plakada RPMI 1640 ortamına (1,5 mL / kuyu başına) ekleyin. 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin. Transfeksiyondan 48 saat sonra Sirt3'ün protein ekspresyon seviyesini tespit etmek için Western blot analizi yapın.

8. CCK-8 testi

  1. Hücreler şişenin dibinin %70'ini kapladığında hücreleri hücre süspansiyonuna hazırlayın. Süspansiyondaki hücre sayısını saymak için hücre sayacını kullanın. Konsantrasyonu 2.000 hücre / kuyu sağlayacak şekilde ayarlayın ve her kuyucuk 100 μL RPMI 1640 ortamı içerir. Hücreleri 96 oyuklu plakalara tohumlayın ve 24 saat boyunca% 5 CO2 içeren bir inkübatörde 37 ° C'de tutun. Her grup için 6 çoğaltma kuyusu kurun.
    NOT: Kullanılmayan 96 oyuklu plakaların periferik kuyuları, inkübasyon süresi boyunca buharlaşmayı azaltmak için 200 μL PBS ile doldurulur.
  2. Hücreleri 24 saat kültürledikten sonra, kültür ortamını farklı bir ilaç içeren kültür ortamı ile değiştirin. Hücreleri 48 saat boyunca pozitif ilaç içeren kültür ortamı ve HZJD içeren kültür ortamı ile kültürleyin.
    NOT: Kültür ortamı berraktır. Kültür şişesinin dibini ışıkla inceleyerek, hücrelerin tabakalara bağlandığı görülebilir. Bu fenomen, hücrelerin duvara yapıştığını kanıtlayabilir. Mikroskop altında gözlemlendiğinde, yapışık hücreler şişenin dibindeki mekiklere uzanır ve kültür ortamını sallarken hücreler hareket etmez. Hücreler genellikle kültürden 24 saat sonra duvara yapışır.
  3. İlaç içeren kültür ortamını taze kültür ortamı ile değiştirin. Her bir oyuğa 10 μL CCK-8 çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için, CCK-8 çözeltisini kültür plakası duvarına eğik olarak ekleyin.
  4. 450 nm dalga boyunda bir mikroplaka okuyucu kullanarak her kuyucuğun OD değerini tespit edin.

9. EdU hücre proliferasyon deneyi

  1. Hücreleri adım 7.1'de açıklandığı gibi 96 oyuklu plakalara tohumlayın. Kültür ortamını 48 saat boyunca farklı ilaç içeren kültür ortamı ile değiştirin.
    NOT: Optimal tedavi süresinin ön deneylerle 48 saat olduğu doğrulanmıştır.
  2. Ortamı çıkarın ve hücreleri PBS ile yıkayın. Kuyucuk başına 100 μL kültür ortamı ekleyin. 2x EdU çözeltisini hazırlayın (bkz . Malzeme Tablosu, 20 μM). 3 mL kültür ortamına 6 μL EdU stok çözeltisi ekleyin. Oyuk başına 100 μL 2x EdU çözeltisi (37 °C önceden ısıtılmış) ekleyin ve ardından 2,5 saat inkübe edin.
    NOT: EdU stok çözeltisi, 2x EdU çözeltisini elde etmek için 1:500 oranında seyreltildi. 2x EdU çözeltisinin gerçek hacmi 24 kuyu için 2.4 mL idi.
  3. EdU içeren ortamı çıkarın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca oyuk başına 200 μL% 4 paraformaldehit ekleyin. Paraformaldehiti çıkarın. Hücreleri yıkama solüsyonu ile (PBS'de% 3 sığır serum albümini [BSA]) her biri 3 dakika boyunca 5 dakika durulayın.
  4. Yıkama solüsyonunu çıkarın. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca oyuk başına 200 μL geçirgenleştirme çözeltisi (PBS'de% 0.3 Triton-X 100) ekleyin. Geçirgenlik çözeltisini çıkarın. Hücreleri yıkama solüsyonu ile (PBS'de %3 BSA) 2 kez 5 dakika durulayın.
  5. Çözeltiyi tamamlamak için katkı maddesini 1.3 mL deiyonize su ile çözün. 1.72 mL reaksiyon tamponu, 4 μL azid 488, 80 μLCuS04 ve 200 μL katkı çözeltisi içeren reaksiyon çözeltisini hazırlayın.
  6. Kuyucuk başına 50 μL reaksiyon çözeltisi ekleyin. Numuneleri oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Hücreleri her biri 5 dakika boyunca 3x yıkama solüsyonu ile durulayın.
  7. Yıkama solüsyonunu çıkarın. 200 μL 1x Hoechst 33342 çözeltisi ekleyin ve numuneleri oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika inkübe edin.
  8. Floresan mikroskobunu kullanarak görüntüler elde edin. Kantitatif görüntü analizi yapmak için Image-Pro plus 6.0 yazılımını kullanın.
    NOT: Azide 488'in maksimum uyarma ve emisyon dalga boyları sırasıyla 495 nm ve 519 nm'dir. Hoechst 33342'nin maksimum uyarma ve emisyon dalga boyları sırasıyla 346 nm ve 460 nm'dir.

10. Canlı hücrelerde mitofaji tespiti

  1. Hücreleri, cam tabanlı 24 oyuklu bir plakada oyuk başına 2 x 104 hücre şeklinde tohumlayın. RPMI 1640 besiyeri ile gece boyunca hücrelerin antibiyotiksiz olarak 37 ° C'de% 5 CO2 ile kültürü.
  2. Mtfagy boya çalışma solüsyonunu ve lyso boya çalışma solüsyonunu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız). Mtfaji boya çözeltisini Hanks'in HEPES tamponu ile 100 nM/L'lik bir konsantrasyona seyreltin. Lyso boya çözeltisini Hanks'in HEPES tamponu ile 100 μM/L'lik bir konsantrasyona seyreltin.
  3. Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri Hanks'in HEPES tamponu 2x ile durulayın. 500 μL mtfaji boya işleme solüsyonu (100 nM/L) ekleyin ve ardından 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  4. Hücreleri Hanks'in HEPES tamponu 2x ile durulayın. 500 μL lizo boya işleme çözeltisi (100 μM/L) ekleyin ve ardından 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  5. Hücreleri Hanks'in HEPES tamponu 2x ile durulayın. Konfokal floresan mikroskobu ile mitofaji seviyesini belirleyin.
    NOT: Hücreler boyamadan önce veya sonra herhangi bir fiksasyon olmadan görüntülendi. Görüntüleme işlemi, hücresel durumdaki herhangi bir potansiyel değişikliği veya değişikliği en aza indirmek için mümkün olan en kısa sürede gerçekleştirildi.

11. İstatistiksel analizler

  1. İstatistiksel analizler yapmak için ticari yazılım kullanın. Farklı gruplar arasındaki farkları tek yönlü ANOVA ve ardından LSD post hoc testi ile karşılaştırın. Verileri ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunun. İstatistiksel anlamlılığı P<0.05 olarak ayarlayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

MNNG, hayvan modelinde PLGC ilerlemesini indükler ve GES-1 hücrelerinin morfolojik dönüşümünü teşvik eder

Makroskopik gözlem üzerine, kontrol grubundaki sıçanların mide mukozası, mukozal kıvrımlar doğrusal bir düzende düzenlenmiş, düzgün parlak kırmızı, pürüzsüz ve yumuşak göründü. Kontrol grubundaki sıçanların aksine, model grubundaki sıçanların mide mukozasında solukluk ve pürüzlülük gözlenmiş, m...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

PLGC, kronik gastritten GC'ye ilerlemede anahtar bir süreç olarak hizmet eder. TCM'nin son yıllarda PLGC için umut verici bir tedavi ve müdahale olduğu kanıtlanmıştır24,25. Son yıllarda, TCM, PLGC'nin tedavisi ve müdahalesi için umut verici bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır. Bu, önceki araştırmalarla tutarlıdır10. Patolojik inceleme sonuçları, HZJD kaynatma'nın PLGC sıçanla...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

Bu proje, Çin'in Hebei Eyaleti (H2020423207) Doğa Bilimleri Vakfı tarafından finanse edilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidineShanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHNR030453
3,3’-diaminobenzidineBeijing Zhong Shan-Golden Bridge Biological Technology Co., Ltd., Beijing, CHNZLI0919
Alcian blue periodic acid schiff staining reagent kitBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNG1285
Anti-fade fluorescence mounting mediumBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNS2110
Bicinchoninic acid protein concentration determination kitWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG2026-1000T
CCK-8 reagent kitBoster Biological Engineering co., Ltd., Wuhan, CHNAR1160
Confocal fluorescence microscopyLeica Instruments Co., Ltd., Weztlar, GERTCS-SP8SR
COX figure-materials-1036 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab202554
DAPI staining solutionBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNC0065
DEPCWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG3004
EdU cell proliferation kitBeyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, CHNC0071S
Electrophoresis solutionBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0139
EthanolTianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN64-17-5
FBSGibco Corporation, Gaithersburg, USA16000044
Fluorescence microscopeOlympus Corporation, Tokyo, JPNBH2-RFCA
Foxo3a antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHN23683
GAPDH antibodyWuhan Sanying Biology Technology Co., Ltd., Wuhan, CHN10494-1-AP
Gel preparation kitBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0138
GES-1 cellProcell Life Science&Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNCL-0563
Goat-anti-mouse IgGCST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN4409
Goat-anti-rabbit IgGAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab150077
Hematoxylin-eosin staining solutionZhuhai Beso Biotechnology Co., Ltd., Shenzhen, CHNBA4027
High iron diamine/alcian blue staining reagent kitBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNG2070
ImageJNational Institutes of Health, Bethesda, USA
Image-Pro Plus 6.0 softwareMedia Cybernetics Inc., Maryland, USA
IsopropanolTianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN67-63-0
LC3 antibodyCST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN83506
Loading bufferBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0198
Microplate readerRayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd., Shenzhen, CHNRT6100
MicrotomeLeica Instruments Co., Ltd., Weztlar, GERRM2245
Mitophagy kitDojindo Laboratories, Kyushu Island, JPNMD01-10
Neutral balsamWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNWG10004160
Optical microscopeOlympus Corporation, Tokyo, JPNBH2-RFCA
P62 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab91526
ParaformaldehydeBiosharp Life Sciences, Anhui, CHNBL539A
Parkin antibodyCST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN32833
Penicillin–streptomycinGibco Corporation, Gaithersburg, USA15140122
phosphate-buffered salineWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG0002-15
PVDF membraneMillipore Corporation, Michigan, USAIPVH00010
RedzolSBS Genetech Co., Ltd., Beijing, CHNFTR-50
Reverse transcription reagent kitIgene Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, CHNQP057
RIPA Buffer solutionBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNR002
Roswell Park Memorial InstituteGibco Corporation, Gaithersburg, USA11875093
Silicone needleZhongke Life Biotechnology Co., Ltd., Beijing, CHNTFEP-2
siRNAWuhan Genecreate Biological Engineering Co., Ltd. ,Wuhan,CHN
Sirt3 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHN189860
Sodium salicylateShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHNS104176
Sprague-Dawley ratBeijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd., Beijing, CHN110322210102553975
SYBR quantitative PCR kitWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG3320-15
Tomm20 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab186735
Transferring bufferBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0141
TrichloromethaneShanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHN821112
Tris-buffered saline with Tween 20Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG0004
VDAC1 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab15895
XyleneTianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN1330-20-7
β-actin antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab8226

Referanslar

  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  2. He, J., et al. Helicobacter pylori infection induces stem cell-like properties in Correa cascade of gastric cancer. Cancer Letters. 542, 215764(2022).
  3. Xu, W., Li, B., Xu, M., Yang, T., Hao, X. Traditional Chinese medicine for precancerous lesions of gastric cancer: A review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 146, 112542(2022).
  4. Yang, L., et al. A Systematic Review of the Mechanisms Underlying Treatment of Gastric Precancerous Lesions by Traditional Chinese Medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, 9154738(2020).
  5. Ping, Z., Yan, W., Jing, L., Qian, J., Xin, H. The Effect of Huazhuo Jiedu recipe on Epithelial -Mesenchymal-Transition in Chronic Erosive Gastritis Patients with Zhuoduneiyun syndrome. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (6), 154-158 (2019).
  6. Yan, W., Jing, L., Pan, Z. The effect of Huazhuojiedu formula on HGF/c-Met signal pathway in patients with chronic erosive gastritis. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 33 (02), 186-189 (2017).
  7. Hao, X., et al. Integrating Network Pharmacology and Experimental Validation to Investigate the Mechanisms of Huazhuojiedu Decoction to Treat Chronic Atrophic Gastritis. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, 2638362(2020).
  8. Zhou, P., et al. 16S rRNA sequencing-based evaluation of the protective effects of Hua-Zhuo-Jie-Du on rats with chronic atrophic gastritis. BMC Complementary Medicine and Therapies. 22 (1), 71(2022).
  9. Zhou, P., et al. Determination of the protective effects of Hua-Zhuo-Jie-Du in chronic atrophic gastritis by regulating intestinal microbiota and metabolites: combination of liquid chromatograph mass spectrometer metabolic profiling and 16S rRNA gene sequencing. Chinese Medicine. 16 (1), 37(2021).
  10. Hao, X., Zhou, P., Yang, Z., Yang, T., Wang, Y. The therapeutic effect of Huazhuojiedu decoction on precancerous lesions in a gastric cancer model via the regulation of lnc 517368. Journal of Ethnopharmacology. 283, 114635(2022).
  11. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).
  12. Zhang, C., et al. Parkin, a p53 target gene, mediates the role of p53 in glucose metabolism and the Warburg effect. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16259-16264 (2011).
  13. Cai, T., et al. Protective effects of Weipixiao decoction against MNNG-induced gastric precancerous lesions in rats. Biomedicine & Pharmacotherapy. 120, 109427(2019).
  14. Shah, S. C., Piazuelo, M. B., Kuipers, E. J., Li, D. AGA Clinical Practice Update on the Diagnosis and Management of Atrophic Gastritis: Expert Review. Gastroenterology. 161 (4), 1325-1332 (2021).
  15. Pimentel-Nunes, P., et al. Management of epithelial precancerous conditions and lesions in the stomach (MAPS II): European Society of Gastrointestinal Endoscopy (ESGE), European Helicobacter and Microbiota Study Group (EHMSG), European Society of Pathology (ESP), and Sociedade Portuguesa de Endoscopia Digestiva (SPED) guideline update 2019. Endoscopy. 51 (4), 365-388 (2019).
  16. Nagtegaal, I. D., et al. The 2019 WHO classification of tumours of the digestive system. Histopathology. 76 (2), 182-188 (2020).
  17. Kushima, R. The updated WHO classification of digestive system tumours-gastric adenocarcinoma and dysplasia. Der Pathologe. 43 (1), 8-15 (2022).
  18. Yang, P., et al. Weipiling decoction alleviates N-methyl-N-nitro-N'-nitrosoguanidine-induced gastric precancerous lesions via NF-κB signalling pathway inhibition. Chinese Medicine. 17 (1), 104(2022).
  19. Xu, J., et al. Xiao Tan He Wei Decoction reverses MNNG-induced precancerous lesions of gastric carcinoma in vivo and vitro: Regulation of apoptosis through NF-κB pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 108, 95-102 (2018).
  20. Li, S. Study on the mechanism of regulating NF-kB activity and inhibiting the migration of gastric "inflammation-cancer" transformed cells by invigorating spleen, removing blood stasis and detoxifying. Guangzhou University of Chinese Medicine. , 17-19 (2021).
  21. Liu, H. Research Progress of Cell Models of Gastric Cancer Precancerous Lesions. Traditional Chinese Drug Research and Clinical Pharmacology. 27 (4), 592-596 (2016).
  22. Zheng, J., et al. Chronic stress accelerates the process of gastric precancerous lesions in rats. Journal of Cancer. 12 (14), 4121-4133 (2021).
  23. Yu, W., et al. Sirt3 deficiency exacerbates diabetic cardiac dysfunction: Role of Foxo3A-Parkin-mediated mitophagy. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (8), 1973-1983 (2017).
  24. Cao, Y., et al. Efficacy of Banxia Xiexin decoction for chronic atrophic gastritis: A systematic review and meta-analysis. PLoS One. 15 (10), e0241202(2020).
  25. Yin, J., et al. Weiqi Decoction Attenuated Chronic Atrophic Gastritis with Precancerous Lesion through Regulating Microcirculation Disturbance and HIF-1α Signaling Pathway. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 2651037(2019).
  26. Zhang, J., Wang, X., Wang, F., Tang, X. Xiangsha Liujunzi Decoction improves gastrointestinal motility in functional dyspepsia with spleen deficiency syndrome by restoring mitochondrial quality control homeostasis. Phytomedicine. 105, 154374(2022).
  27. Shida, M., et al. Impaired mitophagy activates mtROS/HIF-1α interplay and increases cancer aggressiveness in gastric cancer cells under hypoxia. International Journal of Oncology. 48 (4), 1379-1390 (2016).
  28. Zhou, X. Y., et al. Inhibition of autophagy blocks cathepsins-tBid-mitochondrial apoptotic signaling pathway via stabilization of lysosomal membrane in ischemic astrocytes. Cell Death & Disease. 8 (2), e2618(2017).
  29. He, R., Peng, J., Yuan, P., Xu, F., Wei, W. Divergent roles of BECN1 in LC3 lipidation and autophagosomal function. Autophagy. 11 (5), 740-747 (2015).
  30. Fernández-Coto, D. L., et al. Quantitative proteomics reveals proteins involved in the progression from non-cancerous lesions to gastric cancer. Journal of Proteomics. 186, 15-27 (2018).
  31. Ding, D., et al. Post-translational modification of Parkin and its research progress in cancer. Cancer Communications. 39 (1), 77(2019).
  32. Wang, Y., et al. The Role of Mitochondrial Dynamics and Mitophagy in Carcinogenesis, Metastasis and Therapy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 413(2020).
  33. Gehrke, S., et al. PINK1 and Parkin control localized translation of respiratory chain component mRNAs on mitochondria outer membrane. Cell Metabolism. 21 (1), 95-108 (2015).
  34. Fu, Z. J., et al. HIF-1α-BNIP3-mediated mitophagy in tubular cells protects against renal ischemia/reperfusion injury. Redox Biology. 36, 101671(2020).
  35. Jia, Q., et al. Hesperidin promotes gastric motility in rats with functional dyspepsia by regulating Drp1-mediated ICC mitophagy. Frontiers in Pharmacology. 13, 945624(2022).
  36. Chen, Y. The N-alkylamides induces MGMT gene hypomethylation in gastric epithelium cells malignant transformation. Zhejiang University. , 33-35 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Huazhuojiedu KaynatmaMide KanseriPrekanser z LezyonlarMitofajiSprague Dawley S anlarH cre ProliferasyonuSirt3Foxo3aParkinLC3 II IP62Tomm20Western BlotRT qPCRmm nohistokimya

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır