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要約

ここでは、マイトファジー制御を使用して胃癌の前癌病変を緩和するHuazhuojiedu煎じ薬(HZJD)の治療効果を実証するプロトコルを紹介します。

要約

この研究は、 in vivo および in vitro の両方で胃がんの前がん病変 (PLGC) を軽減するための Huazhuojiedu 煎じ薬 (HZJD) の治療効果と潜在的なメカニズムを調査することを目的としています。HZJDは、11種類のハーブからなる伝統的な中国のハーブフォーミュラです。Sprague-Dawley(SD)ラットは、対照群、モデル群、陽性薬物群、HZJD群の4つのサブグループにランダムに分けられました。ヘマトキシリン-エオシン(H&E)染色、高鉄ジアミン-アルシアンブルー(HID-AB)染色、アルシアンブルー過ヨウ素酸シッフ(AB-PAS)染色、免疫組織化学、免疫蛍光、RT-qPCR、およびウェスタンブロットアッセイを、HZJD治療の10週間後に実施しました。 In vitroでは、細胞増殖を検出するために、Cell Counting Kit-8(CCK-8)および5-ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU)アッセイを使用しました。RT-qPCRおよびウェスタンブロットアッセイを実施して、マイトファジーレベルを評価しました。その結果、HZJDはPLGCラットの病理学的進行を遅らせ、PLGC細胞の増殖を減少させる可能性があることが示されました。HZJDによる治療により、Sirt3、Foxo3a、Parkin、およびLC3 II/IのmRNAおよびタンパク質発現レベルが大幅に増加し、p62およびTomm20のmRNAおよびタンパク質発現レベルが低下しました。HZJDは、 in vivo および in vitroの両方でマイトファジー活性の低下を逆転させる能力を有することがわかった。結論として、この研究ではHZJDの影響を評価し、その潜在的な分子メカニズムに関する証拠を提供しました。

概要

胃がん(GC)は、依然として世界中で消化器系に影響を与える最も一般的な悪性疾患の1つです。GCは全世界のがんの約6%を占めていると推定されており、がんと診断される頻度が高いがんの中では5位 、がん関連死では3位 にランクされています1。GCは、進行性の多段階の生物学的プロセスとして広く認識されています。GCの発症前に、胃粘膜はしばしば数年間の前癌病変を経験します。これは、胃癌の前癌病変(PLGC)病期と呼ばれます。コレアカスケード理論は広く受け入れられており、正常な粘膜から慢性非萎縮性胃炎、萎縮性胃炎、腸上皮化生(IM)、異形成(Dys)、そして最終的には癌腫2への連続的な進行を説明しています。PLGCはGC発症の重要な段階であり、PLGCのタイムリーな介入とモニタリングは、早期のGC予防に不可欠です。

最近の臨床評価と実験的研究により、伝統的な漢方薬(TCM)がPLGCを治療するための最も効果的な治療法の1つとして浮上していることが確認されています3,4。HZJD煎じ薬は、臨床経験に基づいて開発され、熱と湿気の除去に関するTCM理論に根ざしたTCM処方です。以前の研究では、PLGCの治療、特に臨床症状と病理学的症状の緩和におけるHZJD煎じ薬の有益な効果が実証されています5,6。ネットワーク薬理学関連の研究を通じて、HZJD煎じ薬の有効成分とPLGC7の潜在的な標的を特定しました。以前の研究の結果は、HZJD煎じ薬がPLGCラットの多様性を高め、群集構造を最適化し、腸内細菌叢の相対的な存在量を増加させる能力を持っていることを示しました8。さらに、HZJD煎じ薬が腸内細菌叢とその代謝産物を調節することによりPLGCを改善できることが確認されました9。最近の研究では、HZJD煎じ薬がlnc 51736810の発現をダウンレギュレートすることにより、PLGC細胞の細胞増殖とアポトーシスの動的バランスを制御できることを実証しました。

マイトファジーがさまざまな癌で重要な役割を果たすことが確認された研究の数が増えています。マイトファジーは、損傷した脱分極したミトコンドリアを選択的に排除し、さらに機能不全のミトコンドリアからの細胞傷害性活性酸素種(ROS)の過剰な蓄積を防ぎ、腫瘍形成を阻害します11。損傷したミトコンドリアまたは機能不全のミトコンドリアを選択的に分解するマイトファジーは、ミトコンドリアの酸化的リン酸化(OXPHOS)と複雑に関連しています。マイトファジーの障害または欠如は、細胞エネルギー代謝の好気性解糖へのシフト、一般にワールブルグ効果として知られている現象につながる可能性があります。ワールブルグ効果に起因する乳酸およびケトン体の産生の増加は、細胞増殖を助長する腫瘍微小環境の構築に寄与する12。

この研究は、PLGCの進行を緩和するための治療アプローチとしてHZJD煎じ薬を利用するための包括的なプロトコルを提示します。私たちの評価を通じて、HZJD煎じ薬の有意なプラスの効果、特にマイトファジーを調節する能力が観察されました。この研究は、PLGCの治療におけるHZJD煎じ薬の潜在的な分子メカニズムに関する貴重な洞察を提供します。

プロトコル

すべての実験手順と動物の世話は、河北伝統中国医学大学の施設動物管理および使用委員会のガイドライン(承認番号:DWLL2019031)によって承認され、倫理ガイドラインに従って実施されました。合計90匹の特定の病原体を含まない雄のSprague-Dawley(SD)ラット(年齢= 6週間、体重= 150-180 g、 材料表を参照)を、12時間の制御された暗/明サイクルの下で、一定温度(24°C±4°C)および湿度(50%-60%)で飼育しました。ラットは、実験を開始する前に1週間新しい環境に順応しました。

1. 動物実験の準備

  1. PLGCのラットモデル
    1. ラットを対照群(n = 20)とPLGCモデル群(n = 70)にランダムに割り当てます。対照群のラットに、標準的なげっ歯類のペレット飼料と水 を自由に供給します。PLGCモデル群のラットに不規則な食事(1日絶食、1日給餌)を与えます。
    2. ケージごとに5匹のグループでネズミを収容します。対照群にケージあたり150 g/日の飼料を提供します。PLGC モデル グループが 23 時間 (150 g/日/ケージあたり) 食物に無料でアクセスできるようにします。23時間後、残りのフィードを削除します。
    3. PLGCモデルグループのラットに1-メチル-3-ニトロ-1-ニトロソグアニジン(MNNG)溶液(200μg / mL)を自由飲用10,13に提供します。PLGCモデル群のラットに、ケージあたり200mLのMNNG溶液を提供します。MNNG溶液を不透明な飲料ボトルに入れ、毎日交換してください。
    4. PLGCモデル群のラットを24時間の絶食後(強制経口投与で2日に1回)に2%サリチル酸ナトリウムで強制経口投与します。強制の場合は、針の最小深さが6 cmに等しいシリコン針( 材料の表を参照)を使用します。強制は、午前8時30分から午前9時30分までの午前8時30分の間に同時に一貫して行ってください。
    5. PLGC モデル群から 2 匹のラットを無作為に選択し、12、16、20、24 週目に病理学的検査を行い、PLGC モデルの確立を評価します。9 で説明したように、両方のラットが病理学的評価によって PLGC と診断された場合、モデルは成功したと考えてください。
      1. このモデリングプロセスは約24週間続きます。病理学的評価を 2 人の上級病理医が独立して行えるようにします。2 人の病理学者の共同評価を通じて、ラットの PLGC の病理学的診断を決定します。彼らの診断意見を考慮に入れ、評価プロセス14,15,16,17の際の参考として、以前のガイドラインを使用してください。
  2. HZJD煎じ薬の調製
    1. 7で説明した方法に従ってHZJD煎じ薬を準備します。
      注:HZJD煎じ薬のハーブは、河北省伝統中国医学病院によって購入され、認証されました。
  3. グループ化と薬物介入
    1. PLGCモデルグループをモデルグループ(n = 20)、陽性薬物グループ(n = 20)、およびHuazhuojiedu煎じ薬グループ(HZJD、n = 20、 表1)の3つのサブグループにランダムに分けます。
    2. 正薬群のラットに0.7 mg / kg /日のビタミンB12を強制経口投与します18。HZJDグループのラットを14.81 g / kg/日のHZJD煎じ薬で治療します8。対照群およびモデル群のラットに蒸留水(10 mL/kg)を投与します。4つのグループすべてが1日1回、10週間胃内投与を受けます。
      注:ヒトに対するHZJD煎じ薬の1日推奨用量は142g /日10です。体表面積の計算方法を用いて、ラットの推奨投与量はヒトの6.25倍であると決定される。したがって、ラットのHZJD煎じ薬の1日量は14.81g / kgです。投与量は、ラットの体重に応じて毎週調整されました。最大強制容量は3mLを超えませんでした。
  4. サンプルコレクション
    1. 35週目に24時間の絶食(水への無料アクセス付き)の後、すべてのラットを犠牲にします。すべてのラットにイソフルランを麻酔します(5%誘導、メンテナンス2%、1L /分の流量)。
    2. 腹部を剃り、痛み刺激の喪失を確認した後、エタノールとヨウ素で皮膚を滅菌します。メスで腹部の正中線に沿って剣状軟骨から腹部の皮膚を切り取ります。
    3. 鈍く、胃が露出するまで鉗子とメスで皮下組織を分離します。ハサミでより大きな湾曲に沿って胃を解剖し、すぐにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすいでください。
    4. 氷のプレートに胃の組織を広げます。前庭部、体部、および角領域の曲率の小さい方から胃サンプル(2 mm x 2 mm)を収集します。胃に目に見える病変がある場合は、それらの特定の部分を標本として収集して処理します。
    5. 胃サンプルを4%パラホルムアルデヒドに24時間固定します。残りの胃組織をクライオチューブに入れます。液体窒素で凍結し、-80°Cで保存します。
    6. 二酸化炭素を吸入してラットを安楽死させます。ネズミの死骸を密封された袋に入れ、次に動物の死骸収納キャビネットに袋を入れます。

2. 病理検査

  1. 固定された胃組織をハサミで整え、滑らかにします。グラジエントアルコールシリーズ、すなわち、75%エタノールで30分間、85%エタノールで30分間、95%エタノールで30分間、無水エタノールで2倍各30分間、組織を脱水します。組織をキシレン/エタノール溶液(1:1)に1時間浸し、100%キシレンに2回それぞれ30分間浸します。
  2. 溶融ワックスの半分を型に流し込み、透過処理した組織を素早く型に入れます。組織を溶融ワックスの残りの半分に置きます。埋め込まれたボックスに印を付け、ワックスが完全に固まるまで待ちます。
  3. ミクロトームを使用して、厚さ4μmのスライスにカットします。スライスをスライドに置きます。
  4. スライスを100%キシレンに2回ずつ10分間置き、次にキシレン/エタノール溶液(1:1)に10分間、再び無水エタノールに2回5分間、次に95%エタノールに5分間、続いて85%エタノールに5分間、最後に70%エタノールに5分間入れます。スライスを流水ですすいでください。
  5. スライスをヘマトキシリンで5分間染色します。0.5%塩酸-エタノールに10秒間浸漬して区別します。スライスをエオシンで2分間染色します。
  6. スライスを蒸留水ですすいでください。スライスを勾配アルコールシリーズ、すなわち70%エタノールで30秒、80%エタノールで30秒、95%エタノールで30秒、無水エタノールで30秒で脱水します。スライスを100%キシレン2xで透過処理します。スライスを中性バルサムで密封します。
  7. HID溶液AとHID溶液Bを50:3の比率で混合して、HIDワーキング溶液を調製します。HIDワーキングソリューションでスライスを24時間染色します。
  8. 流水ですすぎ、スライスをアルシアンで20分間染色します。スライスを核速乾溶液で10分間対比染色します。ステップ2.6の説明に従って、スライスを脱水して密封します。
  9. スライスをアルシアンで20分間染色します。スライスを過ヨウ素酸の1%水溶液で5分間インキュベートします。スライスをシフで20分間染色します。
  10. スライドをヘマトキシリンと2分間インキュベートして、核を染色します。酸性分化溶液(HIDキットに付属)を5秒間加えます。スコットブルー溶液を3分間適用して、スライドを青色に着色します。上記の手順2.6で説明したように、スライスを脱水して密封します。
    注:染色プロセスは光から保護する必要があります。過ヨウ素酸の1%水溶液を使用する場合は、温度を22°C未満に保つ必要があります。スライスは、ステップ2.6で説明されているように脱水して密封する必要があります。
  11. 染色されたスライスを光学顕微鏡で10倍と20倍の倍率で調べます。

3. 免疫組織化学

  1. 手順 2.4 で取得したスライスを使用します。スライスを0.01 Mクエン酸ナトリウムバッファーに入れ、10分間加熱して抗原賦活化を行います。
  2. 3%の過酸化水素を30分間添加して、内因性ペルオキシダーゼとビオチンをクエンチします。スライスをヤギの美容液で30分間ブロックします。
  3. sirt3(1:200)、foxo3a(1:100)、およびparkin(1:200)に対する希釈した一次抗体とスライスをインキュベートし、4°Cで一晩。 ネガティブコントロールでは、一次抗体をPBSに置き換えます。
  4. スライスをPBSですすぐごとに5分間3回すすぎます。スライスを対応する二次抗体と室温で1時間インキュベートします。
  5. 20 μLの3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)を3分間加えます。上記の手順2.6で説明したように、スライスを脱水して密封します。
  6. 光学顕微鏡ですべてのスライスを40倍の倍率で画像化します。Image-Pro Plus 6.0ソフトウェアを使用して、定量的な画像分析を行います。

4. 免疫蛍光

  1. 手順3.1で取得したスライスを使用します。手順3.3を繰り返します。
  2. COX IV(1:500)およびLC3(1:500)に対する希釈した一次抗体とスライスをインキュベートし、4°Cで一晩。 スライスをPBSですすぐごとに5分間3回すすぎます。
  3. スライスをヤギ抗ウサギIgG(1:1000)およびヤギ抗マウスIgG(1:1000)と室温で1.5時間インキュベートします。スライスをPBSですすぐごとに5分間3回すすぎます。
  4. DAPI染色液を添加し、暗所で室温で10分間インキュベートします。スライスをPBSですすぐごとに5分間3回すすぎます。
  5. 滴下DAPI染色溶液を添加し、暗所で室温で10分間インキュベートします。スライスを退色防止蛍光封入剤でマウントします。
  6. スライスを蛍光顕微鏡( 材料表を参照)で40倍の倍率で視覚化し、写真を撮ります。

5. ウェスタンブロット解析

  1. 胃組織100mgを正確に秤量します。1 mLのRIPA緩衝液を加えます( 材料の表を参照)。ホモジナイザー(10,000 x g、 3xごとに15秒)を使用して組織を完全に粉砕します。
  2. 組織ホモジネートを氷上に30分間置きます。12,000 x g で4°Cで20分間遠心分離し、上清を回収します。
  3. ビシンコニン酸(BCA)タンパク質濃度測定キットを使用して、タンパク質濃度を定量します( 材料の表を参照)。得られた上清のタンパク質濃度をサンプル内で一貫して調整します。
  4. 10%セパレーションゲルと5%スタッキングゲルからなるSDS-PAGEゲルを調製します。10%分離ゲルをガラスプレートに全高の2/3まで注ぎます。ゲルが固まるまで、脱イオン水をゲルの上に加えます。5%スタッキングジェルを注ぎ、ガラスプレートを充填します。電気泳動コームを挿入します。
    注:ゲルに気泡が入らないように注意する必要があります。
  5. タンパク質上清を5倍ローディングバッファーと1:4の比率で混合します。沸騰したお湯に5分間入れて変性させます。-20°Cで保存してください。
  6. 調製したSDS-PAGEゲルをウェスタンブロッティング電気泳動システムで組み立てます。新しい電気泳動溶液を追加します( 材料の表を参照)。ウェルあたり20 μLのサンプルをゲルにロードします。電気泳動を80Vで40分間開始し、その後120Vに切り替えます。
  7. ゲルを収集し、次のように転写サンドイッチを作成します:2層のスポンジパッド、2層の濾紙、ゲル、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜( 材料の表を参照)、2層の濾紙、2層のスポンジパッド(負極から正極まで)。予冷したトランスファーバッファーを追加します。350mAで2時間ウェットトランスファーを行います。
    注:トランスファーサンドイッチを組み立てる前に、PVDFメンブレンはメタノールで前処理する必要があります。さらに、スポンジ、濾紙、および前処理されたPVDFメンブレンは、事前に転写バッファーに浸漬する必要があります( 材料の表を参照)。
  8. トリス緩衝生理食塩水中の5%脱脂乳でメンブレンをtween 20(TBST)でシェーカーで2時間ブロックします。以下の希釈一次抗体(Sirt3 = 1:500、Foxo3a = 1:1000、Parkin = 1:2000、P62 = 1:1000、LC3 = 1:1000、Tomm20 = 1:2000、β-actin = 1:5000、GAPDH = 1:5000)を用いて、メンブレンを4°Cで一晩インキュベートします。
    注:パーキンの検出の基準としてGAPDHを選択したのは、パーキン(50 kDa)の分子量がβ-アクチン(42 kDa)の分子量に近いためです。
  9. メンブレンをTBSTで4回、毎回5分間洗浄します。希釈した二次抗体(1:5000)と室温で1時間インキュベートします。
  10. ECLワーキング溶液をメンブレンのタンパク質側に2分間滴下します。化学発光イメージングシステムを通じて画像を取得します。ImageJソフトウェアを使用して、グレースケール値を測定します。

6. 定量的リアルタイムPCR解析

  1. すべての実験装置を0.1%ジエチルピロカーボネート(DEPC)で洗浄し、事前に高温高圧で滅菌してください。
  2. 胃組織の50mgを秤量します。1 mLのRedzol( 材料の表を参照)を加え、ホモジナイザーで粉砕します。組織ホモジネートをRNaseフリーの遠心分離チューブに移し、室温で10分間放置します。
  3. トリクロロメタン0.2mLを加え、よく混ぜます。室温で3分間放置します。4°C、12,000 x g で15分間遠心分離します。
  4. 上部水相を慎重に取り出し、0.5 mLのイソプロパノールと10分間混合します。12,000 x g を4°Cで10分間遠心分離し、RNAを沈殿させます。上清を捨ててから、RNA沈殿物を75%エタノールで3回洗浄します。
  5. 7,500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を捨て、滅菌作業台で10分間乾燥RNA沈殿物を沈殿させます。沈殿物を50 μLのDEPCに溶解します。
  6. 1 μg の RNA を cDNA に逆転写します。20x RTase mix 1 μL と 5x RT 反応バッファー 4 μL ( 材料表を参照) を添加し、DEPC を総容量 20 μL まで補充します。反応手順を次のように設定します: 25 °C で 10 分、42 °C で 40 分、85 °C で 10 分、4 °C で保持します。
  7. 2 μL の cDNA、2 μL のフォワードプライマー、2 μL のリバースプライマー (表 2)、10 μL の 2x SYBR プレミックス ( 材料の表を参照)、および 4 μL の DEPC を含む増幅反応混合物を調製します。反応手順は、95°Cで15秒、60°Cで10秒、72°Cで30秒(40サイクル)に設定します。
  8. β-アクチンを内因性リファレンスとして使用します。Ct値を取得します。2-ΔΔCt法を用いて標的遺伝子の相対発現を計算します。

7. 細胞実験の準備

  1. PLGCの細胞モデル
    1. ロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640培地でGES-1細胞を培養し、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンと組み合わせます。1.5 mLのRPMI 1640培地を1.5 mL含有する6ウェルプレートで、1ウェルあたり5 x 105 細胞で細胞を培養し、5% CO2で37°Cで培養します。
    2. 悪性形質転換のためにGES-1細胞をMNNGで誘導します。モデリングの配置を次のように設定します。
      1. 0日目に、GES-1細胞を蘇生して継代し、対数成長期に維持します。log-phase GES-1細胞を培養フラスコに接種し、一晩培養します。
      2. 1日目と2日目に、MNNG(10 μM/L)含有培地を交換します。3日目に、MMNNG含有培地を薬剤を含まない培地と交換します。
      3. 4日目と6日目に、細胞をMNNG(5μM/L)含有培地で24時間処理します。7日目に、MMNG含有培地を薬物を含まない培地と交換します。多数の死にゆく細胞と脱落する細胞を取り除き、細胞培養を続けます。
      4. 8日目と10日目に、MNNG(5μM/L)を含む培地で細胞を24時間処理します。11日目に、PLGC(MC)の細胞モデルを構築します。
        注:モデリング期間中、細胞の状態を定期的に観察する必要があります。細胞の状態が不良な場合は、異なる時間間隔、できれば2日間隔でMNNGで治療することをお勧めします。あるいは、細胞を低用量のMNNG(3 μM/L)で処理することもできます。MC細胞の病理学的診断基準は、細胞の状態を正確に評価するために、先行研究から参照することができる10,19,20,21。
  2. 薬物含有血清の調製
    1. 30匹のSDラット(雄、220 g)に標準的なげっ歯類のペレット飼料 と水を自由に 与えて、すべてのラットの体重が350 gを超えるまで与えます。ラットを陽性の薬物含有血清群(n = 10)、HZJD含有血清群(n = 10)、および正常なラット血清群(n = 10)にランダムに割り当てます。
    2. ステップ1.3.2で説明したようにラットに薬物投与を行います。ラットを毎日 2 回、午前 8:00 と午後 8:00 に投与し、薬物介入を 7 日間継続します。
    3. 8日目(午前8:00)の最後の投与から1時間以内に血液サンプルを採取します。サンプルを4°Cで1時間抗凝固チューブに入れます。3,000 x g で4°Cで15分間遠心分離し、上清を回収します。
  3. 細胞実験のグループ化と介入方法
    1. GES-1群(GES-1)、MC群(MC)、陽性薬物群(陽性薬)、HZJD煎じ薬群(HZJD)、Sirt3サイレンシング群(si-Sirt3)、陰性対照群(si-NC)、およびSirt3サイレンシングとHZJD煎じ薬群(si-Sirt3 + HZJD)の組み合わせ。
    2. 陽性薬物群とHZJD群の細胞を、それぞれ10%ビタミンB12含有血清と10%HZJD含有血清で処理します。10%正常ラット血清を他のグループに投与します。.
      注:以前の研究10に基づいて、10%の薬物含有血清が細胞治療のために選択されました。
    3. si-Sirt3グループおよびsi-Sirt3+HZJDグループの細胞に対してSirt3 si-RNA( 材料表を参照)トランスフェクションを実施します。空のベクトル、すなわちsi-NCを受け取るネガティブコントロールグループを設定します。
    4. 2.5 nM siRNAパワーを125 μLのDEPCに溶解して、siRNA溶液を調製します。5 μL の siRNA 溶液を 250 μL の最小必須培地で希釈し、5 μL の lipofectamine 2000 を 250 μL の最小必須培地で希釈します。それらを均等に混ぜ合わせます。
    5. 混合物を6ウェルプレートのRPMI 1640培地(1.5 mL/ウェルあたり)に加えます。37°Cで5%CO2とインキュベートします。ウェスタンブロット解析を実施して、トランスフェクション後48時間でのSirt3のタンパク質発現レベルを検出します。

8. CCK-8アッセイ

  1. 細胞がボトルの底の70%を覆うときに、細胞を細胞懸濁液に調製します。セルカウンターを使用して、懸濁液中のセルの数をカウントします。濃度を調整して2,000細胞/ウェルを確保し、各ウェルには100μLのRPMI 1640培地が含まれています。細胞を96ウェルプレートに播種し、5% CO2 のインキュベーターで37°Cで24時間維持します。グループごとに 6 つのレプリケートウェルを設定します。
    注:使用されていない96ウェルプレートの周辺ウェルには、インキュベーション期間中の蒸発を減らすために、200μLのPBSが充填されています。
  2. 細胞を24時間培養した後、培地を別の薬剤含有培地と交換します。陽性の薬物含有培地およびHZJD含有培地を用いて細胞を48時間培養する。
    注:培地は透明です。培養ボトルの底を光で観察すると、細胞がシート状につながっていることがわかります。この現象は、細胞が壁に付着したことを証明することができます。顕微鏡で観察すると、付着細胞はボトルの底にあるシャトルに伸びており、培地を振っても細胞は動きません。細胞は通常、培養の24時間後に壁に付着します。
  3. 薬剤を含む培地を新鮮な培地と交換します。各ウェルに10 μLのCCK-8溶液( 材料表を参照)を加え、37°Cで1時間インキュベートします。気泡の形成を避けるために、CCK-8溶液を培養プレートの壁に斜めに加えます。
  4. マイクロプレートリーダーを使用して、450 nmの波長で各ウェルのOD値を検出します。

9. EdU細胞増殖アッセイ

  1. ステップ7.1で説明したように、細胞を96ウェルプレートに播種します。培地を別の薬剤含有培地と48時間交換します。
    注:最適な治療時間は、予備実験を通じて48時間であることが確認されました。
  2. 培地を取り出し、PBSで細胞を洗浄します。ウェルあたり100μLの培地を添加します。2x EdU溶液を調製します( 材料表、20 μMを参照)。6 μLのEdUストック溶液を3 mLの培地に加えます。ウェルあたり100 μLの2x EdU溶液(37°Cに予熱したもの)を加え、2.5時間インキュベートします。
    注:EdUストック溶液を1:500の比率で希釈して、2x EdU溶液を得ました。2x EdU 溶液の実際の容量は、24 ウェルで 2.4 mL でした。
  3. EdUを含むメディアを取り出します。ウェルあたり4%パラホルムアルデヒド200μLを室温で15分間添加し、パラホルムアルデヒドを除去します。細胞を洗浄液(PBS中の3%ウシ血清アルブミン[BSA])で各5分間3回すすぎます。
  4. 洗浄液を取り除きます。ウェルあたり200 μLの透過処理溶液(0.3% Triton-X 100 in PBS)を室温で20分間加えます。透過処理溶液を取り出します。細胞を洗浄液(PBS中の3%BSA)でそれぞれ5分間2回すすぎます。
  5. 添加剤を1.3mLの脱イオン水に溶解して溶液を完成させます。1.72 mLの反応バッファー、4 μLのアジド488、80 μLのCuSO4 、および200 μLの添加剤溶液を含む反応溶液を調製します。
  6. 1ウェルあたり50μLの反応液を添加します。サンプルを室温で30分間、暗所でインキュベートします。細胞を洗浄液で3回、各5分間すすぎます。
  7. 洗浄液を取り除きます。1x Hoechst 33342溶液200 μLを加え、サンプルを室温で暗所で10分間インキュベートします。
  8. 蛍光顕微鏡を使用して画像を取得します。Image-Pro plus 6.0ソフトウェアを使用して、定量的な画像解析を行います。
    注:アジド488の最大励起波長と発光波長は、それぞれ495nmと519nmです。Hoechst 33342の最大励起波長と発光波長は、それぞれ346nmと460nmです。

10. 生細胞におけるマイトファジー検出

  1. ガラス底の24ウェルプレートにウェルあたり2 x 104 個の細胞で細胞を播種します。抗生物質を含まないRPMI 1640培地で細胞を37°C、5%CO2で一晩培養します。
  2. mtphagy染料使用溶液と溶解染料使用溶液を調製します( 材料の表を参照)。mtphagy色素溶液をHanks' HEPESバッファーで100 nM/Lの濃度に希釈し、Hanks' HEPESバッファーで溶解色素溶液を100 μM/Lの濃度に希釈します。
  3. 培地を取り出し、HanksのHEPESバッファー2xで細胞をすすぎます。500 μLのmtphagy色素ワーキング溶液(100 nM/L)を加え、37°Cで30分間インキュベートします。
  4. 細胞をハンクスのHEPESバッファー2xですすいでください。500 μLのリゾ色素ワーキング溶液(100 μM/L)を加え、37 °Cで30分間インキュベートします。
  5. 細胞をハンクスのHEPESバッファー2xですすいでください。共焦点蛍光顕微鏡法によりマイトファジーのレベルを決定します。
    注:細胞は、染色前または染色後に固定せずに画像化しました。イメージングプロセスは、細胞状態の潜在的な変化や変化を最小限に抑えるために、可能な限り迅速に実施されました。

11. 統計分析

  1. 商用ソフトウェアを使用して統計分析を実行します。一元配置分散分析とそれに続くLSD事後検定で、異なるグループ間の差を比較します。データを平均±標準偏差 (SD) として表示します。統計的有意性を P<0.05に設定します。

結果

MNNGは動物モデルでPLGC進行を誘導し、GES-1細胞の形態学的形質転換を促進する

肉眼観察では、対照群のラットの胃粘膜は一様に明るく、滑らかで柔らかく、粘膜のひだは直線状に並んでいるように見えました。対照群のラットとは対照的に、モデル群のラットの胃粘膜は蒼白でざらざらしており、粘膜の粘膜は平らであるか、消失さ?...

ディスカッション

PLGCは、慢性胃炎からGCへの進行における重要なプロセスとして機能します。TCMは、近年24,25でPLGCの有望な治療法および介入であることが証明されています。近年、TCMはPLGCの治療と介入のための有望なアプローチとして浮上しています。これは、以前の研究10と一致しています。病理学的検査の結果、HZJD煎...

開示事項

すべての著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

このプロジェクトは、中国河北省自然科学財団(H2020423207)の資金提供を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidineShanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHNR030453
3,3’-diaminobenzidineBeijing Zhong Shan-Golden Bridge Biological Technology Co., Ltd., Beijing, CHNZLI0919
Alcian blue periodic acid schiff staining reagent kitBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNG1285
Anti-fade fluorescence mounting mediumBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNS2110
Bicinchoninic acid protein concentration determination kitWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG2026-1000T
CCK-8 reagent kitBoster Biological Engineering co., Ltd., Wuhan, CHNAR1160
Confocal fluorescence microscopyLeica Instruments Co., Ltd., Weztlar, GERTCS-SP8SR
COX figure-materials-1036 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab202554
DAPI staining solutionBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNC0065
DEPCWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG3004
EdU cell proliferation kitBeyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, CHNC0071S
Electrophoresis solutionBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0139
EthanolTianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN64-17-5
FBSGibco Corporation, Gaithersburg, USA16000044
Fluorescence microscopeOlympus Corporation, Tokyo, JPNBH2-RFCA
Foxo3a antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHN23683
GAPDH antibodyWuhan Sanying Biology Technology Co., Ltd., Wuhan, CHN10494-1-AP
Gel preparation kitBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0138
GES-1 cellProcell Life Science&Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNCL-0563
Goat-anti-mouse IgGCST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN4409
Goat-anti-rabbit IgGAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab150077
Hematoxylin-eosin staining solutionZhuhai Beso Biotechnology Co., Ltd., Shenzhen, CHNBA4027
High iron diamine/alcian blue staining reagent kitBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNG2070
ImageJNational Institutes of Health, Bethesda, USA
Image-Pro Plus 6.0 softwareMedia Cybernetics Inc., Maryland, USA
IsopropanolTianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN67-63-0
LC3 antibodyCST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN83506
Loading bufferBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0198
Microplate readerRayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd., Shenzhen, CHNRT6100
MicrotomeLeica Instruments Co., Ltd., Weztlar, GERRM2245
Mitophagy kitDojindo Laboratories, Kyushu Island, JPNMD01-10
Neutral balsamWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNWG10004160
Optical microscopeOlympus Corporation, Tokyo, JPNBH2-RFCA
P62 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab91526
ParaformaldehydeBiosharp Life Sciences, Anhui, CHNBL539A
Parkin antibodyCST Biological Reagents Co., Ltd., Shanghai, CHN32833
Penicillin–streptomycinGibco Corporation, Gaithersburg, USA15140122
phosphate-buffered salineWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG0002-15
PVDF membraneMillipore Corporation, Michigan, USAIPVH00010
RedzolSBS Genetech Co., Ltd., Beijing, CHNFTR-50
Reverse transcription reagent kitIgene Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, CHNQP057
RIPA Buffer solutionBeijing Solarbio Technology Co., Ltd., Beijing, CHNR002
Roswell Park Memorial InstituteGibco Corporation, Gaithersburg, USA11875093
Silicone needleZhongke Life Biotechnology Co., Ltd., Beijing, CHNTFEP-2
siRNAWuhan Genecreate Biological Engineering Co., Ltd. ,Wuhan,CHN
Sirt3 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHN189860
Sodium salicylateShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHNS104176
Sprague-Dawley ratBeijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd., Beijing, CHN110322210102553975
SYBR quantitative PCR kitWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG3320-15
Tomm20 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab186735
Transferring bufferBoster Biological Technology co., Ltd., Wuhan, CHNAR0141
TrichloromethaneShanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, CHN821112
Tris-buffered saline with Tween 20Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, CHNG0004
VDAC1 antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab15895
XyleneTianjin Baishi Chemical Industry Co., Ltd., Tianjin, CHN1330-20-7
β-actin antibodyAbcam Trading Co., Ltd., Shanghai, CHNab8226

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