神经损伤大鼠1次推拿干预后24 h内疼痛变化特征

摘要

我们提出了一种使用推拿操作模拟器对轻微慢性缩窄损伤大鼠进行"三手三穴"推拿治疗的方案，并通过行为分析测试疼痛变化和使用酶联免疫吸附测定法测试炎症因子表达的变化来评估 24 小时内推拿的有效镇痛时间点。

摘要

推拿作为中医的外治方法，在临床和基础研究中已被证明对周围神经性疼痛 （pNP） 具有镇痛作用。但推拿镇痛效果的最佳时间点可能因损伤感觉不同而不同，影响推拿镇痛启动机制的探索。

本研究以轻微慢性缩窄损伤 （minor CCI） 模型大鼠模拟 pNP，并使用智能推拿操作模拟器模拟三种方法（按压、拔毛、揉捏）和三种穴位（银门 BL37、成山 BL57 和杨灵泉 GB34）进行推拿治疗。本研究通过检测冷敏阈值 （CST） 、机械撤退阈值 （MWT） 和热撤退潜伏期 （TWL） 评估了轻度 CCI 模型大鼠 24 h 内疼痛的变化和推拿镇痛疗效的最佳时间点。此外，该研究通过 Elisa 检测评估了 IL-10 和 TNF-α 表达变化。结果表明，推拿具有即时和持续的镇痛作用。对于 CST、MWT、TWL 3 个不同的损伤敏感性阈值以及 IL-10 和 TNF-α 2 个细胞因子，干预后 24 h 内推拿的镇痛效果在不同时间点差异显著。

引言

周围神经性疼痛 （pNP） 是指由周围躯体感觉神经系统的病变或疾病引起的疼痛，表现为一系列症状和体征，痛觉过敏是主要症状之一 ^1,2。痛觉过敏是由有害刺激（包括针刺、寒冷和热）引起的疼痛加剧³。已经进行了大型流行病学研究，结果表明 pNP 是最常见的，神经性疼痛的患病率为 6.9%-10%⁴。pNP 可由多种疾病引起，包括神经损伤、带状疱疹后神经痛、痛苦的糖尿病多发性神经病、多发性硬化症、中风、癌症^等5。如今，治疗 pNP 的主要方法是药物治疗，但效果并不理想;而且副作用很大，这是个人和社会经济负担沉重的主要原因⁶。

推拿是一种绿色、经济、安全、有效的中医外治方法⁷.许多临床研究已经证明了推拿对 pNP 的镇痛作用，基础研究已经验证了推拿的即时和累积镇痛作用 ^8,9。推拿的主要累积镇痛机制是降低炎症因子的水平并抑制神经胶质细胞的活化^10,11。既往研究证实了推拿的累积镇痛作用，发现坐骨神经损伤大鼠背根神经节 （DRG） 和脊髓背角 （SDH） 经过 20 次推拿治疗后存在差异表达基因 （DEGs），主要与蛋白结合、压力反应和神经元投射有关¹²。在最近的研究中，已经证实推拿具有立竿见影的镇痛作用，并且 1 次推拿干预可以缓解小 CCI 大鼠的痛觉过敏，特别是更有效地缓解热痛觉过敏¹³。然而，推拿镇痛效果的最佳时间点可能因损伤感觉（冷、热、机械）而异，影响推拿镇痛启动机制的探索。

炎症介质可以致敏和激活疼痛受体，导致放电阈值和异位放电降低，从而促进外周致敏^14,15。周围神经损伤后，TNF-α 是炎症反应的启动剂，可促进 IL-10 和 IL-1β 等炎症因子的合成，引起直接组织炎症损伤，刺激局部神经末梢，引起疼痛 16,17,18。推拿可以通过降低 TNF-α、IL-10、IL-6 和 IL-1β 等炎症因子的表达来达到镇痛作用 19,20,21。本研究选取未成年 CCI 模型大鼠模拟临床 pNP，通过冷敏感阈值 （CST） 、机械撤退阈值 （MWT）、热撤潜伏期 （TWL） 选择不同时间点对 1 次推拿干预后冷、热、机械刺激痛进行行为测试，并通过酶联免疫吸附测定 （ELISA） 选择血清中的 IL-10 和 TNF-α， 以期选择推拿镇痛效果显著的时间点，为后期推拿镇痛的启动机制研究提供依据。

研究方案

北京中医药大学动物保护与使用委员会 （BUCM-4-2022082605-3043） 批准了本研究中使用的所有程序。

1. 动物和研究设计

1. 获得 49 只 8 周龄的雄性 Sprague-Dawley （SD） 大鼠，体重 200 ± 10 克。
2. 采用随机数字表法，将大鼠分为假手术组（n = 7）、模型组（n = 7）、推拿组后立即（n = 7）、推拿组后6 h（n = 7）、推拿组后12 h（n = 7）、推拿组后18 h（n = 7）和推拿组后24 h（n = 7）。

2. 建立次要 CCI 大鼠模型（图 1）

注意:对次要 CCI 进行建模的方法如之前的研究 22,23,24 中所述。

1. 允许 SD 大鼠适应性喂养 7 天。建模前让大鼠禁食 2-3 小时。
2. 将大鼠放入装满 3-5% 异氟醚的盒子中，用麻醉机进行麻醉。麻醉后，将眼药膏涂抹在双眼上以防止干燥。
3. 将大鼠固定在桌子上的俯卧位置，剃掉右髋关节区域的皮毛，并用碘对该区域进行消毒（图 1B）。
4. 通过捏住脚趾确认手术麻醉平面。沿坐骨神经的行走方向做一个约 0.5-1 cm 的皮肤切口，钝化肌肉层，并完全暴露梨状肌的下缘（图 1C）。
5. 将可吸收的铬肠缝合线（4-0 型）松散地系在神经周围，而不会中断神经外血管的血液循环。暴露假组大鼠的坐骨神经 3 分钟而不结扎（图 1A、D、E）。
6. 使用不带针头的注射器将 1 滴 0.9% 氯化钠溶液涂抹在坐骨神经上，以帮助重置它。逐层缝合，给予适量的阿莫西林粉等消炎药，缝合肌肉层1针，缝合皮肤2针（图1F）。
   注意:从步骤 2.3 到步骤 2.6，保持 2%-3% 异氟醚流入大鼠的口鼻以维持麻醉。
7. 让老鼠保持温暖，等待它醒来。将大鼠放回繁殖室。

3. 智能推拿操作模拟器干预（图 2）

注意:治疗从模型建立后的^第 7 天开始。

1. 在计算机操作界面上将仪器参数调整为 4 N 的刺激力、60 次/分钟的刺激频率和 36 °C 的温度。将大鼠放入大鼠固定器中，暴露后肢穴位位置（图 2A，自主研发机器，专利号。ZL 2023 20511277.5）²⁵.
2. 激活仪器以执行按点、拨弦和揉捏方法（表 1）。按推拿组大鼠模型侧的阴门 （BL37）、成山 （BL57） 和阳灵泉 （GB34） 点（表 2）的顺序单击计算机屏幕上显示的压点、拔毛和揉捏（图 2B、C）²⁶。
   1. 对于推拿组，每天进行一次干预，持续 1 天，力为 4 N，频率为 60 次/分钟，每种方法每点共 9 分钟。
   2. 抑制假组和模型组 9 分钟，与推拿组相同。

4. 行为测量

注:干预后，分别在 5 个推拿亚组、模型组和假手术组测试阈值冷敏阈值 （CST）、机械撤退阈值 （MWT） 和热撤退潜伏期 （TWL）。模型组和假手术组的测试时间与推拿组相同（即 24 h）。

1. 冷敏感阈值 （CST）
   1. 将大鼠放在表面温度为 4 ± 1 °C 的智能冷热板疼痛检测器上（单击 START > SET），并用透明塑料笼盖住。
   2. 观察大鼠的探索活动 5 分钟，直到它们适应透明塑料笼。
   3. 观察并记录在接下来的 5 分钟内后肢手术侧的抬足次数。
      注意:不包括由大鼠活动或姿势变化引起的抬脚次数。
2. 机械撤离阈值 （MWT）
   1. 测试前，将大鼠作为网格（0.5 厘米× 0.5 厘米）放在测试箱中底部表面 15-30 分钟。
   2. 将疼痛探头（EVF 5型）移至大鼠右足底后区中心，用手线性增加压力，记录大鼠抬起和时仪器屏幕上显示的阈值。连续测量 5 次，每次测量间隔 10 分钟。
3. 热撤退潜伏期 （TWL）
   1. 将大鼠放入具有玻璃底面的测试箱中，在开始测试前让它适应 15 分钟。
      注意:使用热刺激疼痛仪（PL200 型）检测热收缩足反射的潜伏期。
   2. 设置参数:最大测试时间为 30 s，强度为 50%。单击 START 和 direction 按钮。
   3. 将红外探针移动到大鼠右后足底区域的中心并开始检测。
   4. 记录大鼠抬起和时足部回缩反射的潜伏期。连续测量延迟 5 次，每次测量间隔 10 分钟。

5. 酶联免疫吸附试验

1. 行为测试后，用 35 mL/100 g 4% 水合氯剂量麻醉大鼠腹腔注射麻醉。沿大鼠腹部中部纵向切开皮肤和肌肉，露出其内部器官。
2. 使用镇流器和持针器进行纯分离，识别腹主动脉，采集新鲜血液，并保留样本进行检测。使用分离管分离血清。取血清样品立即检测，或单独包装并存放在 -80°C 的冰箱中。
   注:分离前，让血样凝集 30 分钟。
3. 为测试过程准备大鼠血清，并在室温 （RT） 下储存至少 30 分钟。
4. 为要测试的样品设置空白孔和标准样品孔。向酶联板中加入总共 50 μL 的标准样品。首先加入 40 μL 稀释剂，然后将 10 μL 样品加入待测样品孔中。
   注意:添加样品时，必须将其添加到酶标记孔的底部，确保它们尽可能不接触孔壁，轻轻摇晃并充分混合。空白孔中不包含样品或酶标记试剂，其他步骤相同。样品的最终稀释度为 5 倍。
5. 用密封膜密封板后，将其置于 37 °C 培养箱中 30 分钟。
6. 用蒸馏水稀释 30 倍浓的洗涤液，放在一边。
7. 撕掉密封膜，将液体从孔中倒出，摇干。用洗涤液填充每个孔，静置 30 秒，然后倒出。重复此步骤 5 次，最后摇干。
8. 加入辣根过氧化物酶标记的亲和素（每孔 100 μL）。
9. 向每个孔中加入 50 μL 显色剂 A，然后加入 50 μL 显色剂 B。轻轻摇动和混合，并将其置于 37 °C 环境中避光 10 分钟。
10. 每孔加入 50 μL 终止液以终止反应。
    注意:此时，蓝色将变为黄色。
11. 将空白孔归零，并在 450 nm 的波长下依次测量每个孔的光密度（OD 值）。

结果

CST: 与模型组相比，推拿后 6 h 组抬足次数显著减少，差异有统计学意义 （P < 0.05）。与假手术组相比，模型组的抬足次数显著增加，差异有统计学意义 （P < 0.05）（表 3， 图 3）。

MWT: 与模型组相比，推拿各亚组除推拿后 18 h 外，均显著高于模型组，推拿后 24 h ?...

讨论

该研究使用次要 CCI 模型模拟临床坐骨神经损伤引起的 pNP。次要 CCI 模型涉及通过结扎对神经干进行持续、慢性的压迫和约束，伴有结扎线逐渐肿胀，导致坐骨神经内水肿，并在 3-5 天内形成稳定的慢性疼痛^27,28。在初步研究中，研究组发现，次要 CCI 模型组在建模后的^第 7 天比经典模型组更稳定，使其更适合短期实验设...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	Ruiwode Life Technology Co., Ltd., Shenzhen, China	R500	Animal respiratory anesthesia related equipment
Chromic intestinal suture	Shandong Boda Medical Products Co., Ltd., China	BD210903	An absorbable surgical suture mainly made from collagen protein processed from the intestines of healthy young goats
Electronic Von Frey instrument	Bioseb, USA	BIO-EVF5	An instrument for detecting mechanical withdrawal threshold
Intelligent cold and hot plate pain detector	Anhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd,China.	ZH-6C	An instrument for detecting cold sensitivity threshold
Isoflurane	Ruiwode Life Technology Co., Ltd., Shenzhen, China	R510-22-10	An anesthetic
Multi-function full-wavelength microplate reader	Molecular Devices (Shanghai) Co., Ltd.	SpectraMax M2	An instrument for detecting optical density (OD)
Thermal analgesia device	Chengdu Techman Software Co., Ltd., China	PL-200	An instrument for detecting thermal withdrawal latency