Характеристика болевых изменений у крыс с повреждением нервов в течение 24 часов после однократного вмешательства Туйна

Резюме

Мы представляем протокол с использованием симулятора манипуляции tuina для проведения терапии туиной «Три манипуляции и три акупунктурные точки» у крыс с незначительными хроническими констрикционными травмами и оцениваем эффективные обезболивающие временные точки туины в течение 24 часов путем тестирования изменений боли с помощью поведенческого анализа и изменений экспрессии воспалительных факторов с помощью иммуноферментного анализа.

Аннотация

В клинических и фундаментальных исследованиях было доказано, что туина, как метод наружного лечения в традиционной китайской медицине, оказывает обезболивающее действие на периферическую нейропатическую боль (пНБ). Тем не менее, оптимальный момент времени для обезболивающего эффекта туйны может варьироваться в зависимости от различных ощущений от травмы, что влияет на изучение механизма инициации анальгезии туйны.

В исследовании использовались крысы на модели незначительной хронической констрикционной травмы (незначительная ЧМТ) для моделирования pNP и использовался интеллектуальный симулятор манипуляции туиной для моделирования трех методов (нажатие на точки, выщипывание и разминание) и трех акупунктурных точек (Yinmen BL37, Chengshan BL57 и Yanglingquan GB34) для проведения туйна-терапии. В исследовании оценивали изменения боли в течение 24 ч и оптимальную временную точку для эффективности анальгезии туина у крыс с незначительными моделями ЧМТ путем тестирования порога чувствительности к холоду (CST), порога механической абстиненции (MWT) и латентности термической абстиненции (TWL). Кроме того, в исследовании оценивались изменения экспрессии IL-10 и TNF-α с помощью иммуноферментного анализа. Результаты показывают, что туина обладает как немедленным, так и длительным обезболивающим эффектом. Для трех различных пороговых значений чувствительности к травмам CST, MWT, TWL и двух цитокинов IL-10 и TNF-α анальгетическая эффективность туины в течение 24 ч после вмешательства значительно различается в разные моменты времени.

Введение

Периферическая нейропатическая боль (пНБ) относится к боли, вызванной поражением или заболеванием периферической соматосенсорной нервной системы, проявляющейся в виде ряда симптомов и признаков, с гипералгезией в качестве одного из основных симптомов ^1,2. Гипералгезия — это усиленное переживание боли, вызванное вредным раздражителем, включая укол булавкой, холод и тепло³. Были проведены крупные эпидемиологические исследования, которые показали, что пНЧ является наиболее распространенным заболеванием, с частотой распространенности 6,9%-10% при нейропатической боли⁴. НЧ может быть вызван множественными заболеваниями, включая повреждение нерва, постгерпетическую невралгию, болезненную диабетическую полинейропатию, рассеянный склероз, инсульт, рак и т.д.5. В настоящее время основным методом лечения пНЛ является медикаментозное лечение, но эффект не идеальный; Причем побочные эффекты значительны, что является основной причиной высокой экономической нагрузки на индивидуумов и общество⁶.

Туйна – это экологичный, экономичный, безопасный и эффективный метод наружного лечения традиционной китайской медицины⁷. Многие клинические исследования доказали обезболивающий эффект туины на рНЧ, а основные исследования подтвердили немедленный и кумулятивный анальгетический эффект туины ^8,9. Основным кумулятивным обезболивающим механизмом туйны является снижение уровня воспалительных факторов и ингибирование активации глиальных клеток ^10,11. Предыдущее исследование подтвердило кумулятивный обезболивающий эффект туины и обнаружило дифференциально экспрессируемые гены (DEG) в ганглиях дорсального корешка (DRG) и спинальном дорсальном роге (SDH) крыс с повреждением седалищного нерва после 20-кратного лечения туйна, в основном связанные с связыванием белка, реакцией на давление и проекцией нейронов^. В недавних исследованиях было подтверждено, что туина обладает немедленным обезболивающим эффектом и что однократное вмешательство туина может облегчить гипералгезию у незначительных крыс CCI и особенно^{более эффективно облегчить} термическую гипералгезию. Тем не менее, оптимальный временной момент для обезболивающего эффекта туйны может варьироваться в зависимости от ощущения от травмы (холод, жара, механическое), что влияет на изучение механизма инициации анальгезии туйны.

Медиаторы воспаления могут сенсибилизировать и активировать болевые рецепторы, что приводит к снижению порогов разряда и эктопических разрядов, тем самым способствуя периферической сенсибилизации^14,15. После повреждения периферических нервов TNF-α является инициатором воспалительной реакции, которая может способствовать синтезу воспалительных факторов, таких как IL-10 и IL-1β, вызывая прямое воспалительное повреждение тканей, стимулируя местные нервные окончания и вызывая боль 16,17,18. Туина может достигать обезболивающего эффекта за счет снижения экспрессии воспалительных факторов, таких как TNF-α, IL-10, IL-6 и IL-1β 19,20,21. В исследовании были отобраны малые крысы модели CCI для моделирования клинической пНЧ и выбраны различные временные точки для поведенческого тестирования боли при холодовой, термической и механической стимуляции после 1-разового вмешательства туйна с помощью порога чувствительности к холоду (CST), порога механической абстиненции (MWT), латентности термической абстиненции (TWL), а также выбора IL-10 и TNF-α в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ИФА). Для того, чтобы выбрать момент времени, в который анальгетический эффект туйны является значительным, это дает основу для изучения механизма инициации анальгезии туйна на более поздней стадии.

протокол

Комитет по защите и использованию животных Пекинского университета китайской медицины (BUCM-4-2022082605-3043) одобрил все процедуры, использованные в этом исследовании.

1. Животные и дизайн исследования

1. Получить 49 самцов крыс породы Спрэг-Доули (SD) в возрасте 8 недель, массой 200 ± 10 г.
2. Используя метод таблицы случайных чисел, разделите крыс на фиктивную операционную группу (n = 7), модельную группу (n = 7) и сразу после группы туйна (n = 7), через 6 часов после группы туйна (n = 7), через 12 часов после группы туйна (n = 7), через 18 часов после группы туйна (n = 7) и через 24 часа после группы туйна (n = 7).

2. Создание крысиной модели малой ЧМТ (Рисунок 1)

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод моделирования минорной ЧМТ был таким, как он был описан в предыдущих исследованиях 22,23,24.

1. Разрешить адаптивное кормление крысы SD в течение 7 дней. Дайте крысе поголодать 2-3 часа перед моделированием.
2. Поместите крысу в коробку, наполненную 3-5% изофлураном для обезболивания наркозным аппаратом. После анестезии нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость.
3. Зафиксируйте крысу в положении лежа на столе, сбрейте шерсть в области правого тазобедренного сустава и продезинфицируйте область йодом (рисунок 1В).
4. Подтвердите операционную плоскость анестезии ущипнутием пальца ноги. Сделайте разрез кожи примерно на 0,5-1 см по направлению ходьбы седалищного нерва, тупо отделите мышечный слой и полностью обнажите нижний край грушевидной мышцы (рисунок 1С).
5. Неплотно завяжите рассасывающийся хромовый кишечный шов (тип 4-0) вокруг нерва, не прерывая кровообращение экстраневральных сосудов. Обнажайте седалищный нерв крыс фиктивной группы в течение 3 минут без перевязки (рис. 1A, D, E).
6. С помощью шприца без иглы нанесите 1 каплю 0,9% раствора натрия хлорида на седалищный нерв, чтобы помочь его сбросить. Наложите шов слой за слоем, дайте соответствующее количество противовоспалительного препарата, такого как порошок амоксициллина, зашите мышечный слой 1 стежком и зашите кожу 2 швами (рис. 1F).
   ПРИМЕЧАНИЕ: С шага 2.3 по шаг 2.6 следите за тем, чтобы 2%-3% изофлурана поступало в рот и нос крыс для поддержания анестезии.
7. Держите крысу в тепле и ждите, когда она проснется. Верните крыс в помещение для разведения.

3. Интеллектуальный симулятор манипуляции туиной (Рисунок 2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Лечение началось на^7-й день после установления модели.

1. Отрегулируйте параметры прибора до силы стимуляции 4 Н, частоты стимуляции 60 раз/мин и температуры 36 °C в интерфейсе работы компьютера. Поместите крысу в фиксатор крысы и обнажите расположение акупунктурных точек задних конечностей (рис. 2А, машина собственной разработки, патент No. ZL 2023 20511277.5)²⁵.
2. Активируйте инструмент для выполнения методов нажатия на острие, ощипывания и замешивания (Таблица 1). Нажмите на точки « Нажатие на острие», «Ощипывание» и «Разминание », отображаемые на экране компьютера в последовательности на точках Иньмэнь (BL37), Чэншань (BL57) и Янлинцюань (GB34) (Таблица 2) на модельной стороне крысы группы туйна (Рисунок 2B, C)²⁶.
   1. Для группы туйна выполняйте одно вмешательство один раз в день в течение 1 дня с силой 4 Н, частотой 60 раз/мин и в общей сложности 9 мин на точку на метод.
   2. Удерживайте фиктивную и модельную группы в течение 9 минут, столько же, сколько и группу туина.

4. Поведенческие измерения

ПРИМЕЧАНИЕ: После вмешательства пороговый порог чувствительности к холоду (CST), порог механического поглощения (MWT) и латентность теплового отвода (TWL) были протестированы в 5 подгруппах tuina, модельной группе и группе фиктивных операций соответственно. Время тестирования для модельной и фиктивной групп такое же, как и для группы туина (т.е. 24 ч).

1. Порог чувствительности к холоду (CST)
   1. Поместите крысу на интеллектуальный датчик боли с холодной и горячей пластиной с температурой поверхности 4 ± 1 °C (нажмите на кнопку СТАРТ > СЕТ) и накройте ее прозрачной пластиковой клеткой.
   2. Наблюдайте за исследовательской деятельностью крыс в течение 5 минут, пока они не акклиматизируются в прозрачной пластиковой клетке.
   3. Наблюдайте и записывайте количество подъемов ног на операционной стороне задней конечности в течение следующих 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество подъемов ног, вызванных изменениями в активности или осанке крысы, не учитывается.
2. Механический порог отбора (MWT)
   1. Поместите крысу на нижнюю поверхность в виде сетки (0,5 см × 0,5 см) в тестовый бокс на 15-30 минут перед испытанием.
   2. Переместите зонд боли (тип EVF 5) к центру правой задней подошвенной области крысы, линейно увеличивайте давление рукой и записывайте порог, отображаемый на экране прибора, когда крыса поднимает и облизывает ноги. Измеряйте непрерывно 5 раз, с интервалом измерения 10 мин каждый.
3. Задержка теплоотвода (TWL)
   1. Поместите крысу в тестовый бокс со стеклянной нижней поверхностью и дайте ей адаптироваться в течение 15 минут перед началом теста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скрытый период термосократительного рефлекса стопы определяли с помощью инструмента для термостимуляции боли (тип PL200).
   2. Задайте параметры: максимальное время испытания — 30 с, а интенсивность — 50%. Нажмите на кнопки СТАРТ и направление.
   3. Переместите инфракрасный зонд к центру правой задней подошвенной области крысы и начните обнаружение.
   4. Запишите латентность рефлекса втягивания лап, когда крыса поднимает и облизывает ноги. Измеряйте задержку непрерывно 5 раз с интервалом в 10 минут между каждым измерением.

5. ИФА

1. Обезболить крысу дозой 35 мл/100 г 4% гидрата хлора для внутрибрюшинного инъекционного обезболивания после поведенческого тестирования. Разрежьте кожу и мышцы в продольном направлении вдоль середины живота крысы, чтобы обнажить ее внутренние органы.
2. Используйте балласт и иглодержатель для чистого разделения, определите брюшную аорту, возьмите свежую кровь и сохраните образец для тестирования. Используйте разделительную трубку для отделения сыворотки. Возьмите образец сыворотки для немедленного обнаружения, или упакуйте его отдельно и храните в холодильнике при температуре -80°С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед отделением дайте образцу крови слипнуться в течение 30 минут.
3. Подготовьте сыворотку крови крыс к процессу тестирования и храните ее при комнатной температуре (ОТ) не менее 30 минут.
4. Настройте глухие лунки и стандартные лунки для образца, который будет исследуем. Добавьте в общей сложности 50 мкл стандартных образцов в ферментный планшет. Сначала добавьте 40 μL разбавителя, а затем добавьте 10 μL образца в исследуемую лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При добавлении образцов необходимо добавить их на дно лунки, помеченной ферментом, следя за тем, чтобы они максимально не касались стенки лунки, а также аккуратно встряхнуть и хорошо перемешать. Пустая лунка не содержит образцов или меченых ферментами реагентов, и другие этапы такие же. Итоговое разведение пробы – 5 раз.
5. Запечатав пластину герметизирующей пленкой, поместите ее в инкубатор с температурой 37 °C на 30 минут.
6. Разбавьте в 30 раз концентрированный моющий раствор дистиллированной водой и отставьте в сторону.
7. Снимите герметизирующую пленку, вылейте жидкость из лунки и вытряхните ее насухо. Наполните каждую лунку жидкостью для стирки, дайте ей постоять 30 с, а затем вылейте ее. Повторите этот шаг 5 раз, и, наконец, вытряхните его насухо.
8. Добавьте меченный пероксидазой хрена авидин (100 мкл на лунку).
9. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл проявителя цвета А, затем добавьте 50 мл проявителя цвета В. Осторожно встряхните и перемешайте, а затем поместите в среду при температуре 37 °C на 10 минут в темноте.
10. Добавьте 50 мкл раствора для остановки в лунку, чтобы завершить реакцию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе синий цвет станет желтым.
11. Обнулите холостые лунки и измерьте оптическую плотность (значение наружного диаметра) каждой лунки последовательно на длине волны 450 нм.

Результаты

САНТИСТОКС: По сравнению с модельной группой, количество подъемов ног в группе через 6 ч после туйны было достоверно снижено, и разница была статистически значимой (P < 0,05). По сравнению с фиктивной группой количество подъемов ног в модельной группе было до...

Обсуждение

В исследовании использовалась малая модель ЧМТ для моделирования pNP, вызванного клиническим повреждением седалищного нерва. Малая модель ЧМТ предполагает непрерывную, хроническую компрессию и фиксацию нервного ствола путем лигирования, сопровождающуюся постепенн?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	Ruiwode Life Technology Co., Ltd., Shenzhen, China	R500	Animal respiratory anesthesia related equipment
Chromic intestinal suture	Shandong Boda Medical Products Co., Ltd., China	BD210903	An absorbable surgical suture mainly made from collagen protein processed from the intestines of healthy young goats
Electronic Von Frey instrument	Bioseb, USA	BIO-EVF5	An instrument for detecting mechanical withdrawal threshold
Intelligent cold and hot plate pain detector	Anhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd,China.	ZH-6C	An instrument for detecting cold sensitivity threshold
Isoflurane	Ruiwode Life Technology Co., Ltd., Shenzhen, China	R510-22-10	An anesthetic
Multi-function full-wavelength microplate reader	Molecular Devices (Shanghai) Co., Ltd.	SpectraMax M2	An instrument for detecting optical density (OD)
Thermal analgesia device	Chengdu Techman Software Co., Ltd., China	PL-200	An instrument for detecting thermal withdrawal latency