Caractéristiques des changements de douleur chez les rats atteints de lésions nerveuses dans les 24 heures suivant une intervention unique de Tuina

Résumé

Nous présentons un protocole utilisant le simulateur de manipulation du tuina pour effectuer la thérapie au tuina « Three-Manipulation and Three-Acupoint » pour les rats ayant subi des lésions mineures de constriction chronique et évaluons les points de temps analgésiques efficaces du tuina dans les 24 heures en testant les changements de douleur par l’analyse comportementale et les changements dans l’expression du facteur inflammatoire à l’aide d’un test immuno-enzymatique.

Résumé

La recherche clinique et fondamentale a prouvé que le tuina, en tant que méthode de traitement externe de la médecine traditionnelle chinoise, a un effet analgésique sur la douleur neuropathique périphérique (NPN). Cependant, le moment optimal pour l’effet analgésique du tuina peut varier en fonction des différentes sensations de blessure, affectant l’exploration du mécanisme d’initiation de l’analgésie du tuina.

La recherche a utilisé des rats modèles de lésions de constriction chronique mineures (CCI mineurs) pour simuler la pNP et a utilisé le simulateur intelligent de manipulation de tuina pour simuler les trois méthodes (pression ponctuelle, épilation et pétrissage) et trois points d’acupuncture (Yinmen BL37, Chengshan BL57 et Yanglingquan GB34) pour effectuer la thérapie au tuina. L’étude a évalué les changements de la douleur dans les 24 heures et le point temporel optimal pour l’efficacité de l’analgésie tuina chez les rats avec des modèles CCI mineurs en testant le seuil de sensibilité au froid (CST), le seuil de retrait mécanique (MWT) et la latence de retrait thermique (TWL). De plus, l’étude a évalué les changements d’expression de l’IL-10 et du TNF-α grâce à la détection d’Elisa. Les résultats montrent que le tuina a des effets analgésiques immédiats et durables. Pour les trois seuils de sensibilité aux lésions différents que sont le CST, le MWT, le TWL et les deux cytokines de l’IL-10 et du TNF-α, l’efficacité analgésique du tuina dans les 24 heures suivant l’intervention est significativement différente à différents moments.

Introduction

La douleur neuropathique périphérique (NPN) fait référence à la douleur causée par une lésion ou une maladie du système nerveux somatosensoriel périphérique, se manifestant par une série de symptômes et de signes, l’hyperalgésie étant l’un des principaux symptômes ^1,2. L’hyperalgésie est une expérience accrue de la douleur causée par un stimulus nocif, notamment la piqûre d’épingle, le froid et la chaleur³. De vastes études épidémiologiques ont été menées, qui montrent que la pNP est la plus courante, avec un taux de prévalence de 6,9 % à 10 % dans la douleur neuropathique⁴. La NPp peut être causée par de multiples maladies, notamment une lésion du nerf, une névralgie post-zostérienne, une polyneuropathie diabétique douloureuse, une sclérose en plaques, un accident vasculaire cérébral, un cancer, ^etc.5. De nos jours, la principale méthode de traitement de la NPN est la médication, mais l’effet n’est pas idéal ; Et les effets secondaires sont importants, ce qui est la principale raison de la charge économique élevée sur les individus et la société⁶.

Le tuina est une méthode de traitement externe verte, économique, sûre et efficace de la médecine traditionnelle chinoise⁷. De nombreuses études cliniques ont prouvé l’effet analgésique du tuina sur la NPN, et des études fondamentales ont vérifié les effets analgésiques immédiats et cumulatifs du tuina ^8,9. Le principal mécanisme analgésique cumulatif du tuina est de réduire les niveaux de facteurs inflammatoires et d’inhiber l’activation des cellules gliales^10,11. Les recherches précédentes ont confirmé l’effet analgésique cumulatif du tuina et ont trouvé des gènes exprimés différentiellement (DEG) dans les ganglions de la racine dorsale (DRG) et la corne dorsale spinale (SDH) de rats atteints de lésions du nerf sciatique après 20 fois de traitement au tuina, principalement liés à la liaison aux protéines, à la réponse à la pression et à la projection neuronale¹². Dans des études récentes, il a été confirmé que le tuina a un effet analgésique immédiat et qu’une intervention unique du tuina pourrait atténuer l’hyperalgésie des rats CCI mineurs et surtout soulager l’hyperalgésie thermique plus efficacement¹³. Cependant, le moment optimal pour l’effet analgésique du tuina peut varier en fonction de la sensation de blessure (froid, chaleur, mécanique), affectant l’exploration du mécanisme d’initiation de l’analgésie du tuina.

Les médiateurs inflammatoires peuvent sensibiliser et activer les récepteurs de la douleur, entraînant une diminution des seuils de décharge et des décharges ectopiques, contribuant ainsi à la sensibilisation périphérique^14,15. Après une lésion nerveuse périphérique, le TNF-α est un initiateur de la réponse inflammatoire, ce qui peut favoriser la synthèse de facteurs inflammatoires tels que l’IL-10 et l’IL-1β, provoquant des lésions inflammatoires tissulaires directes, stimulant les terminaisons nerveuses locales et provoquant des douleurs 16,17,18. Le tuina peut obtenir des effets analgésiques en réduisant l’expression de facteurs inflammatoires tels que le TNF-α, l’IL-10, l’IL-6 et l’IL-1β 19,20,21. L’étude a sélectionné des rats modèles mineurs CCI pour simuler la NPN clinique et a sélectionné différents points temporels pour les tests comportementaux de la douleur par stimulation froide, thermique et mécanique après une intervention tuina 1 fois par seuil de sensibilité au froid (CST), seuil de retrait mécanique (MWT), latence de retrait thermique (TWL), et a choisi IL-10 et TNF-α dans le sérum par test immuno-enzymatique (ELISA), Afin de sélectionner le moment où l’effet analgésique du tuina est significatif, fournissant une base pour l’étude du mécanisme d’initiation de l’analgésie du tuina à un stade ultérieur.

Protocole

Le Comité sur la protection et l’utilisation des animaux de l’Université de médecine chinoise de Pékin (BUCM-4-2022082605-3043) a approuvé toutes les procédures utilisées dans cette étude.

1. Animaux et conception de l’étude

1. Obtenez 49 rats Sprague-Dawley (SD) mâles de 8 semaines, pesant 200 ± 10 g.
2. À l’aide d’une méthode de table de nombres aléatoires, divisez les rats en un groupe d’opérations fictives (n = 7), un groupe modèle (n = 7) et immédiatement après le groupe tuina (n = 7), 6 h après le groupe tuina (n = 7), 12 h après le groupe tuina (n = 7), 18 h après le groupe tuina (n = 7) et 24 h après le groupe tuina (n = 7).

2. Etablissement d’un modèle de CCI mineur chez le rat (Figure 1)

REMARQUE : La méthode de modélisation de l’ICC mineure était celle décrite dans les études précédentes 22,23,24.

1. Permettre l’alimentation adaptative du rat SD pendant 7 jours. Laissez le rat jeûner pendant 2-3 h avant de modeler.
2. Placez le rat dans une boîte remplie de 3 à 5 % d’isoflurane pour l’anesthésie à l’aide d’un appareil d’anesthésie. Après l’anesthésie, appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour éviter le dessèchement.
3. Fixez le rat en position couchée sur une table, rasez la fourrure de la zone de l’articulation de la hanche droite et désinfectez la zone avec de l’iode (Figure 1B).
4. Confirmez le plan chirurgical de l’anesthésie par un pincement des orteils. Faites une incision cutanée d’environ 0,5 à 1 cm dans le sens de marche du nerf sciatique, séparez brusquement la couche musculaire et exposez complètement le bord inférieur du muscle piriforme (Figure 1C).
5. Attachez sans serrer une suture intestinale chromée résorbable (type 4-0) autour du nerf sans interrompre la circulation sanguine des vaisseaux extraneuraux. Exposer le nerf sciatique de rats du groupe placebo pendant 3 minutes sans ligature (Figure 1A, D, E).
6. Utilisez une seringue sans aiguille pour appliquer 1 goutte de solution de chlorure de sodium à 0,9 % sur le nerf sciatique pour aider à le réinitialiser. Suture couche par couche, donnez une quantité appropriée d’anti-inflammatoire tel que la poudre d’amoxicilline, suturez la couche musculaire avec 1 point de suture et suturez la peau avec 2 points de suture (Figure 1F).
   REMARQUE : De l’étape 2.3 à l’étape 2.6, faites en sorte que 2 % à 3 % d’isoflurane s’écoule dans la bouche et le nez des rats pour maintenir l’anesthésie.
7. Gardez le rat au chaud et attendez qu’il se réveille. Remettez les rats dans la salle d’élevage.

3. Intervention sur simulateur de manipulation intelligente de tuina (Figure 2)

REMARQUE : Le traitement a commencé le 7^ème jour après l’établissement du modèle.

1. Réglez les paramètres de l’instrument sur une force de stimulation de 4 N, une fréquence de stimulation de 60 fois/min et une température de 36 °C sur l’interface de fonctionnement de l’ordinateur. Placez le rat dans le fixateur de rat et exposez l’emplacement des points d’acupuncture des membres postérieurs (Figure 2A, machine auto-développée, brevet n°. ZL 2023 20511277.5)²⁵.
2. Activez l’instrument pour effectuer les méthodes de pressage ponctuel, de pincement et de pétrissage (Tableau 1). Cliquez sur les points Pressing, Plucking et Kneading affichés sur l’écran de l’ordinateur dans l’ordre sur les points Yinmen (BL37), Chengshan (BL57) et Yanglingquan (GB34) (Tableau 2) du côté modèle du rat du groupe tuina (Figure 2B, C)²⁶.
   1. Pour le groupe tuina, effectuez une intervention une fois par jour pendant 1 jour, avec une force de 4 N, une fréquence de 60 fois/min, et un total de 9 min par point et par méthode.
   2. Limitez les groupes simulé et modèle pendant 9 min, avec le même nombre de fois que le groupe tuina.

4. Mesure comportementale

REMARQUE : Après l’intervention, le seuil de sensibilité au froid (CST), le seuil de retrait mécanique (MWT) et la latence de retrait thermique (TWL) ont été testés dans les 5 sous-groupes de tuina, le groupe de modèles et le groupe d’opération fictive, respectivement. Le temps d’essai pour le groupe modèle et le groupe simulé est le même que celui du groupe tuina (c.-à-d. 24 h).

1. Seuil de sensibilité au froid (CST)
   1. Placez le rat sur un détecteur de douleur intelligent à plaque froide et chaude avec une température de surface de 4 ± 1 °C (cliquez sur START > SET), et couvrez-le d’une cage en plastique transparent.
   2. Observez les activités d’exploration des rats pendant 5 minutes jusqu’à ce qu’ils se soient acclimatés à la cage en plastique transparent.
   3. Observez et notez le nombre de levées de pieds du côté opératoire du membre postérieur dans les 5 minutes suivantes.
      REMARQUE : Le nombre de levées de pieds causées par des changements dans l’activité ou la posture du rat n’est pas inclus.
2. Seuil de retrait mécanique (MWT)
   1. Placez le rat sur la surface inférieure sous forme de grille (0,5 cm × 0,5 cm) dans une boîte de test pendant 15 à 30 minutes avant de tester.
   2. Déplacez la sonde de la douleur (type EVF 5) au centre de la région plantaire postérieure droite du rat, augmentez linéairement la pression à la main et enregistrez le seuil affiché sur l’écran de l’instrument lorsque le rat lève et lèche ses pattes. Mesurez en continu 5 fois, avec un intervalle de mesure de 10 minutes chacune.
3. Latence de retrait thermique (TWL)
   1. Placez le rat dans une boîte de test avec une surface inférieure en verre et laissez-le s’adapter pendant 15 minutes avant de commencer le test.
      REMARQUE : La période de latence du réflexe du pied de contraction thermique a été détectée à l’aide d’un instrument de stimulation thermique de la douleur (type PL200).
   2. Paramètres définis : la durée maximale du test est de 30 s et l’intensité est de 50 %. Cliquez sur les boutons START et direction.
   3. Déplacez la sonde infrarouge au centre de la région plantaire postérieure droite du rat et lancez la détection.
   4. Enregistrez la latence du réflexe de rétraction du pied lorsque le rat se lève et se lèche les pattes. Mesurez la latence en continu 5 fois, avec un intervalle de 10 min entre chaque mesure.

5. L’ELISA

1. Anesthésier le rat avec une dose de 35 mL/100 g d’hydrate de chlore à 4 % pour une anesthésie par injection intrapéritonéale après un test comportemental. Coupez la peau et les muscles longitudinalement le long du milieu de l’abdomen du rat pour exposer ses organes internes.
2. Utilisez un lest et un porte-aiguille pour une séparation pure, identifiez l’aorte abdominale, prélevez du sang frais et conservez un échantillon pour les tests. Utilisez un tube de séparation pour séparer le sérum. Prélevez l’échantillon de sérum pour une détection immédiate, ou emballez-le séparément et conservez-le dans un réfrigérateur à -80 ° C.
   REMARQUE : Avant de séparer, laissez l’échantillon de sang s’agglutiner pendant 30 min.
3. Préparez le sérum de rats pour le processus de test et conservez-le à température ambiante (RT) pendant au moins 30 min.
4. Configurez des puits vierges et des puits d’échantillon standard pour l’échantillon à analyser. Ajouter un total de 50 μL d’échantillons étalons dans la plaque liée à des enzymes. Ajoutez d’abord 40 μL de diluant, puis ajoutez 10 μL d’échantillon dans le puits d’échantillonnage à analyser.
   REMARQUE : Lors de l’ajout d’échantillons, il est nécessaire de les ajouter au fond du puits marqué par l’enzyme, en veillant à ce qu’ils ne touchent pas la paroi du puits autant que possible, et de bien agiter et mélanger. Le puits vierge ne contient pas d’échantillons ou de réactifs marqués aux enzymes, et les autres étapes sont les mêmes. La dilution finale de l’échantillon est de 5 fois.
5. Après avoir scellé la plaque avec un film d’étanchéité, placez-la dans un incubateur à 37 °C pendant 30 min.
6. Diluez 30 fois la solution de lavage concentrée avec de l’eau distillée et mettez-la de côté.
7. Retirez le film d’étanchéité, versez le liquide du puits et secouez-le pour le sécher. Remplissez chaque puits de liquide vaisselle, laissez-le reposer pendant 30 s, puis versez-le. Répétez cette étape 5 fois, et enfin, secouez-le pour le sécher.
8. Ajouter l’avidine de raifort marquée à la peroxydase (100 μL par puits).
9. Ajoutez 50 μL de révélateur de couleur A dans chaque puits, puis ajoutez 50 μL de révélateur de couleur B. Agitez et mélangez doucement, puis placez-le dans un environnement à 37 °C pendant 10 min dans l’obscurité.
10. Ajouter 50 μL de la solution d’arrêt par puits pour mettre fin à la réaction.
    REMARQUE : À ce stade, la couleur bleue deviendra jaune.
11. Mettez à zéro les puits vides et mesurez la densité optique (valeur OD) de chaque puits en séquence à une longueur d’onde de 450 nm.

Résultats

CST: Par rapport au groupe modèle, le nombre de soulèvements de pieds dans le groupe 6 h après le tuina était significativement réduit, et la différence était statistiquement significative (P < 0,05). Comparativement au groupe fictif, le nombre de soulèvements de pieds dans le groupe modèle a augmenté de façon significative, et la différence était statistiquement significative (P < 0,05) (tableau 3, fig...

Discussion

L’étude a utilisé le modèle CCI mineur pour simuler la NPN causée par une lésion clinique du nerf sciatique. Le modèle CCI mineur implique la compression et la contention continues et chroniques du tronc nerveux par ligature, accompagnées d’un gonflement progressif de la ligature, entraînant un œdème dans le nerf sciatique et formant une douleur chronique stable en 3 à 5 jours ^27,28. Dans l’étude préliminaire, ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	Ruiwode Life Technology Co., Ltd., Shenzhen, China	R500	Animal respiratory anesthesia related equipment
Chromic intestinal suture	Shandong Boda Medical Products Co., Ltd., China	BD210903	An absorbable surgical suture mainly made from collagen protein processed from the intestines of healthy young goats
Electronic Von Frey instrument	Bioseb, USA	BIO-EVF5	An instrument for detecting mechanical withdrawal threshold
Intelligent cold and hot plate pain detector	Anhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd,China.	ZH-6C	An instrument for detecting cold sensitivity threshold
Isoflurane	Ruiwode Life Technology Co., Ltd., Shenzhen, China	R510-22-10	An anesthetic
Multi-function full-wavelength microplate reader	Molecular Devices (Shanghai) Co., Ltd.	SpectraMax M2	An instrument for detecting optical density (OD)
Thermal analgesia device	Chengdu Techman Software Co., Ltd., China	PL-200	An instrument for detecting thermal withdrawal latency