Merkmale der Schmerzveränderungen bei Ratten mit Nervenverletzung innerhalb von 24 Stunden nach einmaliger Tuina-Intervention

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll unter Verwendung des Tuina-Manipulationssimulators zur Durchführung der "Drei-Manipulation und Drei-Akupunktur"-Tuina-Therapie für Ratten mit leichten chronischen Verengungsverletzungen und bewerten die effektiven analgetischen Zeitpunkte von Tuina innerhalb von 24 Stunden, indem wir Schmerzveränderungen durch Verhaltensanalyse und Veränderungen der Entzündungsfaktorexpression mit einem enzymgebundenen Immunsorbent-Assay testen.

Zusammenfassung

Tuina als äußere Behandlungsmethode der Traditionellen Chinesischen Medizin hat in der klinischen und Grundlagenforschung nachweislich eine schmerzlindernde Wirkung bei peripheren neuropathischen Schmerzen (pNP). Der optimale Zeitpunkt für die analgetische Wirkung von Tuina kann jedoch je nach Verletzungsempfindung variieren, was sich auf die Erforschung des Initiationsmechanismus der Tuina-Analgesie auswirkt.

Die Forschung verwendete Modellratten mit geringfügiger chronischer Verengungsverletzung (Minor CCI), um pNP zu simulieren, und verwendete den intelligenten Tuina-Manipulationssimulator, um die drei Methoden (Punktdrücken, Zupfen und Kneten) und drei Akupunkturpunkte (Yinmen BL37, Chengshan BL57 und Yanglingquan GB34) zur Durchführung der Tuina-Therapie zu simulieren. Die Studie untersuchte die Veränderungen der Schmerzen innerhalb von 24 Stunden und den optimalen Zeitpunkt für die Wirksamkeit der Tuina-Analgesie bei Ratten mit kleineren CCI-Modellen, indem sie die Kältesensitivitätsschwelle (CST), die mechanische Entzugsschwelle (MWT) und die thermische Entzugslatenz (TWL) testete. Darüber hinaus wurden in der Studie IL-10- und TNF-α-Expressionsänderungen durch Elisa-Detektion untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass Tuina sowohl unmittelbare als auch anhaltende analgetische Wirkungen hat. Für die drei unterschiedlichen Verletzungsempfindlichkeitsschwellen von CST, MWT, TWL und zwei Zytokinen IL-10 und TNF-α ist die analgetische Wirksamkeit von Tuina innerhalb von 24 h nach der Intervention zu verschiedenen Zeitpunkten signifikant unterschiedlich.

Einleitung

Periphere neuropathische Schmerzen (pNP) beziehen sich auf Schmerzen, die durch eine Läsion oder Erkrankung des peripheren somatosensorischen Nervensystems verursacht werden und sich in einer Reihe von Symptomen und Anzeichen manifestieren, wobei Hyperalgesie eines der Hauptsymptome ist ^1,2. Hyperalgesie ist eine erhöhte Schmerzerfahrung, die durch einen schädlichen Reiz verursacht wird, einschließlich Nadelstich, Kälte und Hitze³. Es wurden große epidemiologische Studien durchgeführt, die zeigen, dass pNP mit einer Prävalenzrate von 6,9 % bis 10 % bei neuropathischen Schmerzen am häufigsten ist⁴. pNP kann durch mehrere Krankheiten verursacht werden, darunter Verletzungen des Nervs, postherpetische Neuralgien, schmerzhafte diabetische Polyneuropathie, Multiple Sklerose, Schlaganfall, Krebs ^usw.5. Heutzutage ist die Hauptmethode zur Behandlung von pNP die Medikation, aber die Wirkung ist nicht ideal. Und die Nebenwirkungen sind erheblich, was der Hauptgrund für die hohe wirtschaftliche Belastung des Einzelnen und der Gesellschaft ist⁶.

Tuina ist eine grüne, wirtschaftliche, sichere und effektive äußere Behandlungsmethode der Traditionellen Chinesischen Medizin⁷. Viele klinische Studien haben die analgetische Wirkung von Tuina auf den pNP bewiesen, und Grundlagenstudien haben die unmittelbare und kumulative analgetische Wirkung von Tuina^{bestätigt 8,9}. Der wichtigste kumulative analgetische Mechanismus von Tuina besteht darin, die Entzündungsfaktoren zu reduzieren und die Aktivierung von Gliazellen zu hemmen^10,11. Die vorangegangene Forschung bestätigte die kumulative analgetische Wirkung von Tuina und fand differentiell exprimierte Gene (DEGs) in den Spinalganglien (DRG) und im Spinalhorn (SDH) von Ratten mit Ischiasnervenverletzung nach 20-maliger Tuina-Behandlung, die hauptsächlich mit der Proteinbindung, der Druckreaktion und der neuronalen Projektion zusammenhingen¹². In neueren Studien wurde bestätigt, dass Tuina eine unmittelbare analgetische Wirkung hat und dass eine einmalige Tuina-Intervention die Hyperalgesie von Ratten mit kleinem CCI lindern und insbesondere die thermische Hyperalgesie effektiver lindern kann¹³. Der optimale Zeitpunkt für die analgetische Wirkung von Tuina kann jedoch je nach Verletzungsempfinden (Kälte, Hitze, mechanisch) variieren, was sich auf die Erforschung des Initiationsmechanismus der Tuina-Analgesie auswirkt.

Entzündungsmediatoren können Schmerzrezeptoren sensibilisieren und aktivieren, was zu einer Verringerung der Entladungsschwellen und ektopischen Entladungen führt und so zur peripheren Sensibilisierung beiträgt^14,15. Nach einer peripheren Nervenverletzung ist TNF-α ein Initiator der Entzündungsreaktion, die die Synthese von Entzündungsfaktoren wie IL-10 und IL-1β fördern kann, was zu einer direkten Entzündung des Gewebes führt, lokale Nervenenden stimuliert und Schmerzen verursacht 16,17,18. Tuina kann analgetische Wirkungen erzielen, indem es die Expression von Entzündungsfaktoren wie TNF-α, IL-10, IL-6 und IL-1β reduziert 19,20,21. Die Studie wählte kleinere CCI-Modellratten aus, um klinische pNP zu simulieren, und wählte verschiedene Zeitpunkte für die Verhaltenstestung von Kälte-, thermischen und mechanischen Stimulationsschmerzen nach einer 1-maligen Tuina-Intervention durch Kältesensitivitätsschwelle (CST), mechanische Entzugsschwelle (MWT), thermische Entzugslatenz (TWL) und Auswahl von IL-10 und TNF-α im Serum durch Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA). Um den Zeitpunkt auszuwählen, zu dem die analgetische Wirkung von Tuina signifikant ist, bietet dies eine Grundlage für die Untersuchung des Initiationsmechanismus der Tuina-Analgesie im späteren Stadium.

Protokoll

Das Komitee für Tierschutz und Tierverwendung der Beijing University of Chinese Medicine (BUCM-4-2022082605-3043) genehmigte alle in dieser Studie verwendeten Verfahren.

1. Tiere und Studiendesign

1. Man erhält 49 männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten im Alter von 8 Wochen mit einem Gewicht von 200 ± 10 g.
2. Teilen Sie die Ratten mit Hilfe einer Zufallszahlentabelle in eine Schein-Operationsgruppe (n = 7), eine Modellgruppe (n = 7) und unmittelbar nach der Tuina-Gruppe (n = 7), 6 h nach der Tuina-Gruppe (n = 7), 12 h nach der Tuina-Gruppe (n = 7), 18 h nach der Tuina-Gruppe (n = 7) und 24 h nach der Tuina-Gruppe (n = 7) ein.

2. Etablierung eines Rattenmodells für die geringe GKI (Abbildung 1)

HINWEIS: Die Methode zur Modellierung des kleinen CCI war wie in früheren Studien^beschrieben 22,23,24.

1. Ermöglicht die adaptive Fütterung von SD-Ratten für 7 Tage. Lassen Sie die Ratte 2-3 h fasten, bevor Sie modellieren.
2. Legen Sie die Ratte in eine mit 3-5% Isofluran gefüllte Schachtel für die Anästhesie mit einem Anästhesiegerät. Tragen Sie nach der Narkose eine Augensalbe auf beide Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
3. Fixieren Sie die Ratte in Bauchlage auf einem Tisch, rasieren Sie das Fell des rechten Hüftgelenksbereichs und desinfizieren Sie den Bereich mit Jod (Abbildung 1B).
4. Bestätigen Sie die chirurgische Ebene der Anästhesie durch ein Zehenkneifen. Machen Sie einen Hautschnitt von ca. 0,5 bis 1 cm entlang der Gehrichtung des Ischiasnervs, trennen Sie die Muskelschicht stumpf ab und legen Sie den unteren Rand des Piriformis-Muskels vollständig frei (Abbildung 1C).
5. Binden Sie eine resorbierbare Chrom-Darmnaht (Typ 4-0) locker um den Nerv, ohne die Durchblutung der extraneuralen Gefäße zu unterbrechen. Der Ischiasnerv von Ratten der Scheingruppe wird 3 Minuten lang ohne Ligatur freigelegt (Abbildung 1A,D,E).
6. Verwenden Sie eine Spritze ohne Nadel, um 1 Tropfen 0,9% ige Natriumchloridlösung auf den Ischiasnerv aufzutragen, um ihn wieder in Ordnung zu bringen. Naht Schicht für Schicht, geben Sie eine angemessene Menge an entzündungshemmendem Medikament wie Amoxicillin-Pulver, nähen Sie die Muskelschicht mit 1 Stich und nähen Sie die Haut mit 2 Stichen (Abbildung 1F).
   HINWEIS: Lassen Sie von Schritt 2.3 bis Schritt 2.6 2%-3% Isofluran in Mund und Nase der Ratten fließen, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten.
7. Halten Sie die Ratte warm und warten Sie, bis sie aufwacht. Bringen Sie die Ratten in den Zuchtraum zurück.

3. Intelligente Intervention des Tuina-Manipulationssimulators (Abbildung 2)

HINWEIS: Die Behandlung begann am 7^. Tag nach der Etablierung des Modells.

1. Stellen Sie die Geräteparameter auf eine Stimulationskraft von 4 N, eine Stimulationsfrequenz von 60 Mal/min und eine Temperatur von 36 °C an der Bedienoberfläche des Computers ein. Setzen Sie die Ratte in den Rattenfixateur ein und legen Sie die Position der Akupunkturpunkte der hinteren Gliedmaßen frei (Abbildung 2A, selbst entwickeltes Gerät, Patent-Nr. ZL 2023 20511277.5)²⁵.
2. Aktivieren Sie das Instrument, um die Methoden des Punktdrückens, Zupfens und Kneten auszuführen (Tabelle 1). Klicken Sie auf das Punktdrücken, Zupfen und Kneten , das auf dem Computerbildschirm in der Reihenfolge auf den Punkten Yinmen (BL37), Chengshan (BL57) und Yanglingquan (GB34) (Tabelle 2) auf der Modellseite der Ratte der Tuina-Gruppe angezeigt wird (Abbildung 2B, C)²⁶.
   1. Führen Sie für die Tuina-Gruppe 1 Tag lang einmal täglich einen Eingriff mit einer Kraft von 4 N, einer Häufigkeit von 60 Mal/Minute und insgesamt 9 Minuten pro Punkt und Methode durch.
   2. Halten Sie die Schein- und Modellgruppen 9 Minuten lang fest, mit der gleichen Anzahl von Malen wie die Tuina-Gruppe.

4. Messung des Verhaltens

HINWEIS: Nach der Intervention wurden die Schwellenwerte für die Kälteempfindlichkeit (CST), die mechanische Entnahmeschwelle (MWT) und die thermische Entnahmelatenz (TWL) in den 5 Tuina-Untergruppen, der Modellgruppe bzw. der Scheinoperationsgruppe getestet. Die Testzeit für die Modell- und Scheingruppen ist die gleiche wie für die Tuina-Gruppe (d. h. 24 Stunden).

1. Kälteempfindlichkeitsschwelle (CST)
   1. Setzen Sie die Ratte auf einen intelligenten Kalt- und Heizplatten-Schmerzdetektor mit einer Oberflächentemperatur von 4 ± 1 °C (Klicken Sie auf START > SET) und decken Sie ihn mit einem durchsichtigen Kunststoffkäfig ab.
   2. Beobachten Sie die Erkundungsaktivitäten der Ratten 5 Minuten lang, bis sie sich an den durchsichtigen Plastikkäfig gewöhnt haben.
   3. Beobachten und protokollieren Sie die Anzahl der Fußhebungen auf der Operationsseite der hinteren Gliedmaße innerhalb der nächsten 5 Minuten.
      HINWEIS: Die Anzahl der Fußhebungen, die durch Veränderungen der Aktivität oder Haltung der Ratte verursacht werden, ist nicht enthalten.
2. Mechanische Entnahmeschwelle (MWT)
   1. Legen Sie die Ratte vor dem Test als Gitter (0,5 cm × 0,5 cm) auf die Unterseite in eine Testbox für 15-30 Minuten.
   2. Bewegen Sie die Schmerzsonde (Typ EVF 5) in die Mitte der rechten hinteren Plantarregion der Ratte, erhöhen Sie den Druck linear mit der Hand und notieren Sie den Schwellenwert, der auf dem Instrumentenbildschirm angezeigt wird, wenn die Ratte ihre Füße anhebt und leckt. Messen Sie kontinuierlich 5 Mal mit einem Messintervall von jeweils 10 Minuten.
3. Thermische Entzugslatenz (TWL)
   1. Legen Sie die Ratte in eine Testbox mit Glasboden und lassen Sie sie 15 Minuten lang anpassen, bevor Sie mit dem Test beginnen.
      HINWEIS: Die latente Periode der thermischen Kontraktion des Fußreflexes wurde mit einem thermischen Stimulationsschmerzinstrument (Typ PL200) festgestellt.
   2. Parameter einstellen: Die maximale Testzeit beträgt 30 s und die Intensität 50 %. Klicken Sie auf die Schaltflächen START und Richtung.
   3. Bewegen Sie die Infrarotsonde in die Mitte der rechten hinteren Plantarregion der Ratte und starten Sie die Erkennung.
   4. Erfassen Sie die Latenz des Fußrückzugsreflexes, wenn die Ratte ihre Füße hebt und leckt. Messen Sie die Latenz kontinuierlich 5 Mal, mit einem Intervall von 10 Minuten zwischen den einzelnen Messungen.

5. ELISA

1. Betäuben Sie die Ratte mit einer Dosis von 35 ml/100 g 4% Chlorhydrat für die intraperitoneale Injektionsanästhesie nach Verhaltenstests. Schneiden Sie die Haut und die Muskeln in Längsrichtung entlang der Mitte des Bauches der Ratte, um ihre inneren Organe freizulegen.
2. Verwenden Sie einen Ballast- und Nadelhalter für die reine Trennung, identifizieren Sie die Bauchschlagader und entnehmen Sie frisches Blut und bewahren Sie eine Probe für den Test auf. Verwenden Sie ein Trennröhrchen, um das Serum zu trennen. Entnehmen Sie die Serumprobe zum sofortigen Nachweis, oder verpacken Sie sie separat und lagern Sie sie im Kühlschrank bei -80 ° C.
   HINWEIS: Lassen Sie die Blutprobe vor dem Trennen 30 Minuten lang verklumpen.
3. Bereiten Sie das Serum von Ratten für den Testprozess vor und lagern Sie es mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur (RT).
4. Richten Sie leere Vertiefungen und Standard-Probenvertiefungen für die zu testende Probe ein. Geben Sie insgesamt 50 μL der Standardproben in die enzymverknüpfte Platte. Geben Sie zuerst 40 μl Verdünnungsmittel hinzu und geben Sie dann 10 μl Probe in die zu testende Probenvertiefung.
   HINWEIS: Beim Hinzufügen von Proben ist es notwendig, diese auf den Boden der enzymmarkierten Vertiefung zu geben, wobei darauf zu achten ist, dass sie die Wand der Vertiefung so wenig wie möglich berühren, und vorsichtig zu schütteln und gut zu mischen. Die Blindvertiefung enthält keine Proben oder enzymmarkierten Reagenzien, und die anderen Schritte sind die gleichen. Die endgültige Verdünnung der Probe beträgt das 5-fache.
5. Nachdem Sie die Platte mit einer Siegelfolie versiegelt haben, legen Sie sie für 30 min in einen 37 °C heißen Inkubator.
6. Verdünnen Sie die konzentrierte Waschlösung 30-mal mit destilliertem Wasser und stellen Sie sie beiseite.
7. Entfernen Sie die Dichtungsfolie, gießen Sie die Flüssigkeit aus der Vertiefung und schütteln Sie sie trocken. Füllen Sie jede Mulde mit Waschmittel, lassen Sie es 30 s ziehen und gießen Sie es dann aus. Wiederholen Sie diesen Schritt 5 Mal und schütteln Sie ihn abschließend trocken.
8. Fügen Sie Meerrettichperoxidase-markiertes Avidin (100 μl pro Well) hinzu.
9. Geben Sie 50 μl Farbentwickler A in jede Vertiefung und fügen Sie dann 50 μl Farbentwickler B hinzu. Schütteln und mischen Sie es vorsichtig und stellen Sie es 10 Minuten lang im Dunkeln in eine Umgebung von 37 °C.
10. Geben Sie 50 μl der Stopplösung pro Vertiefung hinzu, um die Reaktion zu beenden.
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt wird die blaue Farbe gelb.
11. Nullen Sie die leeren Vertiefungen und messen Sie die optische Dichte (OD-Wert) jeder Vertiefung nacheinander bei einer Wellenlänge von 450 nm.

Ergebnisse

CST: Im Vergleich zur Modellgruppe war die Anzahl der Fußhebungen in der Gruppe 6 h nach Tuina signifikant reduziert, und die Differenz war statistisch signifikant (P < 0,05). Im Vergleich zur Scheingruppe war die Anzahl der Fußhebungen in der Modellgruppe signifikant erhöht, und die Differenz war statistisch signifikant (P < 0,05) (Tabelle 3, Abbildung 3).

...

Diskussion

In der Studie wurde das Minor-CCI-Modell verwendet, um eine pNP zu simulieren, die durch eine klinische Ischiasnervenverletzung verursacht wird. Das Minor-CCI-Modell beinhaltet die kontinuierliche, chronische Kompression und Fixierung des Nervenstamms durch Ligatur, begleitet von einer allmählichen Schwellung der Ligatur, was zu Ödemen im Ischiasnerv führt und in 3-5 Tagen stabile chronische Schmerzen bildet^27,28. In der Vorst...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	Ruiwode Life Technology Co., Ltd., Shenzhen, China	R500	Animal respiratory anesthesia related equipment
Chromic intestinal suture	Shandong Boda Medical Products Co., Ltd., China	BD210903	An absorbable surgical suture mainly made from collagen protein processed from the intestines of healthy young goats
Electronic Von Frey instrument	Bioseb, USA	BIO-EVF5	An instrument for detecting mechanical withdrawal threshold
Intelligent cold and hot plate pain detector	Anhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd,China.	ZH-6C	An instrument for detecting cold sensitivity threshold
Isoflurane	Ruiwode Life Technology Co., Ltd., Shenzhen, China	R510-22-10	An anesthetic
Multi-function full-wavelength microplate reader	Molecular Devices (Shanghai) Co., Ltd.	SpectraMax M2	An instrument for detecting optical density (OD)
Thermal analgesia device	Chengdu Techman Software Co., Ltd., China	PL-200	An instrument for detecting thermal withdrawal latency