Características das alterações da dor em ratos com lesão nervosa dentro de 24 horas após intervenção única de Tuina

Resumo

Apresentamos um protocolo usando o simulador de manipulação de tuina para realizar a terapia de tuina "Three-Manipulation and Three-Acupoint" para ratos com lesão crônica menor e avaliamos os pontos de tempo analgésicos efetivos de tuina em 24 h, testando alterações de dor por meio de análise comportamental e alterações na expressão de fatores inflamatórios usando ensaio imunoenzimático.

Resumo

A tuina, como método de tratamento externo da medicina tradicional chinesa, provou ter um efeito analgésico na dor neuropática periférica (pNP) em pesquisas clínicas e básicas. No entanto, o momento ideal para o efeito analgésico da tuina pode variar de acordo com as diferentes sensações de lesão, afetando a exploração do mecanismo de iniciação da analgesia da tuina.

A pesquisa usou ratos modelo de lesão crônica menor (CCI menor) para simular pNP e usou o simulador inteligente de manipulação de tuina para simular os três métodos (pressionar, arrancar e amassar) e três pontos de acupuntura (Yinmen BL37, Chengshan BL57 e Yanglingquan GB34) para realizar a terapia de tuina. O estudo avaliou as mudanças na dor em 24 h e o ponto de tempo ideal para a eficácia da analgesia tuina em ratos com modelos CCI menores, testando o limiar de sensibilidade ao frio (CST), o limiar de retirada mecânica (MWT) e a latência de retirada térmica (TWL). Além disso, o estudo avaliou as alterações na expressão de IL-10 e TNF-α por meio da detecção de Elisa. Os resultados mostram que a tuina tem efeitos analgésicos imediatos e sustentados. Para os três diferentes limiares de sensibilidade à lesão de CST, MWT, TWL e duas citocinas de IL-10 e TNF-α, a eficácia analgésica da tuina dentro de 24 h após a intervenção é significativamente diferente em diferentes momentos.

Introdução

A dor neuropática periférica (NPp) refere-se à dor causada por uma lesão ou doença do sistema nervoso somatossensorial periférico, manifestada como uma série de sintomas e sinais, sendo a hiperalgesia um dos principais sintomas ^1,2. A hiperalgesia é uma experiência intensificada de dor causada por um estímulo nocivo, incluindo picada de agulha, frio e calor³. Grandes estudos epidemiológicos têm sido realizados, mostrando que a pNP é a mais comum, com uma taxa de prevalência de 6,9%-10% na dor neuropática⁴. A pNP pode ser causada por várias doenças, incluindo lesão do nervo, neuralgia pós-herpética, polineuropatia diabética dolorosa, esclerose múltipla, acidente vascular cerebral, câncer, ^etc.5. Hoje em dia, o principal método para tratar a pNP é a medicação, mas o efeito não é o ideal; e os efeitos colaterais são significativos, o que é a principal razão para a alta carga econômica sobre os indivíduos e a sociedade⁶.

A tuina é um método de tratamento externo verde, econômico, seguro e eficaz da medicina tradicional chinesa⁷. Muitos estudos clínicos comprovaram o efeito analgésico da tuina sobre a pNP, e estudos básicos verificaram os efeitos analgésicos imediatos e cumulativos da tuina ^8,9. O principal mecanismo analgésico cumulativo da tuina é reduzir os níveis de fatores inflamatórios e inibir a ativação das células gliais^10,11. A pesquisa anterior confirmou o efeito analgésico cumulativo da tuina e encontrou genes diferencialmente expressos (DEGs) nos gânglios da raiz dorsal (DRG) e no corno dorsal espinhal (SDH) de ratos com lesão do nervo ciático após 20 vezes de tratamento com tuina, principalmente relacionados à ligação às proteínas, resposta à pressão e projeção neuronal¹². Em estudos recentes, foi confirmado que a tuina tem um efeito analgésico imediato e que a intervenção de 1 vez na tuina poderia aliviar a hiperalgesia de ratos CCI menores e, especialmente, aliviar a hiperalgesia térmica de forma mais eficaz¹³. No entanto, o momento ideal para o efeito analgésico da tuina pode variar dependendo da sensação de lesão (frio, calor, mecânica), afetando a exploração do mecanismo de iniciação da analgesia da tuina.

Os mediadores inflamatórios podem sensibilizar e ativar os receptores de dor, levando à diminuição dos limiares de descarga e descargas ectópicas, contribuindo para a sensibilização periférica^14,15. Após a lesão do nervo periférico, o TNF-α é um iniciador da resposta inflamatória, que pode promover a síntese de fatores inflamatórios como IL-10 e IL-1β, causando lesão inflamatória tecidual direta, estimulando as terminações nervosas locais e causando dor 16,17,18. A tuina pode alcançar efeitos analgésicos reduzindo a expressão de fatores inflamatórios como TNF-α, IL-10, IL-6 e IL-1β 19,20,21. O estudo selecionou ratos modelo CCI menores para simular pNP clínico e selecionou diferentes pontos de tempo para testes comportamentais de dor de estimulação fria, térmica e mecânica após uma intervenção de tuina 1 vez por limiar de sensibilidade ao frio (CST), limiar de retirada mecânica (MWT), latência de retirada térmica (TWL) e escolha IL-10 e TNF-α no soro por ensaio imunoenzimático (ELISA), a fim de selecionar o ponto de tempo em que o efeito analgésico da tuina é significativo, fornecendo uma base para o estudo do mecanismo de iniciação da analgesia da tuina na fase posterior.

Protocolo

O Comitê de Proteção e Uso Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (BUCM-4-2022082605-3043) aprovou todos os procedimentos usados neste estudo.

1. Animais e desenho do estudo

1. Obter 49 ratos Sprague-Dawley (SD) machos de 8 semanas de idade, pesando 200 ± 10 g.
2. Usando um método de tabela de números aleatórios, divida os ratos em um grupo de operação simulada (n = 7), um grupo modelo (n = 7) e imediatamente após o grupo de tuina (n = 7), 6 h após o grupo de tuina (n = 7), 12 h após o grupo de tuina (n = 7), 18 h após o grupo de tuina (n = 7) e 24 h após o grupo de tuina (n = 7).

2. Estabelecimento de um modelo de rato de ICC menor (Figura 1)

NOTA: O método de modelagem do ICC menor foi descrito em estudos anteriores 22,23,24.

1. Permitir alimentação adaptativa de rato SD por 7 dias. Deixe o rato jejuar por 2-3 h antes de modelar.
2. Coloque o rato em uma caixa cheia de isoflurano a 3-5% para anestesia por uma máquina de anestesia. Após a anestesia, aplique uma pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento.
3. Fixe o rato em decúbito ventral sobre uma mesa, raspe o pelo da área da articulação do quadril direito e desinfete a área com iodo (Figura 1B).
4. Confirme o plano cirúrgico da anestesia com uma pitada no dedo do pé. Faça uma incisão na pele de aproximadamente 0,5-1 cm ao longo da direção de caminhada do nervo ciático, separe sem corte a camada muscular e exponha totalmente a borda inferior do músculo piriforme (Figura 1C).
5. Amarre frouxamente uma sutura intestinal de cromo absorvível (tipo 4-0) ao redor do nervo sem interromper a circulação sanguínea dos vasos extraneurais. Exponha o nervo ciático de ratos do grupo simulado por 3 minutos sem ligadura (Figura 1A, D, E).
6. Use uma seringa sem agulha para aplicar 1 gota de solução de cloreto de sódio a 0,9% no nervo ciático para ajudar a redefini-lo. Sutura camada por camada, dê uma quantidade adequada de medicamento anti-inflamatório, como pó de amoxicilina, suture a camada muscular com 1 ponto e suture a pele com 2 pontos (Figura 1F).
   NOTA: Da etapa 2.3 à etapa 2.6, mantenha o isoflurano a 2% a 3% fluindo para a boca e nariz dos ratos para manter a anestesia.
7. Mantenha o rato aquecido e espere que ele acorde. Devolva os ratos para a sala de reprodução.

3. Intervenção do simulador de manipulação inteligente de tuina (Figura 2)

NOTA: O tratamento foi iniciado no^7º dia após o estabelecimento do modelo.

1. Ajuste os parâmetros do instrumento para uma força de estimulação de 4 N, uma frequência de estimulação de 60 vezes/min e uma temperatura de 36 °C na interface de operação do computador. Coloque o rato no fixador de ratos e exponha a localização dos pontos de acupuntura dos membros posteriores (Figura 2A, máquina autodesenvolvida, patente nº. ZL 2023 20511277.5)²⁵.
2. Ative o instrumento para executar os métodos de pressionamento, dedilhar e amassar (Tabela 1). Clique no Point-Pressing, Plucking, and Amassar , exibido na tela do computador na sequência nos pontos Yinmen (BL37), Chengshan (BL57) e Yanglingquan (GB34) (Tabela 2) no lado do modelo do rato do grupo tuina (Figura 2B, C)²⁶.
   1. Para o grupo tuina, realizar uma intervenção uma vez ao dia durante 1 dia, com força de 4 N, frequência de 60 vezes/min e total de 9 min por ponto por método.
   2. Restrinja os grupos simulado e modelo por 9 min, com o mesmo número de vezes que o grupo tuina.

4. Medição comportamental

NOTA: Após a intervenção, o limiar de sensibilidade ao frio (CST), o limiar de retirada mecânica (MWT) e a latência de retirada térmica (TWL) foram testados nos 5 subgrupos de tuina, grupo modelo e grupo de operação simulada, respectivamente. O tempo de teste para os grupos modelo e simulado é o mesmo que para o grupo tuina (ou seja, 24 h).

1. Limiar de sensibilidade ao frio (CST)
   1. Coloque o rato em um detector inteligente de dor com placa fria e quente com temperatura de superfície de 4 ± 1 °C (clique em INICIAR > SET) e cubra-o com uma gaiola de plástico transparente.
   2. Observe as atividades exploratórias dos ratos por 5 minutos até que eles sejam aclimatados à gaiola de plástico transparente.
   3. Observe e registre o número de elevações do pé no lado operatório do membro posterior nos próximos 5 minutos.
      NOTA: O número de elevações de pés causadas por mudanças na atividade ou postura do rato não está incluído.
2. Limiar de retirada mecânica (MWT)
   1. Coloque o rato na superfície inferior como uma grade (0,5 cm × 0,5 cm) em uma caixa de teste por 15-30 min antes do teste.
   2. Mova a sonda da dor (tipo EVF 5) para o centro da região plantar posterior direita do rato, aumente linearmente a pressão com a mão e registre o limiar exibido na tela do instrumento quando o rato levantar e lamber os pés. Meça continuamente 5 vezes, com um intervalo de medição de 10 min cada.
3. Latência de retirada térmica (TWL)
   1. Coloque o rato em uma caixa de teste com uma superfície de fundo de vidro e deixe-o se adaptar por 15 minutos antes de iniciar o teste.
      NOTA: O período latente de contração térmica do reflexo podal foi detectado usando um instrumento de estimulação térmica da dor (tipo PL200).
   2. Definir parâmetros: o tempo máximo de teste é de 30 s e a intensidade é de 50%. Clique nos botões INICIAR e direção.
   3. Mova a sonda infravermelha para o centro da região plantar posterior direita do rato e inicie a detecção.
   4. Registre a latência do reflexo de retração do pé quando o rato levanta e lambe os pés. Meça a latência continuamente 5 vezes, com um intervalo de 10 min entre cada medição.

5. ELISA

1. Anestesiar o rato com uma dose de 35 mL / 100 g de hidrato de cloro a 4% para anestesia por injeção intraperitoneal após testes comportamentais. Corte a pele e os músculos longitudinalmente ao longo do meio do abdômen do rato para expor seus órgãos internos.
2. Use um suporte de lastro e agulha para separação pura, identifique a aorta abdominal, colete sangue fresco e mantenha uma amostra para teste. Use um tubo de separação para separar o soro. Pegue a amostra de soro para detecção imediata ou embale-a separadamente e guarde-a na geladeira a -80 ° C.
   NOTA: Antes de separar, deixe a amostra de sangue aglutinar por 30 min.
3. Prepare o soro de ratos para o processo de teste e armazene-os em temperatura ambiente (RT) por pelo menos 30 min.
4. Configure poços em branco e poços de amostra padrão para a amostra a ser testada. Adicione um total de 50 μL das amostras padrão à placa enzimática. Adicione 40 μL de diluente primeiro e, em seguida, adicione 10 μL de amostra ao poço de amostra a ser testado.
   NOTA: Ao adicionar amostras, é necessário adicioná-las ao fundo do poço marcado com enzima, garantindo que não toquem a parede do poço o máximo possível, e agitar suavemente e misturar bem. O poço em branco não contém amostras ou reagentes marcados com enzimas, e as outras etapas são as mesmas. A diluição final da amostra é de 5 vezes.
5. Depois de selar a placa com uma película de vedação, coloque-a em uma incubadora a 37 °C por 30 min.
6. Diluir 30 vezes a solução de lavagem concentrada com água destilada e reserve.
7. Remova o filme de vedação, despeje o líquido do poço e sacuda-o para secar. Encha cada poço com detergente, deixe repousar por 30 s e depois despeje. Repita esta etapa 5 vezes e, por fim, sacuda-a para secar.
8. Adicione avidina marcada com peroxidase de rábano (100 μL por poço).
9. Adicione 50 μL de revelador de cor A a cada poço e, em seguida, adicione 50 μL de revelador de cor B. Agite e misture suavemente e coloque-o em um ambiente a 37 ° C por 10 min no escuro.
10. Adicione 50 μL da solução de parada por poço para encerrar a reação.
    NOTA: Neste ponto, a cor azul ficará amarela.
11. Zerar os alvéolos em branco e medir a densidade óptica (valor OD) de cada poço em sequência a um comprimento de onda de 450 nm.

Resultados

CST: Em comparação com o grupo modelo, o número de levantamentos de pés no grupo 6 h após a tuina foi significativamente reduzido, e a diferença foi estatisticamente significativa (P < 0,05). Em comparação com o grupo simulado, o número de elevações de pés no grupo modelo aumentou significativamente e a diferença foi estatisticamente significativa (P < 0,05) (Tabela 3, Figura 3).

Discussão

O estudo utilizou o modelo CCI menor para simular o pNP causado por lesão clínica do nervo ciático. O modelo CCI menor envolve a compressão e contenção contínua e crônica do tronco nervoso por meio da ligadura, acompanhada pelo inchaço gradual da ligadura, resultando em edema dentro do nervo ciático e formando dor crônica estável em 3-5 dias^27,28. No estudo preliminar, o grupo de pesquisa descobriu que o grupo de mode...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	Ruiwode Life Technology Co., Ltd., Shenzhen, China	R500	Animal respiratory anesthesia related equipment
Chromic intestinal suture	Shandong Boda Medical Products Co., Ltd., China	BD210903	An absorbable surgical suture mainly made from collagen protein processed from the intestines of healthy young goats
Electronic Von Frey instrument	Bioseb, USA	BIO-EVF5	An instrument for detecting mechanical withdrawal threshold
Intelligent cold and hot plate pain detector	Anhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd,China.	ZH-6C	An instrument for detecting cold sensitivity threshold
Isoflurane	Ruiwode Life Technology Co., Ltd., Shenzhen, China	R510-22-10	An anesthetic
Multi-function full-wavelength microplate reader	Molecular Devices (Shanghai) Co., Ltd.	SpectraMax M2	An instrument for detecting optical density (OD)
Thermal analgesia device	Chengdu Techman Software Co., Ltd., China	PL-200	An instrument for detecting thermal withdrawal latency