מאפייני שינויי כאב בחולדות עם פגיעה עצבית תוך 24 שעות לאחר התערבות חד פעמית בטווינה

Summary

אנו מציגים פרוטוקול המשתמש בסימולטור מניפולציה של טווינה כדי לבצע את הטיפול בטווינה "שלוש מניפולציות ושלוש נקודות דיקור" עבור חולדות עם פציעות כרוניות קלות של התכווצות, ולהעריך את נקודות הזמן היעילות לשיכוך כאבים של טווינה תוך 24 שעות על ידי בדיקת שינויים בכאב באמצעות ניתוח התנהגותי ושינויים בביטוי גורמים דלקתיים באמצעות בדיקת אימונוסורבנט המקושרת לאנזים.

Abstract

טווינה, כשיטת טיפול חיצונית של הרפואה הסינית המסורתית, הוכחה כבעלת השפעה משככת כאבים על כאב נוירופתי היקפי (pNP) במחקר קליני ובסיסי. עם זאת, נקודת הזמן האופטימלית עבור אפקט משכך כאבים של tuina עשוי להשתנות בהתאם לתחושות פציעה שונות, המשפיעים על חקירת מנגנון החניכה של שיכוך כאבים tuina.

המחקר השתמש בחולדות מודל של פגיעת התכווצות כרונית קלה (CCI מינורי) כדי לדמות pNP והשתמש בסימולטור מניפולציה אינטליגנטי של טווינה כדי לדמות את שלוש השיטות (לחיצה נקודתית, מריטה ולישה) ושלוש נקודות דיקור (Yinmen BL37, Chengshan BL57 ו- Yanglingquan GB34) לביצוע טיפול בטווינה. המחקר העריך את השינויים בכאב תוך 24 שעות ואת נקודת הזמן האופטימלית ליעילות של שיכוך כאבים בחולדות עם מודלים קלים של CCI על ידי בדיקת סף רגישות לקור (CST), סף נסיגה מכני (MWT) וחביון נסיגה תרמית (TWL). יתר על כן, המחקר העריך את שינויי הביטוי IL-10 ו- TNF-α באמצעות זיהוי אליסה. התוצאות מראות כי tuina יש השפעות משככי כאבים מיידיים ומתמשכים. עבור שלושת ספי הרגישות השונים לפציעה של CST, MWT, TWL ושני ציטוקינים של IL-10 ו- TNF-α, יעילות משככי הכאבים של טווינה תוך 24 שעות לאחר ההתערבות שונה באופן משמעותי בנקודות זמן שונות.

Introduction

כאב נוירופתי היקפי (pNP) מתייחס לכאב הנגרם על ידי נגע או מחלה של מערכת העצבים הסומטוסנסורית ההיקפית, המתבטאת כסדרה של סימפטומים וסימנים, עם hyperalgesia כאחד הסימפטומים העיקריים ^1,2. שיכוך כאבים הוא חוויה מוגברת של כאב הנגרם על ידי גירוי מזיק, כולל דקירת סיכה, קור וחום³. נערכו מחקרים אפידמיולוגיים גדולים, המראים כי pNP הוא הנפוץ ביותר, עם שיעור שכיחות של 6.9%-10% בכאב נוירופתי⁴. pNP יכול להיגרם על ידי מחלות מרובות, כולל פגיעה בעצב, נוירלגיה פוסט-הרפטית, פולינוירופתיה סוכרתית כואבת, טרשת נפוצה, שבץ, סרטן וכו '^.5. כיום, השיטה העיקרית לטיפול pNP היא תרופות, אבל ההשפעה אינה אידיאלית; ותופעות הלוואי משמעותיות, וזו הסיבה העיקרית לנטל הכלכלי הגבוה על הפרט והחברה⁶.

טווינה היא שיטת טיפול חיצונית ירוקה, חסכונית, בטוחה ויעילה של הרפואה הסינית המסורתית⁷. מחקרים קליניים רבים הוכיחו את ההשפעה משככת הכאבים של טווינה על pNP, ומחקרים בסיסיים אימתו את ההשפעות המיידיות והמצטברות של tuina ^8,9. מנגנון משכך הכאבים המצטבר העיקרי של טווינה הוא להפחית את רמות הגורמים הדלקתיים ולעכב את ההפעלה של תאי גלייה^10,11. המחקר הקודם אישר את ההשפעה המצטברת של משכך כאבים של טווינה ומצא גנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי (DEGs) בגרעיני השורש הגבי (DRG) ובקרן עמוד השדרה הגבי (SDH) של חולדות עם פגיעה עצבית סיאטית לאחר 20 פעמים של טיפול בטווינה, הקשורים בעיקר לקשירת חלבונים, תגובת לחץ והקרנה עצבית¹². במחקרים אחרונים, אושר כי tuina יש אפקט משכך כאבים מיידי וכי התערבות tuina חד פעמית יכול להקל על hyperalgesia של חולדות CCI קטין ובמיוחד להקל על hyperalgesia תרמי יעיל יותר¹³. עם זאת, נקודת הזמן האופטימלית עבור אפקט משכך כאבים של tuina עשוי להשתנות בהתאם לתחושת הפציעה (קר, חום, מכני), המשפיעים על חקירת מנגנון החניכה של שיכוך כאבים tuina.

מתווכי דלקת יכולים לגרום לרגישות והפעלה של קולטני כאב, מה שמוביל לירידה בספי ההפרשות וההפרשות החוץ רחמיות, ובכך לתרום לרגישות היקפית^14,15. לאחר פגיעה עצבית היקפית, TNF-α הוא יוזם התגובה הדלקתית, אשר יכול לקדם את הסינתזה של גורמים דלקתיים כגון IL-10 ו- IL-1β, גרימת פגיעה דלקתית ישירה ברקמות, גירוי קצות עצבים מקומיים, וגרימת כאב 16,17,18. Tuina יכול להשיג השפעות משככי כאבים על ידי הפחתת הביטוי של גורמים דלקתיים כגון TNF-α, IL-10, IL-6, ו- IL-1β 19,20,21. המחקר בחר חולדות מודל CCI מינוריות כדי לדמות pNP קליני ובחר נקודות זמן שונות לבדיקה התנהגותית של כאב גירוי קר, תרמי ומכני לאחר התערבות טווינא חד פעמית על ידי סף רגישות לקור (CST), סף נסיגה מכני (MWT), חביון נסיגה תרמית (TWL), ובחר IL-10 ו- TNF-α בסרום על ידי בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA), על מנת לבחור את נקודת הזמן שבה ההשפעה משכך כאבים של טווינה היא משמעותית, מתן בסיס לחקר מנגנון החניכה של שיכוך כאבים טווינה בשלב מאוחר יותר.

Protocol

הוועדה להגנה על בעלי חיים ושימוש באוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית (BUCM-4-2022082605-3043) אישרה את כל ההליכים המשמשים במחקר זה.

1. בעלי חיים ועיצוב המחקר

1. השג 49 חולדות Sprague-Dawley (SD) זכר בן 8 שבועות, במשקל 200 ± 10 גרם.
2. באמצעות שיטת טבלת מספרים אקראיים, חלקו את החולדות לקבוצת פעולת דמה (n = 7), קבוצת מודל (n = 7), ומיד לאחר קבוצת טווינה (n = 7), 6 שעות לאחר קבוצת טווינה (n = 7), 12 שעות לאחר קבוצת טווינה (n = 7), 18 שעות לאחר קבוצת טווינה (n = 7), ו- 24 שעות לאחר קבוצת טווינה (n = 7).

2. הקמת מודל חולדה של CCI מינורי (איור 1)

הערה: שיטת מידול CCI קטין הייתה כפי שתוארה במחקרים קודמים 22,23,24.

1. אפשר הזנה אדפטיבית של חולדת SD למשך 7 ימים. תנו לחולדה לצום במשך 2-3 שעות לפני הדוגמנות.
2. הכניסו את החולדה לקופסה מלאה באיזופלורן 3-5% להרדמה על ידי מכונת הרדמה. לאחר ההרדמה, יש למרוח משחה אופתלמית על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות.
3. תקנו את החולדה בתנוחה נוטה על שולחן, גלחו את הפרווה של אזור מפרק הירך הימני וחיטאו את האזור ביוד (איור 1B).
4. לאשר את המישור הכירורגי של הרדמה על ידי צביטת בוהן. בצעו חתך עורי של כ-0.5-1 ס"מ לאורך כיוון ההליכה של העצב הסיאטי, הפרידו בבוטות את שכבת השריר וחשפו באופן מלא את הקצה התחתון של שריר הפיריפורמיס (איור 1C).
5. קשרו באופן רופף תפר מעי כרום נספג (סוג 4-0) סביב העצב מבלי להפריע לזרימת הדם של כלי הדם החוץ-עצביים. חשפו את העצב הסיאטי של חולדות מקבוצת הדמה במשך 3 דקות ללא קשירה (איור 1A,D,E).
6. השתמש מזרק ללא מחט כדי להחיל טיפה אחת של 0.9% נתרן כלורי פתרון על עצב sciatic כדי לעזור לאפס אותו. תפרו שכבה אחר שכבה, תנו כמות מתאימה של תרופות אנטי דלקתיות כמו אבקת אמוקסיצילין, תפרו את שכבת השריר בתפר אחד, ותפרו את העור עם 2 תפרים (איור 1F).
   הערה: משלב 2.3 עד שלב 2.6, יש לשמור על זרימת איזופלורן של 2%-3% לפיות ולאף של החולדות כדי לשמור על הרדמה.
7. שמרו על חום הגוף של החולדה וחכו שהיא תתעורר. החזירו את החולדות לחדר הרבייה.

3. התערבות אינטליגנטית בסימולטור מניפולציה של טווינה (איור 2)

הערה: הטיפול החל ביום^השביעי לאחר הקמת המודל.

1. התאם את פרמטרי המכשיר לכוח גירוי של 4 N, תדירות גירוי של 60 פעמים לדקה וטמפרטורה של 36 ° C בממשק פעולת המחשב. הכניסו את החולדה למתקן קיבוע החולדות וחשפו את המיקום של נקודות הדיקור של הגפה האחורית (איור 2A, מכונה שפותחה בעצמה, פטנט מס'. ZL 2023 20511277.5)²⁵.
2. הפעל את המכשיר כדי לבצע את שיטות הלחיצה, המריטה והלישה (טבלה 1). לחצו על נקודות לחיצה, מריטה ולישה שמוצגות על מסך המחשב ברצף של נקודות Yinmen (BL37), Chengshan (BL57) ו-Yanglingquan (GB34) (טבלה 2) בצד המודל של החולדה מקבוצת הטווינא (איור 2B, C)²⁶.
   1. עבור קבוצת הטווינה, בצע התערבות אחת פעם ביום במשך יום אחד, בכוח של 4 N, תדירות של 60 פעמים לדקה, ובסך הכל 9 דקות לנקודה לכל שיטה.
   2. יש לרסן את קבוצות הדמה והמודל למשך 9 דקות, עם אותו מספר פעמים כמו קבוצת הטווינה.

4. מדידה התנהגותית

הערה: לאחר ההתערבות, סף רגישות לקור (CST), סף משיכה מכני (MWT) והשהיית משיכה תרמית (TWL) נבדקו בחמש תת-קבוצות טווינה, קבוצת מודל וקבוצת פעולת דמה, בהתאמה. זמן הבדיקה של קבוצות המודל וההונאה זהה לזה של קבוצת הטווינה (כלומר, 24 שעות).

1. סף רגישות לקור (CST)
   1. הניחו את החולדה על גלאי כאב חכם עם פלטה קרה ופלטה חמה עם טמפרטורת פני שטח של 4 ± 1 מעלות צלזיוס (לחצו על START > SET), וכסו אותה בכלוב פלסטיק שקוף.
   2. צפו בפעילות הגישוש של החולדות במשך 5 דקות עד שהן התאקלמו בכלוב הפלסטיק השקוף.
   3. שימו לב ותיעדו את מספר הרמות הרגליים בצד הניתוחי של הגפה האחורית במהלך 5 הדקות הבאות.
      הערה: מספר הרמות הרגליים הנגרמות כתוצאה משינויים בפעילות או ביציבה של החולדה אינו נכלל.
2. סף משיכה מכני (MWT)
   1. הניחו את החולדה על המשטח התחתון כרשת (0.5 ס"מ × 0.5 ס"מ) בקופסת בדיקה למשך 15-30 דקות לפני הבדיקה.
   2. הזיזו את בדיקת הכאב (מסוג EVF 5) למרכז האזור הפלנטרי האחורי הימני של החולדה, הגבירו באופן ליניארי את הלחץ ביד, ותיעדו את הסף המוצג על מסך המכשיר כאשר החולדה מרימה ומלקקת את רגליה. מדדו ברציפות 5 פעמים, עם מרווח מדידה של 10 דקות כל אחת.
3. השהיית משיכה תרמית (TWL)
   1. הניחו את החולדה בקופסת בדיקה עם משטח תחתון מזכוכית ואפשרו לה להסתגל במשך 15 דקות לפני תחילת הבדיקה.
      הערה: התקופה הסמויה של רפלקס כף הרגל של כיווץ תרמי זוהתה באמצעות מכשיר כאב לגירוי תרמי (מסוג PL200).
   2. הגדרת פרמטרים: זמן הבדיקה המרבי הוא 30 שניות, והעוצמה היא 50%. לחץ על הלחצנים START ו- DIRECTION .
   3. העבר את הגשושית האינפרא אדומה למרכז האזור הפלנטרי האחורי הימני של החולדה והתחל את האיתור.
   4. תעד את ההשהיה של רפלקס נסיגת כף הרגל כאשר החולדה מרימה ומלקקת את רגליה. מדוד את ההשהיה ברציפות 5 פעמים, עם מרווח של 10 דקות בין כל מדידה.

5. אליסה

1. יש להרדים את החולדה במינון של 35 מ"ל/100 גרם של הידרט כלור 4% להרדמה תוך צפקית בהזרקה לאחר בדיקה התנהגותית. חתכו את העור והשרירים לאורך אמצע בטנה של החולדה כדי לחשוף את איבריה הפנימיים.
2. השתמש נטל ומחזיק מחט להפרדה טהורה, לזהות את אבי העורקים הבטן, לקחת דם טרי, ולשמור דגימה לבדיקה. השתמשו בצינור הפרדה כדי להפריד את הסרום. קח את דגימת הסרום לזיהוי מיידי, או לארוז אותו בנפרד ולאחסן אותו במקרר ב -80 ° C.
   הערה: לפני הפרידה, יש לאפשר לדגימת הדם להצטבר למשך 30 דקות.
3. הכינו את נסיוב החולדות לתהליך הבדיקה ואחסנו אותן בטמפרטורת החדר (RT) למשך 30 דקות לפחות.
4. הגדר בארות ריקות ובארות מדגם סטנדרטיות לבדיקת הדגימה. הוסף סך של 50 μL של הדגימות הסטנדרטיות לצלחת המקושרת לאנזים. הוסף תחילה 40 μL של מדלל ולאחר מכן הוסף 10 μL של דגימה למדגם היטב כדי להיבדק.
   הערה: בעת הוספת דגימות, יש צורך להוסיף אותן לתחתית האנזים המסומן היטב, להבטיח שהן לא נוגעות בדופן הבאר ככל האפשר, ולנער בעדינות ולערבב היטב. הבאר הריקה אינה מכילה דגימות או ריאגנטים המסומנים באנזימים, והשלבים האחרים זהים. הדילול הסופי של המדגם הוא 5 פעמים.
5. לאחר איטום הצלחת עם סרט איטום, מניחים אותה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
6. מדללים פי 30 מתמיסת הכביסה המרוכזת במים מזוקקים ומניחים בצד.
7. מוציאים את סרט האיטום, יוצקים את הנוזל מהבאר ומנערים אותו לייבוש. ממלאים כל באר עם נוזל כביסה, לתת לו לעמוד במשך 30 s, ולאחר מכן לשפוך אותו החוצה. חזור על שלב זה 5 פעמים, ולבסוף, לנער אותו יבש.
8. הוסיפו אבידין עם תווית פרוקסידז של חזרת (100 מיקרוליטר לבאר).
9. הוסיפו 50 μL של מפתח צבע A לכל באר, ולאחר מכן הוסיפו 50 μL של מפתח הצבע B. נערו וערבבו בעדינות, והניחו בסביבה של 37°C למשך 10 דקות בחושך.
10. הוסף 50 μL של תמיסת עצירה לכל באר כדי לסיים את התגובה.
    הערה: בשלב זה, הצבע הכחול יהפוך לצהוב.
11. אפס את הבארות הריקות ומדידת הצפיפות האופטית (ערך OD) של כל באר ברצף באורך גל של 450 ננומטר.

תוצאות

CST: בהשוואה לקבוצת המודל, מספר הרמות הרגליים בקבוצה 6 שעות לאחר טווינא הופחת באופן משמעותי, וההבדל היה מובהק סטטיסטית (P < 0.05). בהשוואה לקבוצת הדמה, מספר הרמות הרגליים בקבוצת המודל גדל באופן משמעותי, וההבדל היה מובהק סטטיסטית (P < 0.05) (טבלה 3,

Discussion

המחקר השתמש במודל CCI מינורי כדי לדמות pNP הנגרם על ידי פגיעה קלינית בעצב הסיאטי. מודל CCI המינורי כולל דחיסה וריסון מתמשך וכרוני של גזע העצב באמצעות קשירה, מלווה בנפיחות הדרגתית של הליגטורה, וכתוצאה מכך בצקת בתוך העצב הסיאטי ויצירת כאב כרוני יציב תוך 3-5 ימים^27,28

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	Ruiwode Life Technology Co., Ltd., Shenzhen, China	R500	Animal respiratory anesthesia related equipment
Chromic intestinal suture	Shandong Boda Medical Products Co., Ltd., China	BD210903	An absorbable surgical suture mainly made from collagen protein processed from the intestines of healthy young goats
Electronic Von Frey instrument	Bioseb, USA	BIO-EVF5	An instrument for detecting mechanical withdrawal threshold
Intelligent cold and hot plate pain detector	Anhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd,China.	ZH-6C	An instrument for detecting cold sensitivity threshold
Isoflurane	Ruiwode Life Technology Co., Ltd., Shenzhen, China	R510-22-10	An anesthetic
Multi-function full-wavelength microplate reader	Molecular Devices (Shanghai) Co., Ltd.	SpectraMax M2	An instrument for detecting optical density (OD)
Thermal analgesia device	Chengdu Techman Software Co., Ltd., China	PL-200	An instrument for detecting thermal withdrawal latency