Caratteristiche dei cambiamenti del dolore nei ratti con lesione nervosa entro 24 ore dall'intervento Tuina una tantum

Riepilogo

Presentiamo un protocollo che utilizza il simulatore di manipolazione del tuina per eseguire la terapia tuina "a tre manipolazioni e tre agopunti" per ratti con lesioni da costrizione cronica minori e valutiamo i punti temporali analgesici efficaci del tuina entro 24 ore testando i cambiamenti del dolore attraverso l'analisi comportamentale e i cambiamenti nell'espressione dei fattori infiammatori utilizzando il saggio di immunoassorbimento enzimatico.

Abstract

Il tuina, come metodo di trattamento esterno della medicina tradizionale cinese, ha dimostrato di avere un effetto analgesico sul dolore neuropatico periferico (pNP) nella ricerca clinica e di base. Tuttavia, il momento ottimale per l'effetto analgesico del tuina può variare in base alle diverse sensazioni di lesione, influenzando l'esplorazione del meccanismo di inizio dell'analgesia del tuina.

La ricerca ha utilizzato ratti modello di lesione cronica da costrizione minore (CCI minore) per simulare la pNP e ha utilizzato il simulatore intelligente di manipolazione del tuina per simulare i tre metodi (pressione del punto, spiumatura e impasto) e tre punti di agopuntura (Yinmen BL37, Chengshan BL57 e Yanglingquan GB34) per l'esecuzione della terapia tuina. Lo studio ha valutato i cambiamenti del dolore entro 24 ore e il punto temporale ottimale per l'efficacia dell'analgesia del tuina nei ratti con modelli CCI minori testando la soglia di sensibilità al freddo (CST), la soglia di prelievo meccanico (MWT) e la latenza di ritiro termico (TWL). Inoltre, lo studio ha valutato i cambiamenti di espressione di IL-10 e TNF-α attraverso il rilevamento di Elisa. I risultati mostrano che il tuina ha effetti analgesici sia immediati che prolungati. Per le tre diverse soglie di sensibilità al danno di CST, MWT, TWL e due citochine di IL-10 e TNF-α, l'efficacia analgesica di tuina entro 24 ore dall'intervento è significativamente diversa in diversi punti temporali.

Introduzione

Il dolore neuropatico periferico (pNP) si riferisce al dolore causato da una lesione o malattia del sistema nervoso somatosensoriale periferico, manifestato come una serie di sintomi e segni, con l'iperalgesia come uno dei sintomi principali ^1,2. L'iperalgesia è un'esperienza intensificata di dolore causato da uno stimolo nocivo, tra cui puntura di spillo, freddo e caldo³. Sono stati condotti ampi studi epidemiologici, che mostrano che la pNP è la più comune, con un tasso di prevalenza del 6,9%-10% nel dolore neuropatico⁴. La pNP può essere causata da molteplici malattie, tra cui lesioni del nervo, nevralgia post-erpetica, polineuropatia diabetica dolorosa, sclerosi multipla, ictus, cancro, ^ecc.5. Al giorno d'oggi, il metodo principale per il trattamento della pNP sono i farmaci, ma l'effetto non è ideale; e gli effetti collaterali sono significativi, il che è la ragione principale dell'elevato onere economico per gli individui e la società⁶.

Tuina è un metodo di trattamento esterno ecologico, economico, sicuro ed efficace della medicina tradizionale cinese⁷. Molti studi clinici hanno dimostrato l'effetto analgesico del tuina sulla pNP e studi di base hanno verificato gli effetti analgesici immediati e cumulativi del tuina ^8,9. Il principale meccanismo analgesico cumulativo del tuina è quello di ridurre i livelli di fattori infiammatori e inibire l'attivazione delle cellule gliali^10,11. La ricerca precedente ha confermato l'effetto analgesico cumulativo del tuina e ha trovato geni differenzialmente espressi (DEG) nei gangli della radice dorsale (DRG) e nel corno dorsale spinale (SDH) di ratti con lesione del nervo sciatico dopo 20 volte il trattamento con tuina, principalmente correlati al legame proteico, alla risposta alla pressione e alla proiezione neuronale¹². In studi recenti, è stato confermato che il tuina ha un effetto analgesico immediato e che l'intervento 1-time del tuina potrebbe alleviare l'iperalgesia dei ratti CCI minori e soprattutto facilitare l'iperalgesia termica in modo più efficace¹³. Tuttavia, il momento ottimale per l'effetto analgesico del tuina può variare a seconda della sensazione di lesione (freddo, caldo, meccanica), influenzando l'esplorazione del meccanismo di inizio dell'analgesia del tuina.

I mediatori dell'infiammazione possono sensibilizzare e attivare i recettori del dolore, portando a una diminuzione delle soglie di scarica e delle scariche ectopiche, contribuendo così alla sensibilizzazione periferica^14,15. Dopo la lesione dei nervi periferici, il TNF-α è un iniziatore della risposta infiammatoria, che può promuovere la sintesi di fattori infiammatori come IL-10 e IL-1β, causando lesioni infiammatorie tissutali dirette, stimolando le terminazioni nervose locali e causando dolore 16,17,18. Tuina può ottenere effetti analgesici riducendo l'espressione di fattori infiammatori come TNF-α, IL-10, IL-6 e IL-1β 19,20,21. Lo studio ha selezionato ratti modello CCI minori per simulare la pNP clinica e ha selezionato diversi punti temporali per i test comportamentali del dolore da stimolazione fredda, termica e meccanica dopo un intervento tuina 1 volta per soglia di sensibilità al freddo (CST), soglia di prelievo meccanico (MWT), latenza di prelievo termico (TWL) e scegliere IL-10 e TNF-α nel siero mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), Al fine di selezionare il punto temporale in cui l'effetto analgesico di Tuina è significativo, fornendo una base per lo studio del meccanismo di inizio dell'analgesia di Tuina nella fase successiva.

Protocollo

Il Comitato per la protezione e l'uso degli animali dell'Università di Medicina Cinese di Pechino (BUCM-4-2022082605-3043) ha approvato tutte le procedure utilizzate in questo studio.

1. Animali e disegno dello studio

1. Procurarsi 49 ratti maschi di Sprague-Dawley (SD) di 8 settimane, del peso di 200 ± 10 g.
2. Utilizzando un metodo della tabella dei numeri casuali, dividere i ratti in un gruppo di operazioni fittizie (n = 7), un gruppo modello (n = 7) e immediatamente dopo il gruppo tuina (n = 7), 6 ore dopo il gruppo tuina (n = 7), 12 ore dopo il gruppo tuina (n = 7), 18 ore dopo il gruppo tuina (n = 7) e 24 ore dopo il gruppo tuina (n = 7).

2. Definizione di un modello di ratto di ICC minore (Figura 1)

NOTA: Il metodo di modellazione della CCI minore era quello descritto in studi precedenti 22,23,24.

1. Consentire l'alimentazione adattativa del ratto SD per 7 giorni. Lascia che il topo digiunisca per 2-3 ore prima di modellare.
2. Metti il ratto in una scatola riempita con isoflurano al 3-5% per l'anestesia da una macchina per anestesia. Dopo l'anestesia, applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza.
3. Fissare il ratto in posizione prona su un tavolo, radere il pelo dell'area dell'articolazione dell'anca destra e disinfettare l'area con iodio (Figura 1B).
4. Confermare il piano chirurgico dell'anestesia con un pizzico di punta. Praticare un'incisione cutanea di circa 0,5-1 cm lungo la direzione di camminata del nervo sciatico, separare bruscamente lo strato muscolare ed esporre completamente il bordo inferiore del muscolo piriforme (Figura 1C).
5. Legare liberamente una sutura intestinale cromata assorbibile (tipo 4-0) attorno al nervo senza interrompere la circolazione sanguigna dei vasi extraneurali. Esporre il nervo sciatico di ratti del gruppo fittizio per 3 minuti senza legatura (Figura 1A, D, E).
6. Utilizzare una siringa senza ago per applicare 1 goccia di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% sul nervo sciatico per aiutare a ripristinarlo. Suturare strato per strato, somministrare una quantità adeguata di farmaco antinfiammatorio come la polvere di amoxicillina, suturare lo strato muscolare con 1 punto e suturare la pelle con 2 punti (Figura 1F).
   NOTA: Dal passaggio 2.3 al passaggio 2.6, mantenere il flusso di isoflurano al 2%-3% nella bocca e nel naso dei ratti per mantenere l'anestesia.
7. Tieni il topo al caldo e aspetta che si svegli. Riporta i topi nella stanza di riproduzione.

3. Intervento intelligente con il simulatore di manipolazione del tuina (Figura 2)

NOTA: Il trattamento è iniziato il 7^° giorno dopo la definizione del modello.

1. Regolare i parametri dello strumento su una forza di stimolazione di 4 N, una frequenza di stimolazione di 60 volte/min e una temperatura di 36 °C sull'interfaccia operativa del computer. Posizionare il ratto nel fissatore per ratti ed esporre la posizione dei punti di agopuntura degli arti posteriori (Figura 2A, macchina auto-sviluppata, brevetto n. ZL 2023 20511277.5)²⁵.
2. Attivare lo strumento per eseguire i metodi di pressatura a punti, pizzicamento e impastamento (Tabella 1). Fare clic su Point-Pressing, Plucking, and Kneading visualizzati sullo schermo del computer nella sequenza sui punti Yinmen (BL37), Chengshan (BL57) e Yanglingquan (GB34) (Tabella 2) sul lato del modello del ratto del gruppo tuina (Figura 2B, C)²⁶.
   1. Per il gruppo tuina, eseguire un intervento una volta al giorno per 1 giorno, con una forza di 4 N, una frequenza di 60 volte/min e un totale di 9 min per punto per metodo.
   2. Trattenere i gruppi sham e model per 9 minuti, con lo stesso numero di volte del gruppo tuina.

4. Misurazione comportamentale

NOTA: Dopo l'intervento, la soglia di sensibilità al freddo (CST), la soglia di prelievo meccanico (MWT) e la latenza di ritiro termico (TWL) sono state testate rispettivamente nei 5 sottogruppi tuina, nel gruppo modello e nel gruppo operativo fittizio. Il tempo di test per il modello e il gruppo sham è lo stesso di quello per il gruppo tuina (cioè 24 ore).

1. Soglia di sensibilità al freddo (CST)
   1. Posiziona il ratto su un rilevatore di dolore intelligente a piastra fredda e calda con una temperatura superficiale di 4 ± 1 °C (clicca su START > SET) e coprilo con una gabbia di plastica trasparente.
   2. Osservare le attività esplorative dei ratti per 5 minuti fino a quando non si sono acclimatati alla gabbia di plastica trasparente.
   3. Osservare e registrare il numero di sollevamenti del piede nel lato operativo dell'arto posteriore entro i successivi 5 minuti.
      NOTA: Il numero di sollevamenti del piede causati da cambiamenti nell'attività o nella postura del ratto non è incluso.
2. Soglia di prelievo meccanico (MWT)
   1. Posiziona il ratto sulla superficie inferiore come una griglia (0,5 cm × 0,5 cm) in una scatola di prova per 15-30 minuti prima del test.
   2. Spostare la sonda del dolore (tipo EVF 5) al centro della regione plantare posteriore destra del ratto, aumentare linearmente la pressione a mano e registrare la soglia visualizzata sullo schermo dello strumento quando il ratto solleva e si lecca le zampe. Misurare continuamente 5 volte, con un intervallo di misurazione di 10 minuti ciascuna.
3. Latenza di prelievo termico (TWL)
   1. Metti il ratto in una scatola di prova con una superficie inferiore in vetro e lascialo adattare per 15 minuti prima di iniziare il test.
      NOTA: Il periodo di latenza del riflesso del piede di contrazione termica è stato rilevato utilizzando uno strumento per la stimolazione termica del dolore (tipo PL200).
   2. Imposta i parametri: il tempo massimo di test è di 30 s e l'intensità è del 50%. Fare clic sui pulsanti START e direzione.
   3. Spostare la sonda a infrarossi al centro della regione plantare posteriore destra del ratto e avviare il rilevamento.
   4. Registra la latenza del riflesso di retrazione del piede quando il ratto solleva e si lecca i piedi. Misura la latenza continuamente 5 volte, con un intervallo di 10 minuti tra ogni misurazione.

5. ELISA

1. Anestetizzare il ratto con una dose di 35 ml/100 g di idrato di cloro al 4% per l'anestesia per iniezione intraperitoneale dopo test comportamentali. Taglia la pelle e i muscoli longitudinalmente lungo il centro dell'addome del ratto per esporre i suoi organi interni.
2. Utilizzare una zavorra e un portaago per la separazione pura, identificare l'aorta addominale, prelevare sangue fresco e conservare un campione per il test. Utilizzare un tubo di separazione per separare il siero. Prelevare il campione di siero per la rilevazione immediata, oppure imballarlo separatamente e conservarlo in frigorifero a -80°C.
   NOTA: Prima di separare, lasciare che il campione di sangue si agglutini per 30 minuti.
3. Preparare il siero dei ratti per il processo di analisi e conservarlo a temperatura ambiente (RT) per almeno 30 minuti.
4. Impostare pozzetti vuoti e pozzetti campione standard per il campione da testare. Aggiungere un totale di 50 μl dei campioni standard alla piastra enzimatica. Aggiungere prima 40 μl di diluente, quindi aggiungere 10 μl di campione al pozzetto del campione da testare.
   NOTA: Quando si aggiungono campioni, è necessario aggiungerli sul fondo del pozzetto marcato con l'enzima, assicurandosi che non tocchino il più possibile la parete del pozzetto, e agitare delicatamente e mescolare bene. Il pozzetto bianco non contiene campioni o reagenti marcati con enzimi e gli altri passaggi sono gli stessi. La diluizione finale del campione è di 5 volte.
5. Dopo aver sigillato la piastra con una pellicola sigillante, metterla in un'incubatrice a 37 °C per 30 minuti.
6. Diluire 30 volte la soluzione di lavaggio concentrata con acqua distillata e metterla da parte.
7. Rimuovere la pellicola sigillante, versare il liquido dal pozzetto e scuoterlo per asciugarlo. Riempi ogni pozzetto con il detersivo, lascialo riposare per 30 secondi e poi versalo. Ripeti questo passaggio 5 volte e, infine, scuotilo per asciugarlo.
8. Aggiungere avidina marcata con perossidasi di rafano (100 μl per pozzetto).
9. Aggiungere 50 μl di sviluppatore di colore A a ciascun pozzetto, quindi aggiungere 50 μl di sviluppatore di colore B. Agitare delicatamente e mescolare e posizionare il prodotto in un ambiente a 37 °C per 10 minuti al buio.
10. Aggiungere 50 μl della soluzione di arresto per pozzetto per terminare la reazione.
    NOTA: A questo punto, il colore blu diventerà giallo.
11. Azzerare i pozzetti bianchi e misurare la densità ottica (valore OD) di ciascun pozzetto in sequenza a una lunghezza d'onda di 450 nm.

Risultati

CST: Rispetto al gruppo modello, il numero di sollevamenti del piede nel gruppo 6 ore dopo il tuina era significativamente ridotto e la differenza era statisticamente significativa (P < 0,05). Rispetto al gruppo sham, il numero di sollevamenti del piede nel gruppo modello è stato significativamente aumentato e la differenza è stata statisticamente significativa (P < 0,05) (Tabella 3, Figura 3). <...

Discussione

Lo studio ha utilizzato il modello CCI minore per simulare la pNP causata da una lesione clinica del nervo sciatico. Il modello minore di CCI prevede la compressione e la restrizione continua e cronica del tronco nervoso attraverso la legatura, accompagnata dal graduale rigonfiamento della legatura, con conseguente edema all'interno del nervo sciatico e formazione di dolore cronico stabile in 3-5 giorni^27,28. Nello studio prelimi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	Ruiwode Life Technology Co., Ltd., Shenzhen, China	R500	Animal respiratory anesthesia related equipment
Chromic intestinal suture	Shandong Boda Medical Products Co., Ltd., China	BD210903	An absorbable surgical suture mainly made from collagen protein processed from the intestines of healthy young goats
Electronic Von Frey instrument	Bioseb, USA	BIO-EVF5	An instrument for detecting mechanical withdrawal threshold
Intelligent cold and hot plate pain detector	Anhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd,China.	ZH-6C	An instrument for detecting cold sensitivity threshold
Isoflurane	Ruiwode Life Technology Co., Ltd., Shenzhen, China	R510-22-10	An anesthetic
Multi-function full-wavelength microplate reader	Molecular Devices (Shanghai) Co., Ltd.	SpectraMax M2	An instrument for detecting optical density (OD)
Thermal analgesia device	Chengdu Techman Software Co., Ltd., China	PL-200	An instrument for detecting thermal withdrawal latency