신경 손상이 있는 쥐의 통증 변화의 특성: 1회 Tuina 중재 후 24시간 이내

요약

경미한 만성 수축 손상 쥐에 대해 "Three-Manipulation and Three-Acupoint" tuina 요법을 수행하기 위해 tuina 조작 시뮬레이터를 사용하여 프로토콜을 제시하고, 행동 분석을 통한 통증 변화와 효소 결합 면역 흡착 분석을 사용하여 염증 인자 발현의 변화를 테스트하여 24시간 이내에 tuina의 효과적인 진통 시점을 평가합니다.

초록

투이나는 한의학의 외적 치료 방법으로서 임상 및 기초 연구에서 말초신경병증성 통증(pNP)에 대한 진통 효과가 있음이 입증되었습니다. 그러나 투이나의 진통 효과에 대한 최적의 시점은 다양한 부상 감각에 따라 달라질 수 있으며, 이는 투이나 진통의 시작 메커니즘에 대한 탐색에 영향을 미칩니다.

이 연구는 경미한 만성 수축 손상(경미한 CCI) 모델 쥐를 사용하여 pNP를 시뮬레이션하고 지능형 투이나 조작 시뮬레이터를 사용하여 투이나 요법을 수행하기 위한 세 가지 방법(점 누르기, 뽑기, 반죽)과 세 가지 경혈(Yinmen BL37, Chengshan BL57 및 Yanglingquan GB34)을 시뮬레이션했습니다. 이 연구는 냉간 민감도 역치(CST), 기계적 인출 역치(MWT) 및 열 인출 잠복기(TWL)를 테스트하여 CCI가 경미한 쥐에서 24시간 내 통증의 변화와 투이나 진통제의 효능에 대한 최적의 시점을 평가했습니다. 또한, 이 연구는 Elisa 검출을 통해 IL-10 및 TNF-α 발현 변화를 평가했습니다. 그 결과, 투이나는 즉각적이고 지속적인 진통 효과가 있는 것으로 나타났습니다. CST, MWT, TWL 세 가지 부상 민감도 역치와 IL-10 및 TNF-α의 두 가지 사이토카인의 경우, 중재 후 24시간 이내에 투이나의 진통 효능은 시점에 따라 유의하게 다릅니다.

서문

말초신경병증성 통증(pNP)은 말초 체성 감각 신경계의 병변 또는 질병으로 인한 통증을 말하며, 일련의 증상과 징후로 나타나며, 통각과민증이 주요 증상 중 하나입니다 ^1,2. 통각과민증은 찌르기, 추위, 열 등 유해한 자극에 의해 통증이 고조되는 것을 말한다³. 대규모 역학 연구가 수행되었으며, pNP가 가장 흔하며 신경병증성 통증에서 유병률이 6.9%-10%인 것으로 나타났습니다⁴. pNP는 신경 손상, 대상포진 후 신경통, 고통스러운 당뇨병성 다발성 신경병증, 다발성 경화증, 뇌졸중, 암 등을 포함한 여러 질병에 의해 발생할 수 있습니다.⁵. 요즘 pNP를 치료하는 주요 방법은 약물 치료이지만 효과가 이상적이지 않습니다. 그리고 부작용이 심각하여 개인과 사회의 경제적 부담이 큰 주범⁶.

투이나는 중국 전통 의학의 친환경적이고 경제적이며 안전하고 효과적인 외부 치료 방법입니다⁷. 많은 임상 연구에서 pNP에 대한 tuina의 진통 효과가 입증되었으며 기초 연구에서는 tuina ^8,9의 즉각적이고 누적적인 진통 효과를 확인했습니다. tuina의 주요 누적 진통 메커니즘은 염증 인자의 수준을 낮추고 신경 교세포^10,11의 활성화를 억제하는 것입니다. 선행 연구에서는 투이나의 누적 진통 효과를 확인하였으며, 주로 투이나 치료 20회 후 좌골 신경 손상이 있는 쥐의 등뿌리 신경절(DRG)과 척추 등쪽 뿔(SDH)에서 주로 단백질 결합, 압력 반응 및 신경 돌영과 관련된 차등 발현 유전자(DEG)를 발견했다¹². 최근 연구에서 투이나는 즉각적인 진통 효과가 있으며, 투이나(tuina) 중재를 1회 시행하면 경미한 CCI 쥐의 통각과민을 완화할 수 있으며, 특히 열성 통각과민증을 보다 효과적으로 완화할 수 있음이 확인되었다¹³. 그러나 투이나의 진통 효과에 대한 최적의 시점은 부상 감각(추위, 열, 기계)에 따라 달라질 수 있으며, 이는 투이나 진통의 시작 메커니즘 탐색에 영향을 미칩니다.

염증 매개체는 통증 수용체를 감작시키고 활성화시켜 분비물 역치와 이소성 분비물을 감소시켜 말초 감작에 기여할 수 있다^14,15. 말초 신경 손상 후 TNF-α는 염증 반응의 개시 인자로서 IL-10 및 IL-1β와 같은 염증 인자의 합성을 촉진하여 직접적인 조직 염증 손상을 일으키고 국소 신경 말단을 자극하며 통증을 유발할 수 있습니다 16,17,18. Tuina는 TNF-α, IL-10, IL-6 및 IL-1β 19,20,21과 같은 염증 인자의 발현을 감소시킴으로써 진통 효과를 얻을 수 있습니다. 이 연구는 임상적 pNP를 시뮬레이션하기 위해 경미한 CCI 모델 쥐를 선택하고 저온 민감도 역치(CST), 기계적 인출 임계값(MWT), 열 인출 잠복기(TWL)에 의한 1회 투이나 중재 후 추위, 열 및 기계적 자극 통증의 행동 테스트를 위해 다른 시점을 선택하고 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)에 의해 혈청에서 IL-10 및 TNF-α을 선택했습니다. Tuina의 진통 효과가 중요한 시점을 선택하기 위해 후기 단계에서 Tuina 진통의 시작 메커니즘 연구를 위한 기초를 제공합니다.

프로토콜

베이징 중의과대학 동물 보호 및 사용 위원회(BUCM-4-2022082605-3043)는 이 연구에 사용된 모든 절차를 승인했습니다.

1. 동물과 연구 디자인

1. 생후 8주 된 수컷 Sprague-Dawley(SD) 쥐 49마리를 획득하고 체중이 200 ± 10g입니다.
2. 난수 테이블 방법을 사용하여 쥐를 가짜 연산 그룹(n = 7), 모델 그룹(n = 7), 투이나 그룹 직후(n = 7), 투이나 그룹(n = 7) 후 6시간, 투이나 그룹(n = 7) 후 12시간, 투이나 그룹(n = 7) 후 18시간, 투이나 그룹(n = 7) 후 24시간으로 나눕니다.

2. 경미한 CCI의 랫트 모델 확립 (그림 1)

참고: 마이너 CCI를 모델링하는 방법은 선행 연구 ^22,23,24에서 설명한 바와 같았다.

1. 7일 동안 SD 쥐의 적응형 먹이를 허용합니다. 모델링하기 전에 쥐를 2-3시간 동안 단식시키십시오.
2. 마취 기계로 마취를 위해 3-5% 이소플루란으로 채워진 상자에 쥐를 넣습니다. 마취 후 양쪽 눈에 안과 연고를 바르면 건조함을 예방할 수 있습니다.
3. 쥐를 테이블 위에 엎드린 자세로 고정하고 오른쪽 엉덩이 관절 부위의 털을 면도하고 요오드로 소독합니다(그림 1B).
4. 발가락 꼬집으로 마취의 수술 평면을 확인합니다. 좌골 신경의 보행 방향을 따라 약 0.5-1cm의 피부 절개를 하고 근육층을 뭉툭하게 분리하고 이상근의 아래쪽 가장자리를 완전히 노출시킵니다(그림 1C).
5. 신경 외 혈관의 혈액 순환을 방해하지 않고 흡수성 크롬 장 봉합사(4-0 유형)를 신경 주위에 느슨하게 묶습니다. 가짜 그룹 쥐의 좌골 신경을 결찰 없이 3분 동안 노출시킵니다(그림 1A,D,E).
6. 바늘이 없는 주사기를 사용하여 0.9% 염화나트륨 용액 1방울을 좌골 신경에 바르면 좌골 신경을 재설정하는 데 도움이 됩니다. 층별로 봉합하고 아목시실린 분말과 같은 항염증제를 적당량 투여하고 근육층을 1바늘 봉합하고 2바늘로 피부를 봉합합니다(그림 1F).
   참고: 2.3단계에서 2.6단계까지 마취를 유지하기 위해 쥐의 입과 코로 2%-3% 이소플루란이 흐르도록 합니다.
7. 쥐를 따뜻하게 유지하고 깨어날 때까지 기다립니다. 쥐를 사육실로 돌려보냅니다.

3. 지능형 tuina 조작 시뮬레이터 개입(그림 2)

참고: 모델이 확립된 후 7^일 째 되는 날부터 치료가 시작되었습니다.

1. 컴퓨터 작동 인터페이스에서 기기 매개변수를 4N의 자극력, 60회/분의 자극 빈도, 36°C의 온도로 조정합니다. 쥐를 쥐 고정기에 넣고 뒷다리 경혈의 위치를 노출시킵니다(그림 2A, 자체 개발 기계, 특허 번호. ZL 2023 20511277.5)²⁵.
2. 기기를 활성화하여 포인트 프레싱, 뽑기 및 반죽 방법을 수행합니다(표 1). 투이나 그룹 쥐의 모델 쪽에 있는 Yinmen(BL37), Chengshan (BL57) 및 Yanglingquan (GB34) 점(표 2)의 순서로 컴퓨터 화면에 표시된 Point-Pressing, Pluging, Kneading을 클릭합니다(그림 2B, C)²⁶).
   1. 투이나 그룹의 경우 1일 동안 하루에 한 번 4N의 힘, 60회/분의 빈도, 방법당 포인트당 총 9분의 중재를 수행합니다.
   2. 가짜 그룹과 모델 그룹을 tuina 그룹과 동일한 횟수로 9분 동안 억제합니다.

4. 행동 측정

참고: 개입 후 임계값 냉간 감도 임계값(CST), 기계적 인출 임계값(MWT) 및 열 인출 대기 시간(TWL)은 각각 5개의 tuina 하위 그룹, 모델 그룹 및 가짜 작업 그룹에서 테스트되었습니다. 모델 및 가짜 그룹에 대한 테스트 시간은 tuina 그룹의 테스트 시간과 동일합니다(즉, 24시간).

1. 추위 민감도 임계값(CST)
   1. 표면 온도가 4 ± 1 °C( START > SET 클릭)인 지능형 냉판 및 열판 통증 감지기에 쥐를 놓고 투명한 플라스틱 케이지로 덮습니다.
   2. 쥐가 투명한 플라스틱 케이지에 적응할 때까지 5분 동안 쥐의 탐색 활동을 관찰합니다.
   3. 다음 5분 이내에 뒷다리의 수술 쪽에서 발을 들어 올리는 횟수를 관찰하고 기록합니다.
      알림: 쥐의 활동이나 자세의 변화로 인한 발 들어 올리기 횟수는 포함되지 않습니다.
2. 기계적 인출 임계값(MWT)
   1. 테스트하기 전에 15-30분 동안 테스트 상자에 격자(0.5cm × 0.5cm)로 쥐를 바닥 표면에 놓습니다.
   2. 통증 프로브(EVF 5형)를 쥐의 오른쪽 발바닥 후방 부위 중앙으로 이동시키고 손으로 압력을 선형으로 높이고 쥐가 발을 들어 핥을 때 기기 화면에 표시되는 임계값을 기록합니다. 측정 간격은 각각 5분씩 연속으로 10회 측정합니다.
3. 열 인출 대기 시간(TWL)
   1. 바닥면이 유리로 된 테스트 상자에 쥐를 넣고 테스트를 시작하기 전에 15분 동안 적응시키십시오.
      참고: 열 수축 발 반사의 잠복기는 열 자극 통증 기구(PL200 유형)를 사용하여 감지되었습니다.
   2. 매개변수 설정: 최대 테스트 시간은 30초이고 강도는 50%입니다. START 및 방향 버튼을 클릭합니다.
   3. 적외선 프로브를 쥐의 오른쪽 발바닥 뒤쪽 영역 중앙으로 이동하고 감지를 시작합니다.
   4. 쥐가 발을 들어 올리고 핥을 때 발 후퇴 반사의 대기 시간을 기록하십시오. 각 측정 사이에 10분 간격으로 대기 시간을 5번 연속으로 측정합니다.

5. 엘리사

1. 행동 검사 후 복강 내 주사 마취를 위해 35mL/100g의 4% 염소 수화물을 쥐를 마취합니다. 쥐의 복부 중앙을 따라 피부와 근육을 세로로 잘라 내부 장기를 노출시킵니다.
2. 순수한 분리를 위해 안정기와 바늘 홀더를 사용하고, 복부 대동맥을 식별하고, 신선한 혈액을 채취하고, 검사를 위해 샘플을 보관합니다. 분리 튜브를 사용하여 혈청을 분리합니다. 즉시 검출을 위해 혈청 샘플을 채취하거나 별도로 포장하여 -80 ° C의 냉장고에 보관하십시오.
   알림: 분리하기 전에 혈액 s를 허용하십시오.amp30분 동안 응집시킵니다.
3. 테스트 과정을 위해 쥐의 혈청을 준비하고 최소 30분 동안 실온(RT)에서 보관합니다.
4. 테스트할 샘플에 대해 빈 웰과 표준 샘플 웰을 설정합니다. 총 50μL의 표준 시료를 효소 결합 플레이트에 추가합니다. 먼저 40μL의 희석액을 추가한 다음 10μL의 샘플을 테스트할 샘플 웰에 추가합니다.
   참고: 샘플을 추가할 때는 효소 라벨이 부착된 웰의 바닥에 추가해야 하며, 가능한 한 웰의 벽에 닿지 않도록 하고 부드럽게 흔들어 잘 섞어야 합니다. 블랭크 웰에는 샘플 또는 효소 라벨링 시약이 포함되어 있지 않으며 다른 단계는 동일합니다. 샘플의 최종 희석은 5회입니다.
5. 밀봉 필름으로 플레이트를 밀봉한 후 37°C 인큐베이터에 30분 동안 넣습니다.
6. 농축된 세척액을 증류수로 30배 희석하여 따로 보관합니다.
7. 밀봉 필름을 제거하고 우물에서 액체를 붓고 흔들어 말리십시오. 각 웰에 세척액을 채우고 30초 동안 그대로 두었다가 붓습니다. 이 단계를 5번 반복하고 마지막으로 흔들어 말리십시오.
8. 양 고추냉이 과산화효소 표지된 아비딘(웰당 100μL)을 추가합니다.
9. 각 웰에 50 μL의 컬러 현상액 A를 첨가한 다음 50 μL의 컬러 현상액 B를 추가합니다. 부드럽게 흔들어 섞은 다음 어두운 곳에서 37분 동안 10°C 환경에 둡니다.
10. 웰당 50μL의 정지 용액을 추가하여 반응을 종료합니다.
    알림: 이 시점에서 파란색이 노란색으로 바뀝니다.
11. 빈 웰을 0으로 만들고 450nm의 파장에서 각 웰의 광학 밀도(OD 값)를 순서대로 측정합니다.

결과

중부 표준시: 모델군과 비교했을 때, 투이나 투여 후 6시간 후에 발을 들어 올린 그룹의 횟수는 유의하게 감소하였으며, 그 차이는 통계적으로 유의하였다(P < 0.05). 가짜 그룹과 비교했을 때, 모델 그룹에서 발을 들어 올리는 횟수가 유의하게 증가하였으며, 그 차이는 통계적으로 유의하였다(P < 0.05)(표 3, 그림 3)...

토론

이 연구는 임상 좌골 신경 손상으로 인한 pNP를 시뮬레이션하기 위해 미성년자 CCI 모델을 사용했습니다. 경미한 CCI 모델은 결찰을 통한 신경 줄기의 지속적이고 만성적인 압박 및 억제를 포함하며, 인찰의 점진적인 팽창을 동반하여 좌골 신경 내에 부종이 발생하고 3-5일 내에 안정적인 만성 통증을 형성합니다^27,28. 예비 연구에?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	Ruiwode Life Technology Co., Ltd., Shenzhen, China	R500	Animal respiratory anesthesia related equipment
Chromic intestinal suture	Shandong Boda Medical Products Co., Ltd., China	BD210903	An absorbable surgical suture mainly made from collagen protein processed from the intestines of healthy young goats
Electronic Von Frey instrument	Bioseb, USA	BIO-EVF5	An instrument for detecting mechanical withdrawal threshold
Intelligent cold and hot plate pain detector	Anhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd,China.	ZH-6C	An instrument for detecting cold sensitivity threshold
Isoflurane	Ruiwode Life Technology Co., Ltd., Shenzhen, China	R510-22-10	An anesthetic
Multi-function full-wavelength microplate reader	Molecular Devices (Shanghai) Co., Ltd.	SpectraMax M2	An instrument for detecting optical density (OD)
Thermal analgesia device	Chengdu Techman Software Co., Ltd., China	PL-200	An instrument for detecting thermal withdrawal latency