Características de los cambios en el dolor en ratas con lesión nerviosa dentro de las 24 horas posteriores a la intervención única con Tuina

Resumen

Presentamos un protocolo utilizando el simulador de manipulación de tuina para realizar la terapia de tuina "Three-Manipulation and Three-Acupoint" para ratas con lesiones crónicas menores por constricción y evaluar los puntos de tiempo analgésicos efectivos de tuina dentro de las 24 h mediante la prueba de los cambios en el dolor a través del análisis del comportamiento y los cambios en la expresión del factor inflamatorio utilizando un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas.

Resumen

Se ha demostrado que la tuina, como método de tratamiento externo de la medicina tradicional china, tiene un efecto analgésico sobre el dolor neuropático periférico (pNP) en investigación clínica y básica. Sin embargo, el momento óptimo para el efecto analgésico de la tuina puede variar de acuerdo con las diferentes sensaciones de la lesión, afectando la exploración del mecanismo de inicio de la analgesia de la tuina.

La investigación utilizó ratas modelo de lesión crónica por constricción menor (CCI menor) para simular pNP y utilizó el simulador inteligente de manipulación de tuina para simular los tres métodos (presión puntual, desplumado y amasado) y tres puntos de acupuntura (Yinmen BL37, Chengshan BL57 y Yanglingquan GB34) para realizar la terapia con tuina. El estudio evaluó los cambios en el dolor dentro de las 24 horas y el punto de tiempo óptimo para la eficacia de la analgesia tuina en ratas con modelos de ICC menores mediante la prueba del umbral de sensibilidad al frío (CST), el umbral de extracción mecánica (MWT) y la latencia de extracción térmica (TWL). Además, el estudio evaluó los cambios en la expresión de IL-10 y TNF-α a través de la detección de Elisa. Los resultados muestran que la tuina tiene efectos analgésicos inmediatos y sostenidos. Para los tres umbrales diferentes de sensibilidad a la lesión de CST, MWT, TWL y dos citocinas de IL-10 y TNF-α, la eficacia analgésica de tuina dentro de las 24 h posteriores a la intervención es significativamente diferente en diferentes puntos temporales.

Introducción

El dolor neuropático periférico (pNP) se refiere al dolor causado por una lesión o enfermedad del sistema nervioso somatosensorial periférico, que se manifiesta como una serie de síntomas y signos, con la hiperalgesia como uno de los principales síntomas ^1,2. La hiperalgesia es una experiencia intensificada de dolor causada por un estímulo nocivo, que incluye pinchazos, frío y calor³. Se han realizado grandes estudios epidemiológicos, que muestran que el pNP es el más común, con una tasa de prevalencia de 6,9%-10% en el dolor neuropático⁴. La pNP puede ser causada por múltiples enfermedades, incluyendo lesión del nervio, neuralgia postherpética, polineuropatía diabética dolorosa, esclerosis múltiple, accidente cerebrovascular, cáncer, ^etc.5. Hoy en día, el principal método para tratar la pNP es la medicación, pero el efecto no es el ideal; y los efectos secundarios son significativos, lo que constituye la razón principal de la alta carga económica para los individuos y la sociedad⁶.

Tuina es un método de tratamiento externo verde, económico, seguro y eficaz de la medicina tradicional china⁷. Muchos estudios clínicos han demostrado el efecto analgésico de la tuina sobre el pNP, y estudios básicos han verificado los efectos analgésicos inmediatos y acumulativos de la tuina ^8,9. El principal mecanismo analgésico acumulativo de la tuina es reducir los niveles de factores inflamatorios e inhibir la activación de las células gliales^10,11. La investigación previa confirmó el efecto analgésico acumulativo de la tuina y encontró genes expresados diferencialmente (DEGs) en los ganglios de la raíz dorsal (DRG) y el asta dorsal espinal (SDH) de ratas con lesión del nervio ciático después de 20 veces de tratamiento con tuina, principalmente relacionadas con la unión a proteínas, la respuesta a la presión y la proyección neuronal¹². En estudios recientes, se ha confirmado que la tuina tiene un efecto analgésico inmediato y que la intervención con tuina una sola vez podría aliviar la hiperalgesia de ratas menores con ICC y, especialmente, aliviar la hiperalgesia térmica de manera más efectiva¹³. Sin embargo, el momento óptimo para el efecto analgésico de la tuina puede variar en función de la sensación de lesión (frío, calor, mecánica), afectando a la exploración del mecanismo de inicio de la analgesia de la tuina.

Los mediadores inflamatorios pueden sensibilizar y activar los receptores del dolor, lo que conduce a una disminución de los umbrales de descarga y secreciones ectópicas, contribuyendo así a la sensibilización periférica^14,15. Después de una lesión de los nervios periféricos, el TNF-α es un iniciador de la respuesta inflamatoria, que puede promover la síntesis de factores inflamatorios como la IL-10 y la IL-1β, causando lesión inflamatoria tisular directa, estimulando las terminaciones nerviosas locales y causando dolor 16,17,18. Tuina puede lograr efectos analgésicos al reducir la expresión de factores inflamatorios como TNF-α, IL-10, IL-6 e IL-1β 19,20,21. El estudio seleccionó ratas modelo CCI menores para simular el pNP clínico y seleccionó diferentes puntos de tiempo para las pruebas de comportamiento del dolor por frío, estimulación térmica y mecánica después de una intervención de tuina 1 vez mediante el umbral de sensibilidad al frío (CST), el umbral de extracción mecánica (MWT), la latencia de extracción térmica (TWL), y eligió IL-10 y TNF-α en el suero mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Con el fin de seleccionar el punto temporal en el que el efecto analgésico de Tuina es significativo, proporcionando una base para el estudio del mecanismo de inicio de la analgesia de Tuina en la etapa posterior.

Protocolo

El Comité de Protección y Uso Animal de la Universidad de Medicina China de Beijing (BUCM-4-2022082605-3043) aprobó todos los procedimientos utilizados en este estudio.

1. Los animales y el diseño del estudio

1. Obtener 49 ratas macho Sprague-Dawley (SD) de 8 semanas de edad, con un peso de 200 ± 10 g.
2. Usando un método de tabla de números aleatorios, divida las ratas en un grupo de operación simulada (n = 7), un grupo modelo (n = 7) e inmediatamente después del grupo tuina (n = 7), 6 h después del grupo tuina (n = 7), 12 h después del grupo tuina (n = 7), 18 h después del grupo tuina (n = 7) y 24 h después del grupo tuina (n = 7).

2. Establecimiento de un modelo de rata de CCI menor (Figura 1)

NOTA: El método de modelación del ICC menor fue el descrito en estudios previos 22,23,24.

1. Permite la alimentación adaptativa de la rata SD durante 7 días. Deje que la rata ayune durante 2-3 horas antes de modelar.
2. Coloque la rata en una caja llena con 3-5% de isoflurano para anestesia mediante una máquina de anestesia. Después de la anestesia, aplique un ungüento oftálmico en ambos ojos para evitar que se sequen.
3. Fije a la rata en posición prona sobre una mesa, afeite el pelaje del área de la articulación de la cadera derecha y desinfecte el área con yodo (Figura 1B).
4. Confirme el plano quirúrgico de la anestesia mediante un pellizco en el dedo del pie. Realice una incisión en la piel de aproximadamente 0,5-1 cm a lo largo de la dirección de marcha del nervio ciático, separe sin rodeos la capa muscular y exponga completamente el borde inferior del músculo piriforme (Figura 1C).
5. Ate sin apretar una sutura intestinal de cromo absorbible (tipo 4-0) alrededor del nervio sin interrumpir la circulación sanguínea de los vasos extraneurales. Exponga el nervio ciático de las ratas del grupo simulado durante 3 minutos sin ligadura (Figura 1A, D, E).
6. Use una jeringa sin aguja para aplicar 1 gota de solución de cloruro de sodio al 0.9% en el nervio ciático para ayudar a restablecerlo. Suturar capa por capa, administrar una cantidad adecuada de fármaco antiinflamatorio como amoxicilina en polvo, suturar la capa muscular con 1 punto y suturar la piel con 2 puntos (Figura 1F).
   NOTA: Desde el paso 2.3 hasta el paso 2.6, mantenga el flujo de isoflurano al 2%-3% hacia la boca y la nariz de las ratas para mantener la anestesia.
7. Mantén a la rata caliente y espera a que se despierte. Regresa las ratas a la sala de cría.

3. Intervención del simulador de manipulación inteligente de tuina (Figura 2)

NOTA: El tratamiento comenzó el^7º día después de que se estableció el modelo.

1. Ajuste los parámetros del instrumento a una fuerza de estimulación de 4 N, una frecuencia de estimulación de 60 veces/min y una temperatura de 36 °C en la interfaz de operación de la computadora. Coloque la rata en el fijador de ratas y exponga la ubicación de los puntos de acupuntura de las extremidades traseras (Figura 2A, máquina de desarrollo propio, patente No. ZL 2023 20511277.5)²⁵.
2. Active el instrumento para realizar los métodos de prensado en punta, desplumado y amasado (Tabla 1). Haga clic en el punto de prensado, desplumado y amasado que se muestra en la pantalla de la computadora en la secuencia en los puntos Yinmen (BL37), Chengshan (BL57) y Yanglingquan (GB34) (Tabla 2) en el lado del modelo de la rata del grupo tuina (Figura 2B, C)²⁶.
   1. Para el grupo tuina, realizar una intervención una vez al día durante 1 día, con una fuerza de 4 N, una frecuencia de 60 veces/min y un total de 9 min por punto por método.
   2. Restrinja los grupos simulados y modelo durante 9 minutos, con el mismo número de veces que el grupo tuina.

4. Medición del comportamiento

NOTA: Después de la intervención, se probaron el umbral de sensibilidad al frío (CST), el umbral de extracción mecánica (MWT) y la latencia de extracción térmica (TWL) en los 5 subgrupos tuina, grupo modelo y grupo de operación simulada, respectivamente. El tiempo de prueba para los grupos modelo y simulado es el mismo que para el grupo tuina (es decir, 24 h).

1. Umbral de sensibilidad al frío (CST)
   1. Coloque la rata en un detector de dolor inteligente de placa fría y caliente con una temperatura superficial de 4 ± 1 °C (haga clic en INICIAR > SET) y cúbrala con una jaula de plástico transparente.
   2. Observe las actividades exploratorias de las ratas durante 5 minutos hasta que se hayan aclimatado a la jaula de plástico transparente.
   3. Observe y registre el número de levantamientos de pies en el lado operativo de la extremidad posterior dentro de los próximos 5 minutos.
      NOTA: No se incluye el número de levantamientos de pies causados por cambios en la actividad o postura de la rata.
2. Umbral de extracción mecánica (MWT)
   1. Coloque la rata en la superficie inferior como una cuadrícula (0,5 cm × 0,5 cm) en una caja de prueba durante 15-30 minutos antes de la prueba.
   2. Mueva la sonda del dolor (tipo EVF 5) al centro de la región plantar posterior derecha de la rata, aumente linealmente la presión con la mano y registre el umbral que se muestra en la pantalla del instrumento cuando la rata levanta y se lame las patas. Mida continuamente 5 veces, con un intervalo de medición de 10 minutos cada una.
3. Latencia de extracción térmica (TWL)
   1. Coloque la rata en una caja de prueba con una superficie con fondo de vidrio y deje que se adapte durante 15 minutos antes de comenzar la prueba.
      NOTA: El período latente del reflejo del pie por contracción térmica se detectó utilizando un instrumento de estimulación térmica para el dolor (tipo PL200).
   2. Establecer parámetros: el tiempo máximo de prueba es de 30 s y la intensidad es del 50%. Haga clic en los botones INICIO y dirección.
   3. Mueva la sonda infrarroja al centro de la región plantar posterior derecha de la rata e inicie la detección.
   4. Registre la latencia del reflejo de retracción del pie cuando la rata levanta y lame sus patas. Mida la latencia de forma continua 5 veces, con un intervalo de 10 minutos entre cada medición.

5. ELISA

1. Anestesiar a la rata con una dosis de 35 mL/100 g de hidrato de cloro al 4% para la anestesia inyectable intraperitoneal después de las pruebas de comportamiento. Corta la piel y los músculos longitudinalmente a lo largo de la mitad del abdomen de la rata para exponer sus órganos internos.
2. Use un lastre y un soporte para agujas para la separación pura, identifique la aorta abdominal, tome sangre fresca y guarde una muestra para analizarla. Use un tubo de separación para separar el suero. Tome la muestra de suero para su detección inmediata, o empaquétela por separado y guárdela en un refrigerador a -80 ° C.
   NOTA: Antes de separar, deje que la muestra de sangre se aglunte durante 30 minutos.
3. Prepare el suero de ratas para el proceso de prueba y guárdelo a temperatura ambiente (RT) durante al menos 30 minutos.
4. Configure pocillos en blanco y pocillos de muestra estándar para la muestra que se va a analizar. Añada un total de 50 μL de las muestras estándar a la placa enzimática. Agregue primero 40 μL de diluyente y luego agregue 10 μL de muestra al pocillo de muestra que se va a analizar.
   NOTA: Al agregar muestras, es necesario agregarlas al fondo del pocillo marcado con enzimas, asegurándose de que no toquen la pared del pocillo tanto como sea posible, y agitar y mezclar bien suavemente. El pocillo en blanco no contiene muestras ni reactivos marcados con enzimas, y los otros pasos son los mismos. La dilución final de la muestra es de 5 veces.
5. Después de sellar la placa con una película de sellado, colóquela en una incubadora a 37 °C durante 30 minutos.
6. Diluir 30 veces la solución de lavado concentrada con agua destilada y reservar.
7. Retire la película de sellado, vierta el líquido fuera del pozo y agítelo para secarlo. Llene cada pocillo con líquido de lavado, déjelo reposar durante 30 s y luego viértalo. Repite este paso 5 veces y, finalmente, agítalo para secarlo.
8. Agregue avidina marcada con peroxidasa de rábano picante (100 μL por pocillo).
9. Agregue 50 μL de revelador de color A a cada pocillo, luego agregue 50 μL de revelador de color B. Agite y mezcle suavemente, y colóquelo en un ambiente de 37 ° C durante 10 minutos en la oscuridad.
10. Agregue 50 μL de la solución de parada por pocillo para terminar la reacción.
    NOTA: En este punto, el color azul se volverá amarillo.
11. Ponga a cero los pozos en blanco y mida la densidad óptica (valor OD) de cada pozo en secuencia a una longitud de onda de 450 nm.

Resultados

CST: En comparación con el grupo modelo, el número de levantamientos de pies en el grupo 6 h después de la tuina se redujo significativamente, y la diferencia fue estadísticamente significativa (P < 0,05). En comparación con el grupo simulado, el número de levantamientos de pies en el grupo modelo aumentó significativamente y la diferencia fue estadísticamente significativa (P < 0,05) (Tabla 3, Figura 3

Discusión

El estudio utilizó el modelo CCI menor para simular la pNP causada por una lesión clínica del nervio ciático. El modelo menor de ICC implica la compresión y restricción continua y crónica del tronco nervioso a través de la ligadura, acompañada de la hinchazón gradual de la ligadura, lo que resulta en edema dentro del nervio ciático y forma de dolor crónico estable en 3-5 días^27,28. En el estudio preliminar, el grupo ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	Ruiwode Life Technology Co., Ltd., Shenzhen, China	R500	Animal respiratory anesthesia related equipment
Chromic intestinal suture	Shandong Boda Medical Products Co., Ltd., China	BD210903	An absorbable surgical suture mainly made from collagen protein processed from the intestines of healthy young goats
Electronic Von Frey instrument	Bioseb, USA	BIO-EVF5	An instrument for detecting mechanical withdrawal threshold
Intelligent cold and hot plate pain detector	Anhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd,China.	ZH-6C	An instrument for detecting cold sensitivity threshold
Isoflurane	Ruiwode Life Technology Co., Ltd., Shenzhen, China	R510-22-10	An anesthetic
Multi-function full-wavelength microplate reader	Molecular Devices (Shanghai) Co., Ltd.	SpectraMax M2	An instrument for detecting optical density (OD)
Thermal analgesia device	Chengdu Techman Software Co., Ltd., China	PL-200	An instrument for detecting thermal withdrawal latency