假型病毒作为通过中和测定监测针对 SARS-CoV-2 的体液免疫反应的分子工具

摘要

假型病毒 （PV） 是复制缺陷的病毒粒子，用于在比处理真实病毒更安全的条件下研究宿主-病毒相互作用。这里介绍的是一个详细的方案，显示了如何使用 SARS-CoV-2 PV 来测试 COVID-19 疫苗接种后患者血清的中和能力。

摘要

假型病毒 （PV） 是一种分子工具，可用于研究宿主-病毒相互作用和测试血清样本的中和能力，此外，它们在基因治疗中更广为人知的用途是递送目标基因。PV 具有复制缺陷，因为病毒基因组被分成不同的质粒，这些质粒未掺入 PV 中。这种安全且多功能的系统允许在生物安全 2 级实验室中使用 PV。在这里，我们提出了一种基于此处提到的三种质粒生产慢病毒 PV 的通用方法：（1） 携带监测感染所需的报告基因的骨架质粒;（2）包装质粒携带产生PV所需的所有结构蛋白的基因;（3）包膜表面糖蛋白表达质粒，决定病毒嗜性并介导病毒进入宿主细胞。在这项工作中，SARS-CoV-2 Spike 是用于生产非复制性 SARS-CoV-2 假型慢病毒的包膜糖蛋白。

简而言之，使用标准方法将包装细胞 （HEK293T） 与三种不同的质粒共转染。48小时后，收获含有PV的上清液，过滤，并在-80°C下储存。 通过研究感染后 48 小时靶细胞系中报告基因（荧光素酶）的表达来测试 SARS-CoV-2 PV 的感染性。相对发光单位 （RLU） 的值越高，感染/转导率越高。此外，将传染性PV添加到连续稀释的血清样品中，以研究假病毒进入靶细胞的中和过程，以RLU强度的降低来衡量：较低的值对应于高中和活性。

引言

假型病毒 （PV） 是微生物学中用于研究宿主-病毒和病原体-病原体相互作用的分子工具 1,2,3,4。PV 由内部部分（保护病毒基因组的病毒核心）和外部部分（定义向性⁵ 的病毒表面的包膜糖蛋白）组成。假病毒在靶细胞中是复制不合格的，因为它不包含产生新病毒颗粒的所有遗传信息。这种特殊特征的组合使PV成为野生型病毒的安全替代品。另一方面，野生型病毒具有高致病性，不能在 BSL 2 实验室中用于分析⁶。

PV的传染性可以通过报告基因来监测，报告基因通常编码荧光蛋白（GFP、RFP、YFP）或产生化学发光产物的酶（荧光素酶）。它包含在用于 PV 生产的质粒之一中，并掺入假病毒⁷ 的基因组中。

目前存在几种类型的 PV 核心，包括基于 HIV-1 基因组的慢病毒衍生颗粒。与其他平台相比，基于 HIV-1 的 PV 的最大优势在于它们在靶细胞基因组中的内在整合过程⁸。尽管HIV-1是一种高度....

研究方案

本协议已获得维罗纳大学伦理委员会的批准并遵循其指导方针（批准协议编号 1538）。从参与研究的人类受试者那里获得知情书面同意。从正在接种抗SARS-CoV-2疫苗的医护人员（HCW）志愿者身上采集全血样本。将这些样品收集在含有抗凝剂的塑料管中，以便随后分离血清¹⁵。

以下所有过程必须在 2 类生物罩中执行，在无菌条件下工作。必须小心处理病毒，所有废物必须在稀释的漂白剂溶液中中和。该协议的概述如 图 1 所示。

图 1：中和测定的图形表示。 （A）PV生产，（B）PV滴定和（C）中和测定。所有程序均在无菌条件下在 2 级生物罩中进行。在用于中和测定 （C） 之前，需要执行滴定步骤 （B） 以标....

讨论

尽管使用野生型病毒模拟实际感染，但慢病毒 PV 是研究与病毒进入和感染相关的机制的更安全选择，而无需处理致病病毒所需的严格安全要求 ^4,20,21。PV 由复制缺陷的病毒核心组成，该核心被致病病毒的表面包膜糖蛋白包围，这是研究的目的。

基于 HIV-1 的 PV 是使用最广泛的平台之一，这些平台已在该协?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filter	SARSTEDT	83 1826
6-well plate	SARSTEDT	83 3920
96-well plate	SARSTEDT	8,33,924
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units	Merck	10403892
Black Opaque 96-well Microplate	Perkin Elmer	60005270
Dulbecco's Modified Eagle Medium	SIGMA-ALDRICH	D6546 - 500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x)	AUROGENE	AU-L0615-500
Foetal Bovine Serum	AUROGENE	AU-S1810-500
Graphpad Prism version 7	graphpad dotmatics	NA	In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program'
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216
HEK293T/ACE2 cells	ATCC	CRL-3216	HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector.
L-glutamine	AUROGENE	AU-X0550-100
Luminometer - Victor3	Perkin Elmer	HH35000500	In the manuscript, we replace the commercial name with  'luminometer'
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	11058021	In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium'
p8.91 packaging plasmid	Di Genova et al., 2021		A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
pCSFLW reporter plasmid	Di Genova et al., 2021		A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
Penicillin/streptomycin	AUROGENE	AU-L0022-100
Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa)	SIGMA-ALDRICH	408727
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126)	Addgene	145839	This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2
SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid	Addgene	pGBW-m4137382
steadylite plus Reporter Gene Assay System	Perkin Elmer	6066759	In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent'
Trypsin EDTA 1x	AUROGENE	AU-L0949-100