Псевдотипированные вирусы как молекулярный инструмент мониторинга гуморальных иммунных реакций против SARS-CoV-2 с помощью нейтрализационного анализа

Резюме

Псевдотипированные вирусы (ЛВ) представляют собой вирионы с дефектами репликации, которые используются для изучения взаимодействий между хозяином и вирусом в более безопасных условиях, чем при работе с подлинными вирусами. Здесь представлен подробный протокол, показывающий, как ПВ SARS-CoV-2 можно использовать для проверки нейтрализующей способности сыворотки крови пациентов после вакцинации против COVID-19.

Аннотация

Псевдотипированные вирусы (ЛВ) представляют собой молекулярные инструменты, которые могут быть использованы для изучения взаимодействий между вирусом хозяина и для проверки нейтрализующей способности образцов сыворотки, в дополнение к их более известному использованию в генной терапии для доставки интересующего гена. ФВ являются дефектными для репликации, потому что вирусный геном разделен на различные плазмиды, которые не включены в ФВ. Эта безопасная и универсальная система позволяет использовать фотоэлектрические элементы в лабораториях 2-го уровня биобезопасности. Здесь мы представляем общую методологию получения лентивирусных ВП на основе трех плазмид, упомянутых здесь: (1) основная плазмида, несущая репортерный ген, необходимый для мониторинга инфекции; (2) упаковочная плазмида, несущая гены всех структурных белков, необходимых для генерации PV; (3) плазмида экспрессии гликопротеина на поверхности оболочки, которая определяет тропизм вируса и опосредует проникновение вируса в клетку-хозяина. В этой работе SARS-CoV-2 Spike представляет собой гликопротеин оболочки, используемый для производства нерепликативных псевдотипированных лентивирусов SARS-CoV-2.

Вкратце, упаковочные клетки (HEK293T) были котрансфицированы тремя различными плазмидами с использованием стандартных методов. Через 48 ч надосадочную жидкость, содержащую PV, собирали, фильтровали и хранили при -80 °C. Инфекционность ВВ SARS-CoV-2 проверяли путем изучения экспрессии репортерного гена (люциферазы) в клеточной линии-мишени через 48 ч после заражения. Чем выше значение единиц относительной люминесценции (RLU), тем выше частота заражения/трансдукции. Кроме того, к последовательно разбавленным образцам сыворотки крови добавляли инфекционные ФВ для изучения процесса нейтрализации проникновения псевдовирусов в клетки-мишени, измеряемого как снижение интенсивности РЛУ: более низкие значения, соответствующие высокой нейтрализующей активности.

Введение

Псевдотипированные вирусы (ФВ) — это молекулярные инструменты, используемые в микробиологии для изучения взаимодействий вируса-хозяина и патоген-патоген 1,2,3,4. PV состоят из внутренней части, вирусного ядра, которое защищает вирусный геном, и внешней части, гликопротеинов оболочки на поверхности вируса, которые определяют^{тропизм.} Псевдовирус неспособен к репликации в клетке-мишени, потому что он не содержит всей генетической информации для генерации новых вирусных частиц. Такое сочетание специфических особенностей д....

протокол

Настоящий протокол был одобрен и соответствует руководящим принципам Этического комитета Университета Вероны (протокол утверждения No 1538). От людей, участвовавших в исследовании, было получено информированное письменное согласие. Образцы цельной крови были взяты у добровольцев из числа медицинских работников, которые находились в процессе получения вакцин против SARS-CoV-2. Эти образцы собирали в пластиковые пробирки, содержащие антикоагулянты, для последующего выделения сыворотки¹⁵.

Все последующие процессы должны выполняться в биологическом колпаке класса 2, работающем в стерильных условиях. Обращение с вирусами ....

Результаты

В настоящем протоколе описывается производство ПВ SARS-CoV-2 и последующее применение этих ПВ для анализа нейтрализующей активности сыворотки/плазмы у субъектов, получающих вакцинацию против COVID-19¹⁷. Кроме того, этот протокол может быть применен для получения псевдотипов кажд?.......

Обсуждение

Несмотря на то, что использование вируса дикого типа имитирует реальную инфекцию, лентивирусные ФВ являются более безопасным вариантом для изучения механизмов, связанных с проникновением вируса и инфекцией, без строгих требований безопасности, необходимых для работы с патогенными ви.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filter	SARSTEDT	83 1826
6-well plate	SARSTEDT	83 3920
96-well plate	SARSTEDT	8,33,924
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units	Merck	10403892
Black Opaque 96-well Microplate	Perkin Elmer	60005270
Dulbecco's Modified Eagle Medium	SIGMA-ALDRICH	D6546 - 500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x)	AUROGENE	AU-L0615-500
Foetal Bovine Serum	AUROGENE	AU-S1810-500
Graphpad Prism version 7	graphpad dotmatics	NA	In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program'
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216
HEK293T/ACE2 cells	ATCC	CRL-3216	HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector.
L-glutamine	AUROGENE	AU-X0550-100
Luminometer - Victor3	Perkin Elmer	HH35000500	In the manuscript, we replace the commercial name with  'luminometer'
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	11058021	In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium'
p8.91 packaging plasmid	Di Genova et al., 2021		A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
pCSFLW reporter plasmid	Di Genova et al., 2021		A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
Penicillin/streptomycin	AUROGENE	AU-L0022-100
Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa)	SIGMA-ALDRICH	408727
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126)	Addgene	145839	This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2
SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid	Addgene	pGBW-m4137382
steadylite plus Reporter Gene Assay System	Perkin Elmer	6066759	In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent'
Trypsin EDTA 1x	AUROGENE	AU-L0949-100