Virus pseudotipizzati come strumento molecolare per monitorare le risposte immunitarie umorali contro SARS-CoV-2 tramite test di neutralizzazione

Riepilogo

I virus pseudotipizzati (PV) sono virioni difettosi di replicazione che vengono utilizzati per studiare le interazioni ospite-virus in condizioni più sicure rispetto alla manipolazione di virus autentici. Di seguito è presentato un protocollo dettagliato che mostra come i PV SARS-CoV-2 possono essere utilizzati per testare la capacità neutralizzante del siero dei pazienti dopo la vaccinazione COVID-19.

Abstract

I virus pseudotipizzati (PV) sono strumenti molecolari che possono essere utilizzati per studiare le interazioni ospite-virus e per testare la capacità neutralizzante di campioni di siero, oltre al loro uso più noto nella terapia genica per la veicolazione di un gene di interesse. I PV sono difettosi di replicazione perché il genoma virale è diviso in diversi plasmidi che non sono incorporati nei PV. Questo sistema sicuro e versatile consente l'uso di PV in laboratori di livello di biosicurezza 2. Qui, presentiamo una metodologia generale per produrre PV lentivirali basata su tre plasmidi come menzionato qui: (1) il plasmide della spina dorsale che trasporta il gene reporter necessario per monitorare l'infezione; (2) il plasmide impacchettatore che trasporta i geni per tutte le proteine strutturali necessarie per generare le PVs; (3) il plasmide di espressione della glicoproteina superficiale dell'involucro che determina il trofismo del virus e media l'ingresso virale nella cellula ospite. In questo lavoro, SARS-CoV-2 Spike è la glicoproteina dell'involucro utilizzata per la produzione di lentivirus pseudotipizzati SARS-CoV-2 non replicati.

In breve, le cellule di impacchettamento (HEK293T) sono state co-trasfettate con i tre diversi plasmidi utilizzando metodi standard. Dopo 48 ore, il surnatante contenente i PV è stato raccolto, filtrato e conservato a -80 °C. L'infettività dei PV di SARS-CoV-2 è stata testata studiando l'espressione del gene reporter (luciferasi) in una linea cellulare bersaglio 48 ore dopo l'infezione. Maggiore è il valore delle unità di luminescenza relativa (RLU), maggiore è il tasso di infezione/trasduzione. Inoltre, i PV infettivi sono stati aggiunti ai campioni di siero diluiti in serie per studiare il processo di neutralizzazione dell'ingresso degli pseudovirus nelle cellule bersaglio, misurato come riduzione dell'intensità dell'RLU: valori più bassi corrispondenti a un'elevata attività neutralizzante.

Introduzione

I virus pseudotipizzati (PV) sono strumenti molecolari utilizzati in microbiologia per studiare le interazioni ospite-virus e patogeno-patogeno 1,2,3,4. I PV sono costituiti da una parte interna, il nucleo virale che protegge il genoma virale, e da una parte esterna, le glicoproteine dell'involucro sulla superficie del virus che definisce il tropismo⁵. Uno pseudovirus è incompetente nella replicazione della cellula bersaglio perché non contiene tutte le informazioni genetiche per generare nuove particelle virali. Ques....

Protocollo

Il presente protocollo è stato approvato e segue le linee guida del Comitato Etico dell'Università di Verona (protocollo di approvazione numero 1538). Il consenso scritto informato è stato ottenuto dai soggetti umani che hanno partecipato allo studio. I campioni di sangue intero sono stati raccolti da volontari operatori sanitari (HCW) che erano in procinto di ricevere vaccini anti-SARS-CoV-2. Questi campioni sono stati raccolti in provette di plastica contenenti anticoagulanti per il successivo isolamento del siero¹⁵.

Tutti i seguenti processi devono essere eseguiti in una cappa biologica di Classe 2, lavorando in c....

Discussione

Sebbene l'utilizzo di un virus wildtype simuli l'infezione effettiva, i PV lentivirali sono un'opzione più sicura per studiare i meccanismi associati all'ingresso e all'infezione virale senza i severi requisiti di sicurezza necessari per lavorare con i virus patogeni ^4,20,21. I PV sono composti da un nucleo virale difettoso di replicazione circondato dalla glicoproteina dell'involucro superficiale di un virus patogeno che è l'.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filter	SARSTEDT	83 1826
6-well plate	SARSTEDT	83 3920
96-well plate	SARSTEDT	8,33,924
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units	Merck	10403892
Black Opaque 96-well Microplate	Perkin Elmer	60005270
Dulbecco's Modified Eagle Medium	SIGMA-ALDRICH	D6546 - 500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x)	AUROGENE	AU-L0615-500
Foetal Bovine Serum	AUROGENE	AU-S1810-500
Graphpad Prism version 7	graphpad dotmatics	NA	In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program'
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216
HEK293T/ACE2 cells	ATCC	CRL-3216	HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector.
L-glutamine	AUROGENE	AU-X0550-100
Luminometer - Victor3	Perkin Elmer	HH35000500	In the manuscript, we replace the commercial name with  'luminometer'
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	11058021	In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium'
p8.91 packaging plasmid	Di Genova et al., 2021		A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
pCSFLW reporter plasmid	Di Genova et al., 2021		A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
Penicillin/streptomycin	AUROGENE	AU-L0022-100
Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa)	SIGMA-ALDRICH	408727
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126)	Addgene	145839	This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2
SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid	Addgene	pGBW-m4137382
steadylite plus Reporter Gene Assay System	Perkin Elmer	6066759	In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent'
Trypsin EDTA 1x	AUROGENE	AU-L0949-100