早期无引导人脑类器官神经血管生态位建模到允许的雏鸡胚绒毛膜尿囊膜中

摘要

在这里，我们提出了一种将处于多个成熟阶段的人脑类器官移植到鸡绒毛膜尿囊膜 （CAM） 中的方案。大脑类器官是按照无指导的标准化协议生长的。

摘要

将类器官移植到模型动物的血管化组织中，例如免疫缺陷小鼠或鸡胚绒毛膜尿囊膜 （CAM），已被证明对新生血管形成建模有效。CAM是一种富含血管化的胚外膜，其免疫反应性有限，因此成为人源性细胞移植的优良宿主模型。

本文描述了将多个成熟阶段分化的人脑类器官移植到CAM中的策略。大脑类器官的细胞组成随时间而变化，反映了人类大脑发育的里程碑。我们将相关成熟阶段的脑类器官移植到胚胎日（E）7鸡胚胎的CAM中：神经上皮扩增（18 DIV），早期神经发生（60 DIV）和早期胶质生成（180 DIV）。5 天后收获移植的脑类器官并分析其组织学特征。

在移植的类器官中未检测到新生血管形成的组织学迹象或与移植物相邻的异常血管。此外，在移植类器官的细胞组成中观察到显着变化，即胶质纤维酸性蛋白阳性反应性星形胶质细胞的数量增加。然而，细胞结构的变化取决于类器官成熟阶段。总而言之，这些结果表明，大脑类器官可以在CAM中生长，并且它们根据移植时的成熟阶段显示出细胞结构的差异。

引言

人脑类器官是一种新兴技术，使我们能够在体外概括人脑的早期发育^1,2,3。然而，该模型的主要局限性之一是缺乏血管化，血管化不仅在大脑稳态中起着不可或缺的作用，而且在大脑发育中也起着不可或缺的作用⁴.除了输送氧气和营养物质外，越来越多的证据表明，大脑的血管系统在发育过程中调节神经分化、迁移和突触发生 ^5,6。因此，迫切需要建立可靠的模型，为大脑类器官提供缺失的血管信号和结构，从而增强人脑类器官生成⁷的复杂性。

在所提出的血管化方法中，可以考虑两种主要的流线型：类器官移植到活生物体中，以及共培养内皮细胞和神经细胞的纯体外技术8,9,10,11,12。

研究方案

白角鸡（Gallus gallus）胚胎按照美国国家研究委员会生命科学委员会实验动物资源研究所的实验动物护理和使用指南进行处理，实验由巴塞罗那大学实验动物护理和使用委员会批准。

1.非引导脑类器官制备

1. 在室温（RT）下预热的mTESR1中维持H9人胚胎干细胞（hESCs），在6孔板中溶解在DMEM（1：40）中的溶解在5%CO₂ 培养箱中，溶解在DMEM（1：40）中。
   注意：基质胶必须保存在冰中，直到用作涂层以防止其聚合。
2. 按照无指导的大脑协议 ² 生成大脑类器官。
   1. 使用500μL细胞解离溶液解离H9 hESCs，并在37°C下孵育3-5分钟。 重悬于含有 ROCK 抑制剂 Y27632（终浓度 50 μM）的 mTESR1 中，并在低粘附预处理的 96 孔板中每孔接种 9,000 个细胞。
   2. 一旦类器官聚集在含有ROCK抑制剂Y27632（终浓度50μM）的mTESR1中，将它们转移到诱导培养基中5-6天。
   3. 遵循非引导脑类器官方案²⁶，在 ~ 天 4-5 时将类器官转移到神经诱导培养基中。
   4. 一旦它们获得大小和神经上皮环，将它们转移到冰冷的基质胶滴剂中。基质胶聚合后，将类器官转移到装有....

讨论

在这项研究中，我们描述了一个包含许多关键步骤的详细方案，这些步骤在移植时提供人脑类器官的有利生长和发育，而不会干扰鸡胚胎的存活。我们建议在孵育24小时（第1天）后使用无菌针刺穿鸡蛋的气室。此外，我们还尝试在第 4 天进行穿刺（在用光检查蛋壳以测试脉管系统的发育以确保我们只使用健康的胚胎后）。然而，由于CAM血管靠近蛋壳，这导致胚胎活力下降。应该注意的是，施加过?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse	BioLegend	801201	1:1,000
Anti-GFAP, rabbit	GeneTex	GTX108711	1:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat.	Invitrogen	A-21206	1:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat	Jackson ImmunoResearch	715-585-150	1:500
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs	Granja Gibert (Cambrils, Spain)
DAPI	Invitrogen	D1306	1:10,000
DPX	Sigma	100579	xylene-based mounting medium
Gentle Dissociation Solution	CreativeBiolabs	ITS-0622-YT187	cell dissociation solution
Matrigel	BD Biosciences	356234
Mowiol 4-88 mounting media	Merk	81381
Paper towel, lab-grade	Sigma-Aldrich	Z188956
ROCK inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	10 nM
Sharp-Point Surgical Scissors	VWR	470106-340
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ