早期无引导人脑类器官神经血管生态位建模到允许的雏鸡胚绒毛膜尿囊膜中

摘要

在这里，我们提出了一种将处于多个成熟阶段的人脑类器官移植到鸡绒毛膜尿囊膜 （CAM） 中的方案。大脑类器官是按照无指导的标准化协议生长的。

摘要

将类器官移植到模型动物的血管化组织中，例如免疫缺陷小鼠或鸡胚绒毛膜尿囊膜 （CAM），已被证明对新生血管形成建模有效。CAM是一种富含血管化的胚外膜，其免疫反应性有限，因此成为人源性细胞移植的优良宿主模型。

本文描述了将多个成熟阶段分化的人脑类器官移植到CAM中的策略。大脑类器官的细胞组成随时间而变化，反映了人类大脑发育的里程碑。我们将相关成熟阶段的脑类器官移植到胚胎日（E）7鸡胚胎的CAM中：神经上皮扩增（18 DIV），早期神经发生（60 DIV）和早期胶质生成（180 DIV）。5 天后收获移植的脑类器官并分析其组织学特征。

在移植的类器官中未检测到新生血管形成的组织学迹象或与移植物相邻的异常血管。此外，在移植类器官的细胞组成中观察到显着变化，即胶质纤维酸性蛋白阳性反应性星形胶质细胞的数量增加。然而，细胞结构的变化取决于类器官成熟阶段。总而言之，这些结果表明，大脑类器官可以在CAM中生长，并且它们根据移植时的成熟阶段显示出细胞结构的差异。

引言

人脑类器官是一种新兴技术，使我们能够在体外概括人脑的早期发育^1,2,3。然而，该模型的主要局限性之一是缺乏血管化，血管化不仅在大脑稳态中起着不可或缺的作用，而且在大脑发育中也起着不可或缺的作用⁴.除了输送氧气和营养物质外，越来越多的证据表明，大脑的血管系统在发育过程中调节神经分化、迁移和突触发生 ^5,6。因此，迫切需要建立可靠的模型，为大脑类器官提供缺失的血管信号和结构，从而增强人脑类器官生成⁷的复杂性。

在所提出的血管化方法中，可以考虑两种主要的流线型：类器官移植到活生物体中，以及共培养内皮细胞和神经细胞的纯体外技术8,9,10,11,12。小鼠脑移植既昂贵又耗时，这使得其他技术与更简单的模型相关。雏鸡绒毛膜尿囊膜 （CAM） 测定已广泛用于研究血管生成 13,14,15。在过去的十年中，几个小组成功地将不同类型的类器官（包括肾脏^16,17、心脏¹⁸ 和肿瘤类器官^19,20）移植到 CAM 中。然而，人们对将人脑类器官移植到 CAM 中的功效、毒性/排斥反应、生理效应和方法知之甚少。另一个有趣但尚未探索的方面是在CAM和类器官星形胶质细胞界面之间形成嵌合血脑屏障（BBB）。先前的开创性工作表明，通过移植星形胶质细胞和星形胶质细胞条件培养基在CAM中产生BBB的假定可行性21,22,23。然而，成熟的星形胶质细胞似乎无法达到这个^24,25。因此，星形胶质细胞诱导的BBB形成仍然存在争议，移植人脑类器官将使我们能够阐明这一争议。

这篇视频文章描述了一种 将卵 内人脑类器官移植到 CAM 中的方案，该方案可促进生长、改善和血管化，从而产生包含组织学相容的 BBB 元件的类器官。在这里，我们提出了一个确保鸡胚胎存活的方案，并报告了CAM维持大脑类器官生长的允许性。

研究方案

白角鸡（Gallus gallus）胚胎按照美国国家研究委员会生命科学委员会实验动物资源研究所的实验动物护理和使用指南进行处理，实验由巴塞罗那大学实验动物护理和使用委员会批准。

1.非引导脑类器官制备

1. 在室温（RT）下预热的mTESR1中维持H9人胚胎干细胞（hESCs），在6孔板中溶解在DMEM（1：40）中的溶解在5%CO₂ 培养箱中，溶解在DMEM（1：40）中。
   注意：基质胶必须保存在冰中，直到用作涂层以防止其聚合。
2. 按照无指导的大脑协议 ² 生成大脑类器官。
   1. 使用500μL细胞解离溶液解离H9 hESCs，并在37°C下孵育3-5分钟。 重悬于含有 ROCK 抑制剂 Y27632（终浓度 50 μM）的 mTESR1 中，并在低粘附预处理的 96 孔板中每孔接种 9,000 个细胞。
   2. 一旦类器官聚集在含有ROCK抑制剂Y27632（终浓度50μM）的mTESR1中，将它们转移到诱导培养基中5-6天。
   3. 遵循非引导脑类器官方案²⁶，在 ~ 天 4-5 时将类器官转移到神经诱导培养基中。
   4. 一旦它们获得大小和神经上皮环，将它们转移到冰冷的基质胶滴剂中。基质胶聚合后，将类器官转移到装有 5 mL 预热成熟培养基的 5 cm 低粘附培养皿中。
   5. 4天后，将大脑类器官置于眼眶搅动下。
3. 在嫁接前立即收集类器官以在新鲜的DPBS中收获。

2.卵子维持、发育激活、蛋壳穿刺

1. 将受精卵（第0天）储存在18°C的培养箱中直至使用。
   注意：在此温度下，它们不会发育，而是保持在同一成熟阶段。
2. 当需要使用时，将它们在38°C和60%相对湿度下孵育，并以45°C的角度轻柔地旋转。
3. 在第 1 天，用 70% 乙醇清洁蛋壳表面，然后用纸巾擦干以消毒。
4. 将手术纸粘性绷带（以下简称“绷带”）放在鸡蛋顶部，覆盖鸡蛋的气室。
   注意： 这将防止蛋壳中的灰尘落入卡住的凸轮中。
5. 用无菌针 21 G x 11/2'' 轻轻刺穿蛋壳，进行气室穿孔穿刺，以下简称气室孔 （ACH）。打开鸡蛋上端的 ACH，以免干扰 CAM，此时 CAM 与蛋壳分离。
6. 要找到刺穿 ACH 的最佳位置，请使用灯确定鸡蛋上端最薄的蛋壳表面。直射光束透射指示最佳钻孔位置。
7. 用新的绷带覆盖ACH以保护胚胎免受外部环境的影响，然后将卵子放回孵化器中。
8. 从这一刻起，停止在孵化器中旋转，并将鸡蛋保持在垂直位置，窗口在顶部。
   注意：这将促进胚胎的发育，并且CAM在顶部可用，胚胎和蛋壳之间有一个空气室，允许随后的嫁接。
9. 从第 1 天到第 4 天打开 ACH。活力在第 4 天（移植日前 3 天）增加。

3.脑类器官移植

1. 在第 7 天进行移植，此时 CAM 发育良好且血管化，将卵子覆盖整个胚胎。
2. 取下绷带，用 70% 乙醇擦拭蛋壳表面以对蛋壳进行消毒，然后小心地将 ACH 拓宽到移植窗口中。
3. 在最终移植窗口之外放置一个新的、更大的绷带覆盖延伸部分，以避免蛋壳碎片在扩大移植窗口时落入 CAM。
   注意：需要这个更大的窗口来选择最佳嫁接位置和后续嫁接。
4. 通过轻轻刺穿蛋壳来扩大嫁接窗口，直到窗口达到约 2 厘米的直径。用镊子轻轻去除蛋壳窗口的边缘，直到窗口放大。轻轻剥下绷带，去除剩余的灰尘和蛋壳碎片，这些灰尘和蛋壳碎片将保持附着在绷带上。
5. 使用P200自动移液器放置类器官。用无菌和锋利的剪刀剪断尖端，以根据类器官的大小扩大开口，并防止损坏类器官或使用宽规格转移无菌尖端。将类器官收集在最大体积为50μL的PBS中，并将其直接转移到与胚胎位置相反的CAM中。
6. 确保移植物的位置远离卵黄，以避免其在收获过程中破裂，最好将其放置在血管附近。
7. 将类器官放在CAM上后，在类器官周围滴一滴7μL基质胶。
   注意：这将防止类器官在膜周围移动。
8. 使用一小块适合窗户确切尺寸的封口膜关闭窗户，并用粘性绷带将其固定在外壳上。
   注意： 重要的是要用封口膜完全覆盖窗户，以避免胚胎变干，同时允许气体交换。正确划定窗口覆盖范围的延伸，避免超过窗口，因为它可能阻碍正确胚胎发育所需的气体交换²⁷.

4. 移植类器官收获

1. 在鸡发育的第 12 天收获嫁接的类器官和周围的 CAM，对应于 38 Hamburger 和 Hamilton 发育阶段 （HH38）²⁸，嫁接后 5 天。在这个阶段，CAM与成熟的脉管系统完全分化，而羽毛胚芽覆盖了翅膀和胚胎的上眼睑。
2. 取下粘性绷带后，进一步扩大窗口，以便于使用剪刀和细镊子采集样品。
3. 如果需要，在双眼解剖显微镜的帮助下可视化类器官，然后用 4% 多聚甲醛 （PFA） 进行 2 分钟的预固定步骤，以帮助类器官和 CAM 收获。
4. 收集含有类器官的 1.5 cm² CAM 部分。
5. 样品固定
   1. 用1x PBS洗涤样品，并在4°C下用4%PFA（PBS，pH 7.2）固定30分钟。 然后，在PBS中洗涤样品3×5分钟。
   2. 将样品储存在4°C的PBS中，或直接在4°C下将其冷冻保护在30%蔗糖 - PBS中过夜。
   3. 冷冻保护后，将样品嵌入最佳切割温度化合物（OCT）中，并将其储存在-20°C直至切片。使用低温恒温器切割20μm厚的组织切片，并将它们收集在木二甲苯化载玻片上。将载玻片储存在-20°C，直到它们用于染色。

5. 免疫荧光

1. 用含有0.1%Triton X-100（PBS-T）的PBS溶液在室温（RT）下10分钟从切片中除去OCT.。
2. 用封闭溶液（BS）和2%BSA，3%驴血清PBS-T 0.01%溶液在室温下处理1小时。
3. 在BS中稀释选定的一抗（参见 材料表），并将样品在4°C下孵育过夜。
4. 第二天，在室温下用1x PBS洗涤样品3×10分钟。
5. 在BS中稀释二抗，并在室温下孵育2小时（参见 材料表）。
6. 将样品与4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）一起孵育10分钟，以在室温下标记细胞核，在PBS-T中以1：1,000稀释度稀释。
7. 用安装介质安装载玻片，并用玻璃盖玻片盖住。
8. 使用宽视场荧光显微镜以 2.5、10、20 和 40 倍拍摄所有图像。
9. 将切片储存在4°C。

6. 苏木精和伊红（H&E）染色

注意：为了证明移植有效，请进行H&E染色。

1. 用 PBS-T 0.1% 在室温下去除 OCT 10 分钟。
2. 在抽油烟机中进行连续脱水，如下所示：蒸馏水 （DW） 10 分钟，苏木精 45 秒，DW 1 分钟，PBS 20 秒，70% EtOH 2 x 30 秒，80% EtOH 2 x 30 秒，96% EtOH 2 x 30 秒，曙红 30 秒，96% EtOH 2 x 15 秒， 100%乙醇溶液2×15秒，木二甲酚-100%乙醇溶液1分钟，木二甲酚溶液1分钟（新鲜）溶液1分钟。
3. 用二甲苯基封装介质安装玻璃盖玻片。

结果

选择移植的胚胎成熟时间表
当受精卵在38°C和60%相对湿度下孵化时，实验从D0开始。绒毛膜尿囊膜 （CAM） 是一种高度血管化的胚外膜，在卵子孵化后发育。它是由尿囊和绒毛膜融合而成的。在D1处，孵育24小时后，刺穿气室以防止CAM附着在内壳膜上。与后期穿刺 （D4） 相比，在 D1 处刺穿气室可提高气室的质量。CAM继续生长，直到D12，当它包裹整个卵子内容物并牢固地粘附在内壳膜?...

讨论

在这项研究中，我们描述了一个包含许多关键步骤的详细方案，这些步骤在移植时提供人脑类器官的有利生长和发育，而不会干扰鸡胚胎的存活。我们建议在孵育24小时（第1天）后使用无菌针刺穿鸡蛋的气室。此外，我们还尝试在第 4 天进行穿刺（在用光检查蛋壳以测试脉管系统的发育以确保我们只使用健康的胚胎后）。然而，由于CAM血管靠近蛋壳，这导致胚胎活力下降。应该注意的是，施加过?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse	BioLegend	801201	1:1,000
Anti-GFAP, rabbit	GeneTex	GTX108711	1:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat.	Invitrogen	A-21206	1:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat	Jackson ImmunoResearch	715-585-150	1:500
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs	Granja Gibert (Cambrils, Spain)
DAPI	Invitrogen	D1306	1:10,000
DPX	Sigma	100579	xylene-based mounting medium
Gentle Dissociation Solution	CreativeBiolabs	ITS-0622-YT187	cell dissociation solution
Matrigel	BD Biosciences	356234
Mowiol 4-88 mounting media	Merk	81381
Paper towel, lab-grade	Sigma-Aldrich	Z188956
ROCK inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	10 nM
Sharp-Point Surgical Scissors	VWR	470106-340
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ