Modelagem Inicial de Nicho Neurovascular Organoide Cerebral Humano Não Guiado na Membrana Corioalantóide Permissiva do Embrião de Pinto

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para enxertar organoides cerebrais humanos em múltiplos estágios de maturação na membrana corioalantóide (CAM) de pintinhos. Os organoides cerebrais foram cultivados seguindo protocolos padronizados não guiados.

Resumo

A enxertia de organoides em tecidos vascularizados em animais modelo, como a membrana corioalantóide (CAM) imunodeficiente de camundongos ou embriões de pintinhos, tem se mostrado eficiente para a modelagem da neovascularização. A CAM é uma membrana extraembrionária ricamente vascularizada, que apresenta imunorreatividade limitada, tornando-se um excelente modelo hospedeiro para transplantes de células de origem humana.

Este trabalho descreve a estratégia para enxertar organoides cerebrais humanos diferenciados em múltiplos estágios de maturação no MAC. A composição celular dos organoides cerebrais muda com o tempo, refletindo os marcos do desenvolvimento do cérebro humano. Nós enxertamos organoides cerebrais em estágios de maturação relevantes: expansão neuroepitelial (18 DIV), neurogênese precoce (60 DIV) e gliogênese precoce (180 DIV) na CAM de embriões embrionários dia (E)7 de galinha. Organoides cerebrais enxertados foram colhidos 5 dias depois e suas características histológicas foram analisadas.

Não foram detectados sinais histológicos de neovascularização nos organoides enxertados ou vasos sanguíneos anormais adjacentes aos enxertos. Além disso, mudanças marcantes foram observadas na composição celular dos organoides enxertados, a saber, um aumento no número de astrócitos gliais fibrilares ácidos-positivos-reativos. Entretanto, as alterações citoarquiteturais foram dependentes do estágio de maturação dos organoides. Em conjunto, esses resultados sugerem que organoides cerebrais podem crescer no MAC e mostram diferenças na citoarquitetura dependendo do estágio de maturação na enxertia.

Introdução

Os organoides cerebrais humanos são uma técnica emergente que nos permite recapitular in vitro o desenvolvimento inicial do cérebro humano ^1,2,3. No entanto, uma das principais limitações desse modelo é a falta de vascularização, que desempenha papéis indispensáveis não só na homeostase cerebral, mas também no desenvolvimento^cerebral4. Além da oferta de oxigênio e nutrientes, evidências acumuladas sugerem que o sistema vascular cerebral regula a diferenciação neural, migração e sinaptogênese durante o desenvolvimento ^5,6. Portanto, há uma necessidade urgente de estabelecer modelos confiáveis que possam fornecer a sinalização e a estrutura vascular ausente aos organoides cerebrais, aumentando a complexidade da geração de organoides cerebrais humanos⁷.

Dentre os métodos de vascularização propostos, duas principais linhas de atuação podem ser consideradas: enxertia organoide em organismo vivo e tecnologias puramente in vitro co-cultivando células endoteliais e neurais8,9,10,11,12. O transplante intracerebral em camundongos é caro e demorado, tornando outras tecnologias relevantes para modelos mais simples. O ensaio de membrana corioalantóide (CAM) em pintinhos tem sido amplamente utilizado para estudar a angiogênese 13,14,15. Na última década, vários grupos enxertaram com sucesso diferentes tipos de organoides, incluindo organoides^renais16,17, cardíacos18 e tumorais19,20, em CAMs. No entanto, pouco se sabe sobre a eficácia, toxicidade/rejeição, efeito fisiológico e métodos para enxertar organoides cerebrais humanos no CAM. Outro aspecto interessante e ainda inexplorado é a formação de uma barreira hematoencefálica quimérica (BHE) entre as MAC e a interface astrocitária organoide. Trabalhos pioneiros anteriores sugeriram a viabilidade putativa de gerar uma BBB na CAM por meio do transplante de astrócitos e meio condicionado por astrócitos 21,22,23. No entanto, astrócitos maduros parecem ser incapazes de atingir esse^{objetivo 24,25}. Assim, a formação induzida por astrócitos do BBB permanece discutível, e o transplante de organoides cerebrais humanos nos permitiria lançar luz sobre essa controvérsia.

Este artigo em vídeo descreve um protocolo para um transplante in ovo de organoides cerebrais humanos em CAM que promove crescimento, melhora e vascularização, resultando em organoides que englobam elementos BBB histologicamente compatíveis. Aqui, apresentamos um protocolo garantindo a sobrevivência do embrião de galinha e relatamos a permissividade da CAM para sustentar o crescimento organoide cerebral.

Protocolo

Os embriões de galinha-de-leghorn (Gallus gallus) foram tratados seguindo o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals do Institute of Laboratory Animals Resources, Commission of Life Sciences, National Research Council, EUA, e os experimentos foram aprovados pelo Council for Care and Use of Experimental Animals da Universidade de Barcelona.

1. Preparação organoide cerebral não guiada

1. Manter as células estaminais embrionárias humanas H9 (hESCs) em mTESR1 pré-aquecidas à temperatura ambiente (RT) sob uma confluência de 70% em placas de 6 poços revestidas com Matrigel dissolvido em DMEM (1:40) numa incubadora de 5% CO₂ a 37 °C.
   OBS: O matrigel deve ser mantido em gelo até sua utilização como revestimento para evitar sua polimerização.
2. Gerar organoides cerebrais seguindo o protocolo cerebral não guiado ².
   1. Dissociar H9 hESCs usando 500 μL da Solução de Dissociação Celular e incubar por 3-5 min a 37 °C. Ressuspender em mTESR1 contendo um inibidor de ROCK Y27632 (concentração final de 50 μM) e semear 9.000 células por poço em uma placa de 96 poços pré-tratada de baixa adesão.
   2. Uma vez que os organoides se agregam em mTESR1 contendo um inibidor de ROCK Y27632 (concentração final de 50 μM), transfira-os para o meio de indução por 5-6 dias.
   3. Seguindo protocolo organoide cerebral não guiado²⁶, transferir os organoides para meios de indução neural em ~dias 4-5.
   4. Uma vez que eles adquirem o tamanho e o anel do neuroepitélio, transfira-os para uma gota de Matrigel gelada. Uma vez polimerizado o Matrigel, transferir os organoides para uma placa de Petri de baixa adesão de 5 cm com 5 mL de meio de maturação pré-aquecido.
   5. Após 4 dias, colocar os organoides cerebrais sob agitação orbitária.
3. Coletar os organoides para colheita em DPBS fresco imediatamente antes da enxertia.

2. Manutenção, ativação do desenvolvimento e punção da casca do ovo

1. Conservar os ovos fertilizados (no dia 0) numa incubadora a 18 °C até à utilização.
   OBS: Nesta temperatura, não se desenvolvem, permanecendo no mesmo estágio de maturação.
2. Quando necessário para uso, incubá-los a 38 °C e 60% de umidade relativa com rotação de balanço suave em um ângulo de 45 °C.
3. No dia 1, limpe a superfície da casca do ovo com etanol 70% e seque-a com um papel toalha para esterilizá-la.
4. Coloque uma bandagem adesiva de papel cirúrgico, doravante denominada "bandagem", em cima do ovo, cobrindo a câmara de ar do ovo.
   NOTA: Isso evitará que a poeira da casca do ovo caia no CAM onde fica presa.
5. Realizar a punção da perfuração da câmara de ar, doravante denominada furo da câmara de ar (ACH), com agulha estéril 21 G x 11/2'', puncionando suavemente a casca do ovo. Abra o ACH na ponta superior do ovo para não perturbar o CAM, que neste ponto fica separado da casca.
6. Para encontrar a melhor posição para perfurar a ACH, use uma lâmpada para determinar a superfície mais fina da casca do ovo na ponta superior do ovo. A transmissão direta do feixe de luz indica a melhor posição para perfurar.
7. Cubra o ACH com um novo curativo para proteger o embrião do ambiente externo e coloque o ovo de volta na incubadora.
8. A partir deste momento, pare a rotação na incubadora e mantenha os ovos na posição vertical com a janela em cima.
   NOTA: Isso facilitará o desenvolvimento do embrião, e a CAM fica disponível na parte superior com uma câmara de ar entre o embrião e a casca do ovo, permitindo a posterior enxertia.
9. Abra o ACH do dia 1 ao dia 4. A viabilidade aumenta no dia 4 (3 dias antes do dia da enxertia).

3. Enxerto organoide cerebral

1. Realizar enxertia no 7º dia, quando a CAM estiver bem desenvolvida e vascularizada, cobrindo o óvulo por todo o embrião.
2. Remova o curativo e limpe a superfície da casca do ovo com etanol a 70% para esterilizar a casca do ovo, antes de alargar cuidadosamente o ACH em uma janela de enxertia.
3. Coloque um curativo novo e maior cobrindo a extensão além da janela final de enxertia para evitar que fragmentos de casca de ovo caiam na CAM enquanto amplia a janela de enxertia.
   NOTA: Esta janela maior é necessária para selecionar a melhor posição de enxertia e para posterior enxertia.
4. Ampliar a janela de enxertia puncionando suavemente a casca do ovo até que a janela atinja um diâmetro de aproximadamente 2 cm. Remova suavemente as bordas da janela da casca do ovo com uma pinça até que a janela seja ampliada. Remova o pó restante e os pedaços de casca de ovo que permanecerão presos ao curativo, descascando suavemente o curativo.
5. Coloque o organoide com uma pipeta automática P200. Corte as pontas com tesouras estéreis e afiadas para ampliar a abertura de acordo com o tamanho do organoide e evitar danos ao organoide ou use pontas estéreis de transferência de calibre largo. Coletar o organoide em um volume máximo de 50 μL de PBS e transferi-lo diretamente para o CAM, em um lado oposto ao local do embrião.
6. Certifique-se de que a posição do enxerto esteja distante da gema para evitar sua ruptura durante a colheita e, de preferência, coloque-o próximo a um vaso sanguíneo.
7. Coloque uma gota de 7 μL de Matrigel ao redor do organoide depois de colocar o organoide no CAM.
   NOTA: Isso impedirá que o organoide se mova ao redor da membrana.
8. Feche a janela usando um pequeno pedaço de parafilme que se encaixe no tamanho exato da janela e prenda-o à concha com uma bandagem adesiva.
   NOTA: É importante cobrir totalmente a janela com o parafilme para evitar que o embrião seque, permitindo a troca gasosa. Delimitar adequadamente a extensão da cobertura da janela, evitando ultrapassar a janela, pois poderia dificultar as trocas gasosas necessárias para o correto desenvolvimento embrionário²⁷.

4. Colheita de organoides transplantados

1. Colher os organoides enxertados e as CAM circunvizinhas no 12º dia de desenvolvimento do frango, correspondendo a 38 estádios de desenvolvimento de Hamburger e Hamilton (HH38)²⁸, 5 dias após a enxertia. Nesta fase, a CAM é totalmente diferenciada com a vasculatura madura, enquanto os germes das penas cobrem as asas, bem como a pálpebra superior do embrião.
2. Ao remover a bandagem adesiva, amplie ainda mais a janela para facilitar a colheita da amostra usando tesoura e pinça fina.
3. Visualize o organoide com a ajuda de uma microscopia de dissecção binocular, se necessário, seguida por uma etapa de 2 minutos de prefixação com paraformaldeído (PFA) a 4% para ajudar na coleta de organoides e CAM.
4. Coletar uma seção de 1,5 cm² da CAM contendo o organoide.
5. Fixação da amostra
   1. Lavar as amostras com 1x PBS e fixá-las com PFA a 4% (em PBS, pH 7,2) durante 30 min a 4 °C. Em seguida, lave as amostras por 3 x 5 min em PBS.
   2. Conservar as amostras a 4 °C em PBS com azida sódica ou crioprotegê-las directamente em 30% de sacarose-PBS durante a noite a 4 °C.
   3. Após a crioproteção, embuta as amostras em composto de temperatura de corte ideal (OCT) e armazene-as a -20 °C até a secção. Cortar fatias de tecido de 20 μm de espessura usando um criostato e coletá-las em lâminas xilanizadas. Conservar as lâminas a -20 °C até serem utilizadas para coloração.

5. Imunofluorescência

1. Remover OCT das seções com uma solução de PBS com Triton X-100 a 0,1% (PBS-T) por 10 min à temperatura ambiente (TR).
2. Tratar os cortes com uma solução de bloqueio (BS) com uma solução de BSA a 2%, soro de burro a 3% PBS-T 0,01% durante 1 h em RT.
3. Diluir o anticorpo primário selecionado (ver Tabela de Materiais) em BS e incubar amostras durante a noite a 4 °C.
4. No dia seguinte, lave as amostras 3 x 10 min em 1x PBS no RT.
5. Diluir o anticorpo secundário em BS e incubar durante 2 h em RT (ver Tabela de Materiais).
6. Incubar as amostras por 10 min com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para marcar os núcleos celulares em RT, diluídos em PBS-T na diluição de 1:1.000.
7. Monte as corrediças com meio de montagem e cubra com lamínulas de vidro.
8. Tire todas as imagens usando um microscópio de fluorescência de campo largo a 2,5, 10, 20 e 40x.
9. Conservar as fatias a 4 °C.

6. Coloração para hematoxilina e eosina (H&E)

OBS: Para comprovar que a enxertia funcionou, realizar coloração de H&E.

1. Remova a OCT com PBS-T 0,1% por 10 min no TR.
2. Realizar a desidratação seriada em uma coifa da seguinte forma: 10 min em água destilada (DW), 45 s em hematoxilina, 1 min em PS, 20 s em PBS, 2 x 30 s em EtOH 70%, 2 x 30 s em EtOH 80%, 2 x 30 s em EtOH 96%, 30 s em eosina, 2 x 15 s em EtOH 96%, 2 x 15 s em EtOH 100%, 1 min em xilol-100% ETOH, 1 min em xilol, 1 min em xilol (fresco).
3. Monte as lamínulas de vidro com um meio de montagem à base de xileno.

Resultados

Seleção do cronograma de maturação do embrião para o transplante
O experimento inicia-se em D0, quando os ovos fertilizados são incubados a 38 °C e 60% de umidade relativa. A membrana corioalantóide (MAC) é uma membrana extraembrionária altamente vascularizada que se desenvolve após a incubação dos ovos. É formado pela fusão do alantois e córion. Em D1, após 24 h de incubação, a câmara de ar é puncionada para impedir que a CAM se fixe à membrana interna do invólucro. A punção ...

Discussão

Neste estudo, descrevemos um protocolo detalhado com inúmeras etapas fundamentais que proporcionam crescimento e desenvolvimento favoráveis de organoides cerebrais humanos após a enxertia sem perturbar a sobrevivência dos embriões de galinha. Recomendamos o uso de agulhas estéreis para puncionar a câmara de ar do ovo após 24 h de incubação (dia 1). Além disso, também tentamos fazer a punção no 4º dia (após verificar a casca do ovo com luz para testar o desenvolvimento da vasculatura para ter certeza de qu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse	BioLegend	801201	1:1,000
Anti-GFAP, rabbit	GeneTex	GTX108711	1:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat.	Invitrogen	A-21206	1:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat	Jackson ImmunoResearch	715-585-150	1:500
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs	Granja Gibert (Cambrils, Spain)
DAPI	Invitrogen	D1306	1:10,000
DPX	Sigma	100579	xylene-based mounting medium
Gentle Dissociation Solution	CreativeBiolabs	ITS-0622-YT187	cell dissociation solution
Matrigel	BD Biosciences	356234
Mowiol 4-88 mounting media	Merk	81381
Paper towel, lab-grade	Sigma-Aldrich	Z188956
ROCK inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	10 nM
Sharp-Point Surgical Scissors	VWR	470106-340
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ