Erken Güdümsüz İnsan Beyni Organoid Nörovasküler Niş İzin Veren Civciv Embriyo Korioallantoik Membran Modellemesi

Özet

Burada, insan beyni organoidlerini çoklu olgunlaşma aşamalarında civciv koryoallantoik membranına (CAM) aşılamak için bir protokol sunuyoruz. Beyin organoidleri, kılavuzsuz standartlaştırılmış protokoller izlenerek büyütüldü.

Özet

İmmün yetmezliği olan fare veya civciv embriyosu koryoallantoik membran (CAM) gibi model hayvanlarda organoidlerin vaskülarize dokulara aşılanmasının neovaskülarizasyon modellemesi için etkili olduğu kanıtlanmıştır. CAM, sınırlı immünoreaktivite gösteren, zengin vaskülarize ekstraembriyonik bir zardır ve böylece insan kaynaklı hücre nakilleri için mükemmel bir barındırma modeli haline gelir.

Bu makale, çoklu olgunlaşma aşamalarında farklılaşmış insan beyni organoidlerini CAM'a aşılama stratejisini açıklamaktadır. Beyin organoidlerinin hücresel bileşimi, insan beyninin gelişiminin kilometre taşlarını yansıtacak şekilde zamanla değişir. Beyin organoidlerini ilgili olgunlaşma aşamalarında aşıladık: nöroepitelyal genişleme (18 DIV), erken nörojenez (60 DIV) ve erken gliogenez (180 DIV) embriyonik gün (E) 7 tavuk embriyolarının CAM'sine. Engrafted beyin organoidleri 5 gün sonra toplandı ve histolojik özellikleri analiz edildi.

Aşılanmış organoidlerde veya greftlere bitişik anormal kan damarlarında neovaskülarizasyonun histolojik belirtisi tespit edilmedi. Ayrıca, aşılanmış organoidlerin hücresel bileşiminde, yani glial fibriler asidik protein-pozitif-reaktif astrositlerin sayısında bir artış gözlenmiştir. Bununla birlikte, sitomimari değişiklikler organoid olgunlaşma aşamasına bağlıydı. Toplamda, bu sonuçlar beyin organoidlerinin CAM'de büyüyebileceğini ve aşılamadaki olgunlaşma aşamalarına bağlı olarak sitomimaride farklılıklar gösterdiğini göstermektedir.

Giriş

İnsan beyni organoidleri, insan beyninin erken gelişimini in vitro ^1,2,3 olarak özetlememizi sağlayan yeni bir tekniktir. Bununla birlikte, bu modelin en büyük sınırlamalarından biri, sadece beyin homeostazında değil, aynı zamanda beyin gelişiminde de vazgeçilmez rol oynayan vaskülarizasyon eksikliğidir⁴. Oksijen ve besin maddelerinin verilmesine ek olarak, biriken kanıtlar, beynin vasküler sisteminin gelişim sırasında nöral farklılaşmayı, göçü ve sinaptogenezi düzenlediğini göstermektedir ^5,6

Protokol

Beyaz Leghorn tavuğu (Gallus gallus) embriyoları, Laboratuvar Hayvanları Kaynakları Enstitüsü, Yaşam Bilimleri Komisyonu, Ulusal Araştırma Konseyi, ABD'den Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uyularak tedavi edildi ve deneyler Barselona Üniversitesi'nden Deney Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Konseyi tarafından onaylandı.

1. Rehbersiz beyin organoid preparatı

1. H9 insan embriyonik kök hücrelerini (hESC'ler), 37 °C'de %5'lik bir_CO2 inkübatöründe DMEM (1:40) içinde çözülmüş Matrigel ile kaplanmış 6 oyuklu plakalarda %70'lik bir birleşme altında oda sıcaklığında (RT) önceden ı....

Tartışmalar

Bu çalışmada, tavuk embriyolarının hayatta kalmasını bozmadan, aşılama üzerine insan beyni organoidlerinin olumlu büyümesini ve gelişmesini sağlayan çok sayıda anahtar adımdan oluşan ayrıntılı bir protokol tanımladık. 24 saatlik inkübasyondan sonra (1. gün) yumurtanın hava odasını delmek için steril iğnelerin kullanılmasını önerdik. Ek olarak, 4. günde de delinmeye çalıştık (sadece sağlıklı embriyolarla çalıştığımızdan emin olmak için damar sisteminin gelişimini test etm.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse	BioLegend	801201	1:1,000
Anti-GFAP, rabbit	GeneTex	GTX108711	1:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat.	Invitrogen	A-21206	1:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat	Jackson ImmunoResearch	715-585-150	1:500
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs	Granja Gibert (Cambrils, Spain)
DAPI	Invitrogen	D1306	1:10,000
DPX	Sigma	100579	xylene-based mounting medium
Gentle Dissociation Solution	CreativeBiolabs	ITS-0622-YT187	cell dissociation solution
Matrigel	BD Biosciences	356234
Mowiol 4-88 mounting media	Merk	81381
Paper towel, lab-grade	Sigma-Aldrich	Z188956
ROCK inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	10 nM
Sharp-Point Surgical Scissors	VWR	470106-340
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ