Erken Güdümsüz İnsan Beyni Organoid Nörovasküler Niş İzin Veren Civciv Embriyo Korioallantoik Membran Modellemesi

Özet

Burada, insan beyni organoidlerini çoklu olgunlaşma aşamalarında civciv koryoallantoik membranına (CAM) aşılamak için bir protokol sunuyoruz. Beyin organoidleri, kılavuzsuz standartlaştırılmış protokoller izlenerek büyütüldü.

Özet

İmmün yetmezliği olan fare veya civciv embriyosu koryoallantoik membran (CAM) gibi model hayvanlarda organoidlerin vaskülarize dokulara aşılanmasının neovaskülarizasyon modellemesi için etkili olduğu kanıtlanmıştır. CAM, sınırlı immünoreaktivite gösteren, zengin vaskülarize ekstraembriyonik bir zardır ve böylece insan kaynaklı hücre nakilleri için mükemmel bir barındırma modeli haline gelir.

Bu makale, çoklu olgunlaşma aşamalarında farklılaşmış insan beyni organoidlerini CAM'a aşılama stratejisini açıklamaktadır. Beyin organoidlerinin hücresel bileşimi, insan beyninin gelişiminin kilometre taşlarını yansıtacak şekilde zamanla değişir. Beyin organoidlerini ilgili olgunlaşma aşamalarında aşıladık: nöroepitelyal genişleme (18 DIV), erken nörojenez (60 DIV) ve erken gliogenez (180 DIV) embriyonik gün (E) 7 tavuk embriyolarının CAM'sine. Engrafted beyin organoidleri 5 gün sonra toplandı ve histolojik özellikleri analiz edildi.

Aşılanmış organoidlerde veya greftlere bitişik anormal kan damarlarında neovaskülarizasyonun histolojik belirtisi tespit edilmedi. Ayrıca, aşılanmış organoidlerin hücresel bileşiminde, yani glial fibriler asidik protein-pozitif-reaktif astrositlerin sayısında bir artış gözlenmiştir. Bununla birlikte, sitomimari değişiklikler organoid olgunlaşma aşamasına bağlıydı. Toplamda, bu sonuçlar beyin organoidlerinin CAM'de büyüyebileceğini ve aşılamadaki olgunlaşma aşamalarına bağlı olarak sitomimaride farklılıklar gösterdiğini göstermektedir.

Giriş

İnsan beyni organoidleri, insan beyninin erken gelişimini in vitro ^1,2,3 olarak özetlememizi sağlayan yeni bir tekniktir. Bununla birlikte, bu modelin en büyük sınırlamalarından biri, sadece beyin homeostazında değil, aynı zamanda beyin gelişiminde de vazgeçilmez rol oynayan vaskülarizasyon eksikliğidir⁴. Oksijen ve besin maddelerinin verilmesine ek olarak, biriken kanıtlar, beynin vasküler sisteminin gelişim sırasında nöral farklılaşmayı, göçü ve sinaptogenezi düzenlediğini göstermektedir ^5,6. Bu nedenle, beyin organoidlerine eksik vasküler sinyalleme ve yapı sağlayabilecek ve insan beyni organoid neslinin^{karmaşıklığını} artırabilecek güvenilir modeller oluşturmaya acil bir ihtiyaç vardır 7.

Vaskülarizasyon için önerilen yöntemler arasında iki ana akım düşünülebilir: canlı bir organizmaya organoid aşılama ve tamamen in vitro teknolojiler endotel hücrelerini ve sinir hücrelerini birlikte kültürleyen 8,9,10,11,12. Farelerde intraserebral transplantasyon maliyetli ve zaman alıcıdır, bu da diğer teknolojileri daha basit modeller için uygun hale getirir. Civciv koryoallantoik membran (CAM) testi, anjiyogenezi incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır 13,14,15. Son on yılda, birkaç grup, böbrek^16,17, kardiyak¹⁸ ve tümör organoidleri^19,20 dahil olmak üzere farklı organoid türlerini TAT'lere başarıyla aşılamıştır. Bununla birlikte, insan beyni organoidlerini CAM'a aşılamanın etkinliği, toksisitesi / reddi, fizyolojik etkisi ve yöntemleri hakkında çok az şey bilinmektedir. Bir başka ilginç ve henüz keşfedilmemiş husus, CAM ve organoid astrositik arayüz arasında kimerik bir kan-beyin bariyerinin (BBB) oluşmasıdır. Önceki öncü çalışmalar, astrositleri ve astrosit koşullu ortamı ^21,22,23 naklederek CAM'de bir BBB üretmenin varsayılan fizibilitesini önerdi. Bununla birlikte, olgun astrositler bu ^24,25'i başaramıyor gibi görünmektedir. Bu nedenle, BBB'nin astrosit kaynaklı oluşumu tartışmalıdır ve insan beyni organoidlerinin nakli bu tartışmaya ışık tutmamızı sağlayacaktır.

Bu video makalesinde, histolojik olarak uyumlu BBB elemanlarını kapsayan organoidlerle sonuçlanan, büyümeyi, iyileşmeyi ve vaskülarizasyonu destekleyen CAM'ye in ovo insan beyni organoid nakli için bir protokol açıklanmaktadır. Burada, tavuk embriyosunun hayatta kalmasını sağlayan bir protokol sunuyoruz ve beyin organoid büyümesini sürdürmek için CAM'ın izin verilebilirliğini rapor ediyoruz.

Protokol

Beyaz Leghorn tavuğu (Gallus gallus) embriyoları, Laboratuvar Hayvanları Kaynakları Enstitüsü, Yaşam Bilimleri Komisyonu, Ulusal Araştırma Konseyi, ABD'den Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uyularak tedavi edildi ve deneyler Barselona Üniversitesi'nden Deney Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Konseyi tarafından onaylandı.

1. Rehbersiz beyin organoid preparatı

1. H9 insan embriyonik kök hücrelerini (hESC'ler), 37 °C'de %5'lik bir_CO2 inkübatöründe DMEM (1:40) içinde çözülmüş Matrigel ile kaplanmış 6 oyuklu plakalarda %70'lik bir birleşme altında oda sıcaklığında (RT) önceden ısıtılmış mTESR1'de muhafaza edin.
   NOT: Matrigel, polimerizasyonunu önlemek için kaplama olarak kullanılana kadar buzda tutulmalıdır.
2. Güdümsüz beyin protokolünü izleyerek beyin organoidleri oluşturun ².
   1. 500 μL Hücre Ayrışma Çözeltisi kullanarak H9 hESC'leri ayrıştırın ve 37 °C'de 3-5 dakika inkübe edin. Bir ROCK inhibitörü Y27632 (son konsantrasyon 50 μM) içeren mTESR1'de yeniden süspanse edin ve düşük yapışma ön işleme tabi tutulmuş 96 oyuklu bir plakada oyuk başına 9.000 hücre tohumlayın.
   2. Organoidler, bir ROCK inhibitörü Y27632 (son konsantrasyon 50 μM) içeren mTESR1'de toplandıktan sonra, bunları 5-6 gün boyunca indüksiyon ortamına aktarın.
   3. Kılavuzsuz beyin organoid protokolü^26'yı takiben, organoidleri ~ 4-5. günlerde nöral indüksiyon ortamına aktarın.
   4. Boyut ve nöroepitel halkasını elde ettikten sonra, onları buz gibi bir Matrigel damlasına aktarın. Matrigel polimerize edildikten sonra, organoidleri 5 mL önceden ısıtılmış olgunlaşma ortamı içeren 5 cm'lik, düşük yapışmalı bir Petri kabına aktarın.
   5. 4 gün sonra, beyin organoidlerini orbital ajitasyon altına alın.
3. Aşılamadan hemen önce taze DPBS'de hasat için organoidleri toplayın.

2. Yumurta bakımı, gelişim aktivasyonu ve yumurta kabuğu delinmesi

1. Döllenmiş yumurtaları (0. günde) kullanana kadar 18 °C'de bir kuluçka makinesinde saklayın.
   NOT: Bu sıcaklıkta, aynı olgunlaşma aşamasında kalarak gelişmezler.
2. Kullanım için gerektiğinde, 38 °C'de ve% 60 bağıl nemde, 45 °C'lik bir açıyla yumuşak sallanma dönüşü ile inkübe edin.
3. 1. günde, yumurta kabuğu yüzeyini %70 etanol ile temizleyin ve sterilize etmek için bir kağıt havluyla kurulayın.
4. Yumurtanın üzerine, yumurtanın hava odasını kaplayan ve bundan sonra "bandaj" olarak anılacak olan cerrahi kağıt yapışkan bir bandaj yerleştirin.
   NOT: Bu, yumurta kabuğundaki tozun sıkıştığı CAM'ye düşmesini önleyecektir.
5. Bundan sonra hava odası deliği (ACH) olarak anılacak olan hava odası perforasyon delme işlemini, 21 G x 11/2 '' steril bir iğne ile yumurta kabuğunu yumuşak bir şekilde delerek gerçekleştirin. Bu noktada kabuktan ayrılan CAM'ı rahatsız etmemek için yumurtanın üst ucundaki ACH'yi açın.
6. ACH'yi delmek için en iyi konumu bulmak için, yumurtanın üst ucundaki en ince yumurta kabuğu yüzeyini belirlemek için bir lamba kullanın. Doğrudan ışık huzmesi iletimi, delmek için en iyi konumu gösterir.
7. Embriyoyu dış ortamdan korumak için ACH'yi yeni bir bandajla örtün ve yumurtayı tekrar inkübatöre yerleştirin.
8. Bu andan itibaren, inkübatörde dönmeyi durdurun ve yumurtaları pencere üstte olacak şekilde dikey konumda tutun.
   NOT: Bu, embriyonun gelişimini kolaylaştıracak ve CAM, embriyo ile yumurta kabuğu arasında bir hava odası ile üstte kullanılabilir hale gelir ve daha sonra aşılamaya izin verir.
9. ACH'yi 1. günden 4. güne kadar açın. Canlılık 4. günde (aşılama gününden 3 gün önce) artar.

3. Beyin organoid greftleme

1. CAM iyi geliştiğinde ve vaskülarize olduğunda, yumurtayı embriyonun her tarafını kaplayan 7. günde aşılama yapın.
2. Bandajı çıkarın ve ACH'yi dikkatlice bir aşılama penceresine genişletmeden önce yumurta kabuğunu sterilize etmek için yumurta kabuğu yüzeyini %70 etanol ile silin.
3. Aşılama penceresini büyütürken yumurta kabuğu parçalarının CAM'a düşmesini önlemek için son aşılama penceresinin ötesindeki uzantıyı kaplayan yeni, daha büyük bir bandaj yerleştirin.
   NOT: Bu daha büyük pencere, en iyi aşılama pozisyonunu seçmek ve sonraki aşılama için gereklidir.
4. Pencere yaklaşık 2 cm çapa ulaşana kadar yumurta kabuğunu yumuşak bir şekilde delerek aşılama penceresini büyütün. Yumurta kabuğu penceresinin kenarlarını, pencere büyüyene kadar cımbızla yumuşak bir şekilde çıkarın. Bandajı yumuşak bir şekilde soyarak bandaja bağlı kalacak kalan toz ve yumurta kabuğu parçalarını çıkarın.
5. Organoidi bir P200 otomatik pipetle yerleştirin. Açıklığı organoidin boyutuna göre büyütmek ve organoidin zarar görmesini önlemek için uçları steril ve keskin bir makasla kesin veya geniş ölçülü aktarıcı steril uçlar kullanın. Organoidi maksimum 50 μL PBS hacminde toplayın ve embriyonun bulunduğu yerin karşısındaki bir tarafta doğrudan CAM'a aktarın.
6. Hasat sırasında yırtılmasını önlemek için greftin konumunun yumurta sarısından uzak olduğundan emin olun ve tercihen bir kan damarının yakınına yerleştirin.
7. Organoidi CAM'a yerleştirdikten sonra organoidi çevreleyen 7 μL Matrigel damlatın.
   NOT: Bu, organoidin zarın etrafında hareket etmesini önleyecektir.
8. Pencerenin tam boyutuna uyan küçük bir parafilm parçası kullanarak pencereyi kapatın ve yapışkan bir bandajla kabuğa tutturun.
   NOT: Gaz değişimine izin verirken embriyonun kurumasını önlemek için pencereyi parafilm ile tamamen kapatmak önemlidir. Doğru embriyo gelişimi için gerekli gaz değişimini engelleyebileceğinden, pencerenin aşılmasından kaçınarak pencere kapsamının uzatılmasını uygun şekilde sınırlandırın²⁷.

4. Nakledilen organoid hasadı

1. Aşılamadan 5 gün sonra, 38 Hamburger ve Hamilton gelişim aşamasına (HH38)²⁸ karşılık gelen tavuk gelişiminin 12. gününde aşılanmış organoidleri ve çevresindeki CAM'ı hasat edin. Bu aşamada, CAM olgun damar sistemi ile tamamen farklılaşırken, tüy mikropları embriyonun üst göz kapağının yanı sıra kanatları da kaplar.
2. Yapışkan bandajı çıkardıktan sonra, makas ve ince cımbız kullanarak numune alımını kolaylaştırmak için pencereyi daha da genişletin.
3. Gerekirse bir binoküler diseksiyon mikroskobu yardımıyla organoidi görselleştirin, ardından organoid ve CAM toplamaya yardımcı olmak için %4 paraformaldehit (PFA) ile 2 dakikalık bir ön fiksasyon adımı izleyin.
4. Organoid içeren CAM'ın 1,5^cm2'lik bir bölümünü toplayın.
5. Örnek fiksasyon
   1. Numuneleri 1x PBS ile yıkayın ve 4 °C'de 30 dakika boyunca %4 PFA (PBS'de, pH 7.2'de) ile sabitleyin. Ardından, numuneleri PBS'de 3 x 5 dakika yıkayın.
   2. Numuneleri 4 °C'de PBS'de sodyum azid ile saklayın veya gece boyunca 4 °C'de %30 sükroz-PBS'de doğrudan kriyoproteksiyon yapın.
   3. Kriyoproteksiyon üzerine, numuneleri optimum kesme sıcaklığı bileşiğine (OCT) gömün ve kesit alana kadar -20 °C'de saklayın. Bir kriyostat kullanarak 20 μm kalınlığında doku dilimleri kesin ve bunları ksilanize slaytlarda toplayın. Slaytları boyama için kullanılana kadar -20 °C'de saklayın.

5. İmmünofloresan

1. Oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100 (PBS-T) içeren bir PBS çözeltisi ile bölümlerden OCT.'yi çıkarın.
2. RT'de 1 saat boyunca% 2 BSA,% 3 eşek serumu PBS-T% 0.01 çözeltisi içeren bir bloke edici solüsyon (BS) ile bölümlere muamele edin.
3. Seçilen primer antikoru (Malzeme Tablosuna bakınız) BS içinde seyreltin ve numuneleri gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
4. Ertesi gün, numuneleri RT'de 1x PBS'de 3 x 10 dakika yıkayın.
5. İkincil antikoru BS'de seyreltin ve RT'de 2 saat inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
6. Hücre çekirdeklerini RT'de işaretlemek için numuneleri 10 dakika boyunca 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile inkübe edin, PBS-T'de 1: 1,000 seyreltmede seyreltin.
7. Kızakları montaj ortamı ile monte edin ve cam lameller ile örtün.
8. Tüm görüntüleri 2.5, 10, 20 ve 40x'te geniş alanlı bir floresan mikroskobu kullanarak çekin.
9. Dilimleri 4 °C'de saklayın.

6. Hematoksilen ve eozin (H & E) boyama

NOT: Aşılamanın işe yaradığını kanıtlamak için H&E boyama yapın.

1. RT'de 10 dakika boyunca PBS-T %0,1 ile OCT'yi kaldırın.
2. Bir davlumbazda seri dehidrasyonu aşağıdaki gibi gerçekleştirin: Damıtılmış suda (DW) 10 dakika, hematoksilende 45 sn, DW'de 1 dakika, PBS'de 20 sn, %70 EtOH'de 2 x 30 sn, %80 EtOH'de 2 x 30 sn, %96 EtOH'de 2 x 30 sn, eozinde 30 sn, %96 EtOH'de 2 x 15 sn, % 100 EtOH'de 2 x 15 sn, ksilol-% 100 ETOH'de 1 dakika, ksilol içinde 1 dakika, ksilol (taze) içinde 1 dakika.
3. Cam lamellerin ksilen bazlı bir montaj ortamıyla monte edilmesi.

Sonuçlar

Nakil için embriyo olgunlaşma programının seçilmesi
Deney, döllenmiş yumurtalar 38 °C'de ve %60 bağıl nemde inkübe edildiğinde D0'da başlar. Koryoallantoik membran (CAM), yumurta inkübasyonundan sonra gelişen oldukça vaskülarize ekstraembriyonik bir membrandır. Allantois ve koryonun kaynaşmasıyla oluşur. D1'de, 24 saatlik inkübasyondan sonra, CAM'ın iç kabuk zarına yapışmasını önlemek için hava odası delinir. Hava odasının D1'de delinmesi, daha sonraki aşamalarda (D4...

Tartışmalar

Bu çalışmada, tavuk embriyolarının hayatta kalmasını bozmadan, aşılama üzerine insan beyni organoidlerinin olumlu büyümesini ve gelişmesini sağlayan çok sayıda anahtar adımdan oluşan ayrıntılı bir protokol tanımladık. 24 saatlik inkübasyondan sonra (1. gün) yumurtanın hava odasını delmek için steril iğnelerin kullanılmasını önerdik. Ek olarak, 4. günde de delinmeye çalıştık (sadece sağlıklı embriyolarla çalıştığımızdan emin olmak için damar sisteminin gelişimini test etm...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse	BioLegend	801201	1:1,000
Anti-GFAP, rabbit	GeneTex	GTX108711	1:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat.	Invitrogen	A-21206	1:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat	Jackson ImmunoResearch	715-585-150	1:500
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs	Granja Gibert (Cambrils, Spain)
DAPI	Invitrogen	D1306	1:10,000
DPX	Sigma	100579	xylene-based mounting medium
Gentle Dissociation Solution	CreativeBiolabs	ITS-0622-YT187	cell dissociation solution
Matrigel	BD Biosciences	356234
Mowiol 4-88 mounting media	Merk	81381
Paper towel, lab-grade	Sigma-Aldrich	Z188956
ROCK inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	10 nM
Sharp-Point Surgical Scissors	VWR	470106-340
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ