Раннее неуправляемое моделирование органоидной нейроваскулярной ниши головного мозга человека в пермиссивной хориоаллантоической мембране эмбриона цыпленка

Резюме

Здесь мы представляем протокол по приживлению органоидов головного мозга человека на нескольких стадиях созревания в хориоаллантоисную мембрану (CAM) цыплят. Органоиды головного мозга выращивались в соответствии с неуправляемыми стандартизированными протоколами.

Аннотация

Приживление органоидов в васкуляризированные ткани модельных животных, таких как хориоаллантоическая мембрана (CAM) эмбрионов мышей или цыплят с иммунодефицитом, доказало свою эффективность для моделирования неоваскуляризации. CAM представляет собой богато васкуляризированную экстраэмбриональную мембрану, которая демонстрирует ограниченную иммунореактивность, что делает ее отличной моделью для трансплантации клеток человеческого происхождения.

В данной работе описывается стратегия приживления органоидов головного мозга человека, дифференцированных на нескольких стадиях созревания, в CAM. Клеточный состав органоидов головного мозга меняется со временем, отражая вехи развития мозга человека. Мы трансплантировали органоиды головного мозга на соответствующих стадиях созревания: нейроэпителиальная экспансия (18 DIV), ранний нейрогенез (60 DIV) и ранний глиогенез (180 DIV) в КАМ эмбриональных (E)7 куриных эмбрионов. Через 5 дней забирали приживленные органоиды головного мозга и анализировали их гистологические особенности.

Гистологических признаков неоваскуляризации в трансплантированных органоидах или аномальных кровеносных сосудах, прилегающих к трансплантатам, не выявлено. Более того, наблюдались заметные изменения в клеточном составе трансплантированных органоидов, а именно увеличение количества глиальных фибриллярных кислых белково-позитивно-реактивных астроцитов. Однако цитоархитектурные изменения зависели от стадии органоидного созревания. В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что органоиды мозга могут расти в CAM, и они показывают различия в цитоархитектонике в зависимости от стадии их созревания при трансплантации.

Введение

Органоиды человеческого мозга – это новый метод, который позволяет нам повторить раннее развитие человеческого мозга in vitro ^1,2,3. Тем не менее, одним из основных ограничений этой модели является отсутствие васкуляризации, которая играет незаменимую роль не только в гомеостазе мозга, но и^{в развитии мозга}. В дополнение к доставке кислорода и питательных веществ, накопленные данные свидетельствуют о том, что сосудистая система мозга регулирует дифференцировку нейронов, миграцию и синаптогенез во время развития ^5,6. Таким образом, существует острая необходимость в создании надежных моделей, которые могут обеспечить недостающую сосудистую сигнализацию и структуру органоидов головного мозга, повышая сложность органоидов мозга человека^7-го поколения.

Среди предложенных методов васкуляризации можно рассмотреть два основных направления: приживление органоидов в живой организм и чисто in vitro технологии совместного культивирования эндотелиальных и нервных клеток 8,9,10,11,12. Внутримозговая трансплантация у мышей является дорогостоящей и трудоемкой процедурой, что делает другие технологии актуальными для более простых моделей. Анализ хориоаллантоической мембраны цыплят (CAM) широко использовался для изучения ангиогенеза 13,14,15. За последнее десятилетие несколько групп успешно внедрили различные типы органоидов, включая почку^16,17, сердечную¹⁸ и опухолевую органоиды^19,20, в КАМ. Тем не менее, мало что известно об эффективности, токсичности/отторжении, физиологическом эффекте и методах приживления органоидов человеческого мозга в CAM. Другим интересным и пока неизученным аспектом является формирование химерного гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) между КАМ и органоидным астроцитарным интерфейсом. Предыдущая новаторская работа предполагала предполагаемую возможность получения ГЭБ в CAM путем трансплантации астроцитов и астроцит-кондиционированной среды 21,22,23. Однако зрелые астроциты, по-видимому, не в состоянии достичь этого^{показателя 24,25}. Таким образом, индуцированное астроцитами образование ГЭБ остается спорным, и трансплантация органоидов человеческого мозга позволила бы нам пролить свет на это противоречие.

В этой видеостатье описывается протокол трансплантации органоидов головного мозга человека in ovo в CAM, который способствует росту, улучшению и васкуляризации, в результате чего образуются органоиды, включающие гистологически совместимые элементы ГЭБ. Здесь мы представляем протокол, обеспечивающий выживание куриного эмбриона, и сообщаем о допустимости CAM для поддержания роста органоидов мозга.

протокол

Эмбрионы курицы белого леггорна (Gallus gallus) обрабатывались в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Института ресурсов лабораторных животных, Комиссии наук о жизни, Национального исследовательского совета, США, и эксперименты были одобрены Советом по уходу и использованию экспериментальных животных Барселонского университета.

1. Неуправляемая подготовка органоидов головного мозга

1. Хранят H9 человеческих эмбриональных стволовых клеток (hESCs) в mTESR1, предварительно нагретых при комнатной температуре (RT) при слиянии 70% в 6-луночных планшетах, покрытых матригелем, растворенным в DMEM (1:40), в инкубаторе с 5%_CO2 при 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Матригель необходимо хранить во льду до его использования в качестве покрытия, чтобы предотвратить его полимеризацию.
2. Генерация органоидов мозга в соответствии с неуправляемым протоколом мозга ².
   1. Диссоциируют H9 hESCs, используя 500 мкл раствора для диссоциации клеток, и инкубируют в течение 3-5 мин при 37 °C. Ресуспендировать в mTESR1, содержащем ингибитор ROCK Y27632 (конечная концентрация 50 мкМ), и засеять 9 000 клеток на лунку в предварительно обработанную 96-луночную пластину с низкой адгезией.
   2. После того, как органоиды агрегируют в mTESR1, содержащем ингибитор ROCK Y27632 (конечная концентрация 50 мкМ), переносят их в индукционную среду на 5-6 дней.
   3. В соответствии с протоколом²⁶ неуправляемых органоидов головного мозга переносят органоиды в среду нейронной индукции на ~ 4-5 день.
   4. Как только они приобретут размер и кольцо нейроэпителия, перенесите их в ледяную каплю Матригеля. После полимеризации Matrigel переложите органоиды в чашку Петри с низкой адгезией диаметром 5 см с 5 мл предварительно подогретой среды для созревания.
   5. Через 4 дня переведите органоиды мозга в орбитальное возбуждение.
3. Собирают органоиды для заготовки в свежие ДПБС непосредственно перед прививкой.

2. Поддержание яйцеклетки, активация развития и пункция яичной скорлупы

1. Хранят оплодотворенные яйца (на 0-й день) в инкубаторе при температуре 18 °C до использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При такой температуре они не развиваются, оставаясь на одной стадии созревания.
2. Когда это необходимо для использования, инкубируйте их при температуре 38 °C и относительной влажности воздуха 60% при мягком покачивании под углом 45 °C.
3. На 1-й день очистите поверхность яичной скорлупы 70% этиловым спиртом и высушите бумажным полотенцем, чтобы стерилизовать.
4. Наложите хирургическую бумажную лейкопластырную повязку, далее именуемую «бинт», поверх яйца, закрывая воздушную камеру яйца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это предотвратит попадание пыли из яичной скорлупы в CAM, где она застрянет.
5. Стерильной иглой 21 G x 11/2'' выполнить перфорацию воздушной камеры, далее именуемую отверстием воздушной камеры (ACH), мягко проколов скорлупу яйца. Откройте ACH на верхнем кончике яйца, чтобы не потревожить CAM, который в этот момент лежит отдельно от скорлупы.
6. Чтобы найти наилучшее положение для прокола ACH, используйте лампу, чтобы определить самую тонкую поверхность яичной скорлупы на верхнем кончике яйца. Прямая передача светового луча указывает наилучшее положение для бурения.
7. Накройте ACH новой повязкой, чтобы защитить эмбрион от внешней среды, и поместите яйцо обратно в инкубатор.
8. С этого момента прекратите вращение в инкубаторе и поддерживайте яйца в вертикальном положении окошком сверху.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это облегчит развитие эмбриона, и CAM станет доступным в верхней части с воздушной камерой между эмбрионом и яичной скорлупой, что позволит провести последующую пересадку.
9. Откройте ACH с 1-го по 4-й день. Всхожесть повышается на 4 день (за 3 дня до дня прививки).

3. Органоидная трансплантация головного мозга

1. Проводите пересадку на 7-й день, когда КАМ хорошо развита и васкуляризирована, покрывая яйцеклетку по всему эмбриону.
2. Снимите повязку и протрите поверхность яичной скорлупы 70% этанолом, чтобы стерилизовать яичную скорлупу, прежде чем осторожно расширить ACH в окно для прививки.
3. Наложите новую, большую повязку, закрывающую удлинитель, за последнее окно прививки, чтобы избежать попадания фрагментов яичной скорлупы в КАМ при увеличении окна прививки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это большее окно необходимо для выбора наилучшего положения для прививки и для последующей прививки.
4. Увеличьте окно прививки, мягко прокалывая яичную скорлупу, пока окно не достигнет диаметра примерно 2 см. Мягко удалите края окна яичной скорлупы пинцетом до тех пор, пока окно не увеличится. Удалите оставшуюся пыль и кусочки яичной скорлупы, которые останутся прикрепленными к бинту, мягко сняв повязку.
5. Поместите органоид с помощью автоматической пипетки P200. Обрежьте кончики стерильными и острыми ножницами, чтобы увеличить отверстие в соответствии с размером органоида и предотвратить повреждение органоида, или используйте широкоформатные стерильные наконечники. Соберите органоид в максимальном объеме 50 мкл PBS и перенесите его непосредственно в CAM, на сторону, противоположную расположению эмбриона.
6. Следите за тем, чтобы положение привоя было удалено от желтка, чтобы избежать его разрыва во время забора, и желательно поместите его рядом с кровеносным сосудом.
7. Поместите каплю 7 мкл Matrigel вокруг органоида после помещения органоида на CAM.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это предотвратит перемещение органоида по мембране.
8. Закройте окно с помощью небольшого кусочка парапленки, подходящего точно по размеру окна, и прикрепите его к оболочке с помощью лейкопластыря.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно полностью закрыть окно парапленкой, чтобы избежать высыхания эмбриона и обеспечить газообмен. Правильно разграничьте расширение оконного охвата, избегая превышения окна, так как это может препятствовать необходимому газообмену для правильного развития эмбриона²⁷.

4. Пересаженный органоид

1. Заготавливают привитые органоиды и окружающие их КАМ на 12-й день развития цыплят, что соответствует 38 стадиям развития по Гамбургеру и Гамильтону (HH38)²⁸, через 5 дней после прививки. На этой стадии КАМ полностью дифференцируется со зрелой сосудистой сетью, в то время как перьевые зародыши покрывают крылья, а также верхнее веко эмбриона.
2. Сняв лейкопластырь, еще больше увеличьте окно, чтобы облегчить сбор образца с помощью ножниц и тонкого пинцета.
3. Визуализируйте органоид с помощью бинокулярной диссекционной микроскопии, если это необходимо, с последующим 2-минутным этапом префиксации 4% параформальдегида (PFA), чтобы помочь органоиду и CAM-сбору.
4. Соберите 1,5^см2 отрезка CAM, содержащего органоид.
5. Фиксация образца
   1. Промывают образцы 1x PBS и фиксируют их 4% PFA (в PBS, pH 7,2) в течение 30 мин при 4 °C. Затем промывают образцы в течение 3 х 5 мин в ПБС.
   2. Хранят образцы при температуре 4 °C в PBS с азисом натрия или непосредственно криозащищают их в 30% сахарозе-PBS в течение ночи при 4 °C.
   3. После криозащиты образцы помещают в компаунд с оптимальной температурой резания (OCT) и хранят их при -20 °C до секционирования. Нарежьте ломтики ткани толщиной 20 мкм с помощью криостата и соберите их на ксилированные предметные стекла. Храните предметные стекла при температуре -20 °C до тех пор, пока они не будут использованы для окрашивания.

5. Иммунофлюоресценция

1. Удалить ОКТ со срезов раствором ПБС с 0,1% Тритоном Х-100 (ПБС-Т) в течение 10 мин при комнатной температуре (РТ).
2. Обрабатывают срезы блокирующим раствором (БС) с 2% БСА, 3% ослиной сывороткой ПБС-Т 0,01% раствором в течение 1 ч при РТ.
3. Выбранное первичное антитело (см. таблицу материалов) разбавляют в БС и инкубируют образцы в течение ночи при 4 °C.
4. На следующий день промывают образцы 3 х 10 мин в 1х ПБС при РТ.
5. Вторичное антитело разводят в БС и инкубируют в течение 2 ч при РТ (см. таблицу материалов).
6. Инкубируют образцы в течение 10 мин с 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) для маркировки клеточных ядер при RT, разбавленных в PBS-T в разведении 1:1000.
7. Установите направляющие с помощью монтажного носителя и накройте стеклянными накладками.
8. Делайте все снимки с помощью широкопольного флуоресцентного микроскопа с разрешением 2,5, 10, 20 и 40x.
9. Храните ломтики при температуре 4 °C.

6. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы доказать, что прививка сработала, выполните окрашивание H&E.

1. Удаляют ОКТ с помощью PBS-T 0,1% в течение 10 мин при RT.
2. Последовательное обезвоживание в вытяжке проводят следующим образом: 10 мин в дистиллированной воде (DW), 45 с в гематоксилине, 1 мин в DW, 20 с в PBS, 2 x 30 с в 70% EtOH, 2 x 30 с в 80% EtOH, 2 x 30 с в 96% EtOH, 30 с в эозине, 2 x 15 с в 96% EtOH, 2 x 15 с в 100% EtOH, 1 мин в ксилоле-100% ETOH, 1 мин в ксилоле, 1 мин в ксилоле (свежем).
3. Установите стеклянные покровные стекла с помощью монтажной среды на основе ксилола.

Результаты

Выбор графика созревания эмбриона для трансплантации
Эксперимент начинается при D0, когда оплодотворенные яйца инкубируются при температуре 38 °C и относительной влажности воздуха 60%. Хориоаллантоисная мембрана (CAM) представляет собой высоковаскуляризированную внеэмбрионал...

Обсуждение

В данном исследовании мы описываем подробный протокол с многочисленными ключевыми этапами, которые обеспечивают благоприятный рост и развитие органоидов головного мозга человека при трансплантации, не нарушая выживаемость куриных эмбрионов. Мы рекомендовали использовать стерильны...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse	BioLegend	801201	1:1,000
Anti-GFAP, rabbit	GeneTex	GTX108711	1:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat.	Invitrogen	A-21206	1:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat	Jackson ImmunoResearch	715-585-150	1:500
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs	Granja Gibert (Cambrils, Spain)
DAPI	Invitrogen	D1306	1:10,000
DPX	Sigma	100579	xylene-based mounting medium
Gentle Dissociation Solution	CreativeBiolabs	ITS-0622-YT187	cell dissociation solution
Matrigel	BD Biosciences	356234
Mowiol 4-88 mounting media	Merk	81381
Paper towel, lab-grade	Sigma-Aldrich	Z188956
ROCK inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	10 nM
Sharp-Point Surgical Scissors	VWR	470106-340
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ