Раннее неуправляемое моделирование органоидной нейроваскулярной ниши головного мозга человека в пермиссивной хориоаллантоической мембране эмбриона цыпленка

Резюме

Здесь мы представляем протокол по приживлению органоидов головного мозга человека на нескольких стадиях созревания в хориоаллантоисную мембрану (CAM) цыплят. Органоиды головного мозга выращивались в соответствии с неуправляемыми стандартизированными протоколами.

Аннотация

Приживление органоидов в васкуляризированные ткани модельных животных, таких как хориоаллантоическая мембрана (CAM) эмбрионов мышей или цыплят с иммунодефицитом, доказало свою эффективность для моделирования неоваскуляризации. CAM представляет собой богато васкуляризированную экстраэмбриональную мембрану, которая демонстрирует ограниченную иммунореактивность, что делает ее отличной моделью для трансплантации клеток человеческого происхождения.

В данной работе описывается стратегия приживления органоидов головного мозга человека, дифференцированных на нескольких стадиях созревания, в CAM. Клеточный состав органоидов головного мозга меняется со временем, отражая вехи развития мозга человека. Мы трансплантировали органоиды головного мозга на соответствующих стадиях созревания: нейроэпителиальная экспансия (18 DIV), ранний нейрогенез (60 DIV) и ранний глиогенез (180 DIV) в КАМ эмбриональных (E)7 куриных эмбрионов. Через 5 дней забирали приживленные органоиды головного мозга и анализировали их гистологические особенности.

Гистологических признаков неоваскуляризации в трансплантированных органоидах или аномальных кровеносных сосудах, прилегающих к трансплантатам, не выявлено. Более того, наблюдались заметные изменения в клеточном составе трансплантированных органоидов, а именно увеличение количества глиальных фибриллярных кислых белково-позитивно-реактивных астроцитов. Однако цитоархитектурные изменения зависели от стадии органоидного созревания. В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что органоиды мозга могут расти в CAM, и они показывают различия в цитоархитектонике в зависимости от стадии их созревания при трансплантации.

Введение

Органоиды человеческого мозга – это новый метод, который позволяет нам повторить раннее развитие человеческого мозга in vitro ^1,2,3. Тем не менее, одним из основных ограничений этой модели является отсутствие васкуляризации, которая играет незаменимую роль не только в гомеостазе мозга, но и^{в развитии мозга}. В дополнение к доставке кислорода и питательных веществ, накопленные данные свидетельствуют о том, что сосудистая система мозга регулирует дифференцировку нейронов, миграцию и синаптогенез во время развития ^5,6<....

протокол

Эмбрионы курицы белого леггорна (Gallus gallus) обрабатывались в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Института ресурсов лабораторных животных, Комиссии наук о жизни, Национального исследовательского совета, США, и эксперименты были одобрены Советом по уходу и использованию экспериментальных животных Барселонского университета.

1. Неуправляемая подготовка органоидов головного мозга

1. Хранят H9 человеческих эмбриональных стволовых клеток (hESCs) в mTESR1, предварительно нагретых при комнатной температуре (RT) при слиянии 70% в 6-луночных планшетах, покрытых матригелем, р....

Результаты

Выбор графика созревания эмбриона для трансплантации
Эксперимент начинается при D0, когда оплодотворенные яйца инкубируются при температуре 38 °C и относительной влажности воздуха 60%. Хориоаллантоисная мембрана (CAM) представляет собой высоковаскуляризированную внеэмбрионал.......

Обсуждение

В данном исследовании мы описываем подробный протокол с многочисленными ключевыми этапами, которые обеспечивают благоприятный рост и развитие органоидов головного мозга человека при трансплантации, не нарушая выживаемость куриных эмбрионов. Мы рекомендовали использовать стерильны.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse	BioLegend	801201	1:1,000
Anti-GFAP, rabbit	GeneTex	GTX108711	1:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat.	Invitrogen	A-21206	1:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat	Jackson ImmunoResearch	715-585-150	1:500
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs	Granja Gibert (Cambrils, Spain)
DAPI	Invitrogen	D1306	1:10,000
DPX	Sigma	100579	xylene-based mounting medium
Gentle Dissociation Solution	CreativeBiolabs	ITS-0622-YT187	cell dissociation solution
Matrigel	BD Biosciences	356234
Mowiol 4-88 mounting media	Merk	81381
Paper towel, lab-grade	Sigma-Aldrich	Z188956
ROCK inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	10 nM
Sharp-Point Surgical Scissors	VWR	470106-340
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ