초기 비유도 인간 뇌 오가노이드 신경 혈관 틈새 모델링을 허용 병아리 배아 맥락막으로 모델링

요약

여기에서는 여러 성숙 단계에서 인간 뇌 오가노이드를 병아리 융모막(CAM)에 생착하는 프로토콜을 제시합니다. 뇌 오가노이드는 유도되지 않은 표준화된 프로토콜에 따라 성장했습니다.

초록

면역 결핍 마우스 또는 병아리 배아 융모막(CAM)과 같은 모델 동물의 혈관 조직에 오가노이드를 생착하는 것은 신생혈관 형성 모델링에 효율적인 것으로 입증되었습니다. CAM은 혈관이 풍부하게 형성된 배아외 막으로, 면역 반응이 제한되어 인간 유래 세포 이식을 위한 훌륭한 호스팅 모델이 되었습니다.

본 논문은 여러 성숙 단계에서 분화된 인간 뇌 오가노이드를 CAM에 이식하는 전략을 설명합니다. 뇌 오가노이드의 세포 구성은 시간이 지남에 따라 변화하며, 이는 인간 뇌 발달의 이정표를 반영합니다. 신경 상피 확장(18 DIV), 초기 신경 발생(60 DIV) 및 초기 신경 형성(180 DIV)과 같은 관련 성숙 단계의 뇌 오가노이드를 배아일(E)7 닭 배아의 CAM에 이식했습니다. 생착된 뇌 오가노이드를 5일 후에 수확하고 조직학적 특징을 분석했습니다.

이식된 오가노이드에서 신생혈관 형성의 조직학적 징후나 이식편에 인접한 비정상적인 혈관은 발견되지 않았습니다. 또한, 이식된 오가노이드의 세포 구성에서 현저한 변화, 즉 신경교세포(glial fibrillary acidic protein-positive-reactive astrocyte)의 수가 증가하는 것이 관찰되었습니다. 그러나 세포구조적 변화는 오가노이드 성숙 단계에 따라 달라졌습니다. 이러한 결과는 뇌 오가노이드가 CAM에서 자랄 수 있음을 시사하며, 이식 시 성숙 단계에 따라 세포 구조의 차이를 보여줍니다.

서문

인간 뇌 오가노이드는 인간 뇌의 초기 발달을 in vitro ^1,2,3으로 요약할 수 있는 새로운 기술입니다. 그럼에도 불구하고 이 모델의 주요 한계 중 하나는 뇌 항상성뿐만 아니라 뇌 발달에도 필수적인 역할을 하는 혈관화가 부족하다는 것이다⁴. 축적된 증거에 따르면 산소와 영양소의 전달 외에도 뇌의 혈관계는 발달 과정에서 신경 분화, 이동 및 시냅스 형성을 조절합니다 ^5,6. 따라서 뇌 오가노이드에 누락된 혈관 신호전달 및 구조를 제공하여 인간 뇌 오가노이드 세대의 복잡성을 높일 수 있는 신뢰할 수 있는 모델 구축이 시급하다⁷.

제안된 혈관화 방법 중 두 가지 주요 유선형을 고려할 수 있습니다: 살아있는 유기체에 오가노이드 생착과 내피 세포와 신경 세포를 공동 배양하는 순수 시험관 내 기술 8,....

프로토콜

흰다리뿔닭(Gallus gallus) 배아는 미국 국립연구위원회(National Research Council) 생명과학위원회 실험동물자원연구소(Institute of Laboratory Animals Resources)의 실험동물 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 처리되었으며, 실험은 바르셀로나 대학의 실험동물 관리 및 사용 위원회(Council for Care and Use of Experimental Animals)의 승인을 받았습니다.

1. 비유도식 뇌 오가노이드 준비

1. 37°C의 5%_CO2 인큐베이터에서 DMEM(1:40)에 용해된 Matrigel로 코팅된 6웰 플레이트에서 70%의 합류 하에서 실온(RT)으로 예열된 mTESR1의 H9 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 유지합니다.
   참고: Matrigel은 중합을 방지하기 위해 코팅으로 사용할 때까지 얼음에 보관해야 합니다.
2. 유도되지 않은 뇌 프로토콜에 따라 뇌 오가노이드 ^{생성 2}.
   1. 500μL의 세포 해리 용액을 사용하여 H9 hESC를 해리....

토론

이 연구에서는 닭 배아의 생존을 방해하지 않으면서 이식 시 인간 뇌 오가노이드의 유리한 성장과 발달을 제공하는 수많은 주요 단계가 포함된 자세한 프로토콜을 설명합니다. 멸균 바늘을 사용하여 배양 24시간(1일) 후 난자의 공기실에 구멍을 뚫을 것을 권장했습니다. 또한, 우리는 또한 4일째에 구멍을 뚫으려고 시도했습니다(건강한 배아에서만 일하고 있는지 확인하기 위해 혈관 발달을 테스?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse	BioLegend	801201	1:1,000
Anti-GFAP, rabbit	GeneTex	GTX108711	1:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat.	Invitrogen	A-21206	1:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat	Jackson ImmunoResearch	715-585-150	1:500
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs	Granja Gibert (Cambrils, Spain)
DAPI	Invitrogen	D1306	1:10,000
DPX	Sigma	100579	xylene-based mounting medium
Gentle Dissociation Solution	CreativeBiolabs	ITS-0622-YT187	cell dissociation solution
Matrigel	BD Biosciences	356234
Mowiol 4-88 mounting media	Merk	81381
Paper towel, lab-grade	Sigma-Aldrich	Z188956
ROCK inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	10 nM
Sharp-Point Surgical Scissors	VWR	470106-340
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ