초기 비유도 인간 뇌 오가노이드 신경 혈관 틈새 모델링을 허용 병아리 배아 맥락막으로 모델링

요약

여기에서는 여러 성숙 단계에서 인간 뇌 오가노이드를 병아리 융모막(CAM)에 생착하는 프로토콜을 제시합니다. 뇌 오가노이드는 유도되지 않은 표준화된 프로토콜에 따라 성장했습니다.

초록

면역 결핍 마우스 또는 병아리 배아 융모막(CAM)과 같은 모델 동물의 혈관 조직에 오가노이드를 생착하는 것은 신생혈관 형성 모델링에 효율적인 것으로 입증되었습니다. CAM은 혈관이 풍부하게 형성된 배아외 막으로, 면역 반응이 제한되어 인간 유래 세포 이식을 위한 훌륭한 호스팅 모델이 되었습니다.

본 논문은 여러 성숙 단계에서 분화된 인간 뇌 오가노이드를 CAM에 이식하는 전략을 설명합니다. 뇌 오가노이드의 세포 구성은 시간이 지남에 따라 변화하며, 이는 인간 뇌 발달의 이정표를 반영합니다. 신경 상피 확장(18 DIV), 초기 신경 발생(60 DIV) 및 초기 신경 형성(180 DIV)과 같은 관련 성숙 단계의 뇌 오가노이드를 배아일(E)7 닭 배아의 CAM에 이식했습니다. 생착된 뇌 오가노이드를 5일 후에 수확하고 조직학적 특징을 분석했습니다.

이식된 오가노이드에서 신생혈관 형성의 조직학적 징후나 이식편에 인접한 비정상적인 혈관은 발견되지 않았습니다. 또한, 이식된 오가노이드의 세포 구성에서 현저한 변화, 즉 신경교세포(glial fibrillary acidic protein-positive-reactive astrocyte)의 수가 증가하는 것이 관찰되었습니다. 그러나 세포구조적 변화는 오가노이드 성숙 단계에 따라 달라졌습니다. 이러한 결과는 뇌 오가노이드가 CAM에서 자랄 수 있음을 시사하며, 이식 시 성숙 단계에 따라 세포 구조의 차이를 보여줍니다.

서문

인간 뇌 오가노이드는 인간 뇌의 초기 발달을 in vitro ^1,2,3으로 요약할 수 있는 새로운 기술입니다. 그럼에도 불구하고 이 모델의 주요 한계 중 하나는 뇌 항상성뿐만 아니라 뇌 발달에도 필수적인 역할을 하는 혈관화가 부족하다는 것이다⁴. 축적된 증거에 따르면 산소와 영양소의 전달 외에도 뇌의 혈관계는 발달 과정에서 신경 분화, 이동 및 시냅스 형성을 조절합니다 ^5,6. 따라서 뇌 오가노이드에 누락된 혈관 신호전달 및 구조를 제공하여 인간 뇌 오가노이드 세대의 복잡성을 높일 수 있는 신뢰할 수 있는 모델 구축이 시급하다⁷.

제안된 혈관화 방법 중 두 가지 주요 유선형을 고려할 수 있습니다: 살아있는 유기체에 오가노이드 생착과 내피 세포와 신경 세포를 공동 배양하는 순수 시험관 내 기술 8,9,10,11,12. 생쥐의 뇌내 이식은 비용과 시간이 많이 들기 때문에 다른 기술은 더 간단한 모델과 관련이 있습니다. 병아리 융모막 막(CAM) 분석은 혈관신생을 연구하는 데 광범위하게 사용되었습니다 13,14,15. 지난 10년 동안 여러 그룹이 신장 ^16,17, 심장¹⁸ 및 종양 오가노이드^19,20을 포함한 다양한 유형의 오가노이드를 CAM에 성공적으로 생착했습니다. 그럼에도 불구하고 인간의 뇌 오가노이드를 CAM에 생착시키는 효능, 독성/거부 반응, 생리학적 효과 및 방법에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 또 다른 흥미롭지만 아직 탐구되지 않은 측면은 CAM과 오가노이드 성상세포 인터페이스 사이에 키메라 혈액-뇌 장벽(BBB)이 형성된다는 것입니다. 이전의 선구적인 연구는 성상교세포와 성상교세포가 조건화된 배지를 이식하여 CAM에서 BBB를 생성하는 추정 가능성을 제안했습니다 21,22,23. 그러나 성숙한 성상교세포는 이^24,25를 달성할 수 없는 것으로 보인다. 따라서 성상교세포에 의한 BBB의 형성은 여전히 논쟁의 여지가 있으며, 인간 뇌 오가노이드를 이식하면 이 논란에 대한 실마리를 제공할 수 있습니다.

이 비디오 기사는 성장, 개선 및 혈관화를 촉진하여 조직학적으로 호환되는 BBB 요소를 포함하는 오가노이드를 생성하는 CAM으로의 난형 인간 뇌 오가노이드 이식 프로토콜에 대해 설명합니다. 여기에서 우리는 닭 배아의 생존을 보장하는 프로토콜을 제시하고 뇌 오가노이드 성장을 유지하기 위한 CAM의 허용성에 대해 보고합니다.

프로토콜

흰다리뿔닭(Gallus gallus) 배아는 미국 국립연구위원회(National Research Council) 생명과학위원회 실험동물자원연구소(Institute of Laboratory Animals Resources)의 실험동물 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 처리되었으며, 실험은 바르셀로나 대학의 실험동물 관리 및 사용 위원회(Council for Care and Use of Experimental Animals)의 승인을 받았습니다.

1. 비유도식 뇌 오가노이드 준비

1. 37°C의 5%_CO2 인큐베이터에서 DMEM(1:40)에 용해된 Matrigel로 코팅된 6웰 플레이트에서 70%의 합류 하에서 실온(RT)으로 예열된 mTESR1의 H9 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 유지합니다.
   참고: Matrigel은 중합을 방지하기 위해 코팅으로 사용할 때까지 얼음에 보관해야 합니다.
2. 유도되지 않은 뇌 프로토콜에 따라 뇌 오가노이드 ^{생성 2}.
   1. 500μL의 세포 해리 용액을 사용하여 H9 hESC를 해리하고 37°C에서 3-5분 동안 배양합니다. ROCK 억제제 Y27632(최종 농도 50μM)가 포함된 mTESR1에 재현탁하고 저접착 전처리된 96웰 플레이트에 웰당 9,000개의 세포를 파종합니다.
   2. 오가노이드가 ROCK 억제제 Y27632(최종 농도 50μM)를 포함하는 mTESR1에 응집되면 5-6일 동안 유도 배지로 옮깁니다.
   3. 유도되지 않은 뇌 오가노이드 프로토콜²⁶에 따라 4-5~일에 오가노이드를 신경 유도 배지로 옮깁니다.
   4. 크기와 신경 상피 고리를 얻으면 얼음처럼 차가운 Matrigel 방울로 옮깁니다. Matrigel이 중합되면 오가노이드를 5mL의 예열된 성숙 배지가 있는 5cm의 저접착 페트리 접시로 옮깁니다.
   5. 4일 후 뇌 오가노이드를 궤도 교반 상태로 둡니다.
3. 접목 직전에 신선한 DPBS에서 수확할 오가노이드를 수집합니다.

2. 달걀 유지, 발달 활성화, 달걀 껍질 천자

1. 수정란(0일째)을 사용할 때까지 18°C의 인큐베이터에 보관합니다.
   알림: 이 온도에서는 발달하지 않고 동일한 성숙 단계에 남아 있습니다.
2. 사용이 필요한 경우 38°C 및 60% 상대 습도에서 45°C 각도로 부드럽게 흔들며 배양합니다.
3. 1일째에는 달걀 껍질 표면을 에탄올 70%로 세척하고 종이 타월로 말려 살균합니다.
4. 수술용 종이 접착 붕대(이하 "붕대"라고 함)를 계란 위에 놓고 계란의 공기실을 덮습니다.
   알림: 이렇게 하면 달걀 껍질의 먼지가 CAM으로 떨어져 달라붙는 것을 방지할 수 있습니다.
5. 멸균 바늘 21G x 11/2''를 사용하여 계란 껍질을 부드럽게 뚫는 기포 천공(이하 ACH)이라고 하는 기실 천공을 수행합니다. 이 시점에서 껍질에서 분리되어 있는 CAM을 방해하지 않도록 계란의 위쪽 끝에 있는 ACH를 엽니다.
6. ACH에 구멍을 뚫기에 가장 좋은 위치를 찾으려면 램프를 사용하여 달걀 위쪽 끝에서 가장 얇은 달걀 껍질 표면을 결정합니다. 직사광선 투과율은 천공하기에 가장 좋은 위치를 나타냅니다.
7. 외부 환경으로부터 배아를 보호하기 위해 새 붕대로 ACH를 덮고 난자를 다시 인큐베이터에 넣습니다.
8. 이 순간부터 인큐베이터의 회전을 멈추고 창이 위로 오도록 계란을 수직 위치로 유지하십시오.
   알림: 이렇게 하면 배아의 발달이 촉진되고 CAM은 배아와 달걀 껍질 사이에 공기실이 있는 상단에서 사용할 수 있게 되어 후속 이식이 가능합니다.
9. 1일차부터 4일차까지 ACH를 엽니다. 생존력은 4일째(접목일 3일 전)에 증가합니다.

3. 뇌 오가노이드 이식

1. CAM이 잘 발달하고 혈관화되어 난자를 배아 전체로 덮는 7일째에 이식을 수행합니다.
2. 붕대를 제거하고 달걀 껍질 표면을 70% 에탄올로 닦아 달걀 껍질을 살균한 다음 ACH를 접목 창으로 조심스럽게 넓힙니다.
3. 이식 창을 확대하는 동안 달걀 껍질 조각이 CAM으로 떨어지는 것을 방지하기 위해 최종 이식 창 너머로 확장을 덮는 더 큰 새 붕대를 놓습니다.
   알림: 이 더 큰 창은 최상의 접목 위치를 선택하고 후속 접목을 위해 필요합니다.
4. 달걀 껍질의 지름이 약 2cm가 될 때까지 부드럽게 구멍을 뚫어 접목 창을 확대합니다. 창이 커질 때까지 핀셋으로 달걀 껍질 창의 가장자리를 부드럽게 제거합니다. 붕대를 부드럽게 벗겨 붕대에 붙어 있을 남아 있는 먼지와 달걀 껍질 조각을 제거합니다.
5. P200 자동 피펫으로 오가노이드를 놓습니다. 멸균 및 날카로운 가위로 팁을 절단하여 오가노이드의 크기에 맞게 개구부를 확대하고 오가노이드의 손상을 방지하거나 와이드 게이지 이송 멸균 팁을 사용하십시오. 최대 50μL의 PBS 부피로 오가노이드를 수집하여 배아 위치와 반대쪽에 있는 CAM으로 직접 옮깁니다.
6. 수확 중 파열을 방지하기 위해 접목의 위치가 노른자에서 멀리 떨어져 있는지 확인하고 가급적이면 혈관 근처에 두는 것이 좋습니다.
7. 오가노이드를 CAM에 놓은 후 오가노이드 주위에 7μL의 Matrigel 한 방울을 떨어뜨립니다.
   알림: 이렇게 하면 오가노이드가 멤브레인 주위를 이동하는 것을 방지할 수 있습니다.
8. 창의 정확한 크기에 맞는 작은 파라필름 조각을 사용하여 창을 닫고 접착 붕대로 쉘에 부착합니다.
   알림: 가스 교환을 허용하면서 배아가 건조되는 것을 방지하기 위해 파라필름으로 창을 완전히 덮는 것이 중요합니다. 창 커버리지의 확장을 적절하게 구분하고, 창을 초과하지 않도록 하면 올바른 배아 발달에 필요한 가스 교환을 방해할 수 있으므로²⁷.

4. 이식된 오가노이드 수확

1. 접목 후 5일째인 38 Hamburger and Hamilton 발달 단계(HH38)²⁸에 해당하는 닭 발달 12일째에 접목된 오가노이드와 주변 CAM을 수확합니다. 이 단계에서 CAM은 성숙한 혈관 조직으로 완전히 분화되고 깃털 세균은 날개와 배아의 위쪽 눈꺼풀을 덮습니다.
2. 접착 붕대를 제거한 후 가위와 미세한 핀셋을 사용하여 샘플 채취를 용이하게 하기 위해 창을 더 확대합니다.
3. 필요한 경우 양안 해부 현미경을 사용하여 오가노이드를 시각화한 다음 오가노이드 및 CAM 수확을 돕기 위해 4% 파라포름알데히드(PFA)로 2분 접두사 단계를 수행합니다.
4. 오가노이드를 포함하는 CAM의 1.5cm² 섹션을 수집합니다.
5. 시료 고정
   1. 샘플을 1x PBS로 세척하고 4°C에서 30분 동안 4% PFA(PBS, pH 7.2)로 고정합니다. 그런 다음 PBS에서 3 x 5분 동안 샘플을 세척합니다.
   2. 샘플을 아지드화나트륨과 함께 PBS에서 4°C에 보관하거나 4°C에서 밤새 30% 자당-PBS에서 직접 냉동 보호합니다.
   3. 동결 보호 후 샘플을 최적의 절단 온도 화합물(OCT)에 넣고 절단할 때까지 -20°C에서 보관합니다. 저온 유지 장치를 사용하여 20μm 두께의 조직 조각을 자르고 자일란화 슬라이드에 수집합니다. 슬라이드는 염색에 사용될 때까지 -20°C에서 보관합니다.

5. 면역형광

1. 실온(RT)에서 10분 동안 0.1% Triton X-100(PBS-T)이 포함된 PBS 용액이 있는 섹션에서 OCT.를 제거합니다.
2. RT에서 1시간 동안 2% BSA, 3% 당나귀 혈청 PBS-T 0.01% 용액으로 차단 용액(BS)으로 절편을 처리합니다.
3. 선택한 1차 항체( 재료 표 참조)를 BS에 희석하고 4°C에서 밤새 샘플을 배양합니다.
4. 다음날 샘플을 RT에서 1x PBS에서 3 x 10 분 세척합니다.
5. 2차 항체를 BS에 희석하고 RT에서 2시간 동안 배양합니다( 재료 표 참조).
6. 샘플을 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 10분 동안 배양하여 RT에서 세포핵을 표시하고 PBS-T에 1:1,000 희석으로 희석합니다.
7. 장착 매체로 슬라이드를 장착하고 유리 커버슬립으로 덮습니다.
8. 광시야 형광 현미경을 사용하여 2.5, 10, 20 및 40x에서 모든 이미지를 촬영합니다.
9. 슬라이스를 4 °C에서 보관하십시오.

6. 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색

참고: 이식이 효과가 있었음을 증명하려면 H&E 염색을 수행하십시오.

1. RT에서 0.1분 동안 PBS-T 10%로 OCT를 제거합니다.
2. 증류수(DW)에서 10분, 헤마톡실린에서 45초, DW에서 1분, PBS에서 20초, 70% EtOH에서 2 x 30초, 80% EtOH에서 2 x 30초, 96% EtOH에서 2 x 30초, 에오신에서 30초, 96% EtOH에서 2 x 15초, 100% EtOH에서 2 x 15초, 자일롤-100% ETOH에서 1분, 자일롤에서 1분, 자일롤(신선)에서 1분.
3. 크실렌 기반 장착 매체를 사용하여 유리 커버슬립을 장착합니다.

결과

이식을 위한 배아 성숙 일정 선택
실험은 수정란이 38°C 및 60% 상대 습도에서 배양될 때 D0에서 시작됩니다. 융모막막(chorioallantoic membrane, CAM)은 난자 배양 후 발달하는 고도로 혈관화된 배아외 막입니다. 그것은 알란토아와 융모막의 융합에 의해 형성됩니다. D1에서 24시간의 배양 후 CAM이 내부 쉘 멤브레인에 부착되는 것을 방지하기 위해 공기 챔버에 구멍이 뚫립니다. D1에서 공기 챔...

토론

이 연구에서는 닭 배아의 생존을 방해하지 않으면서 이식 시 인간 뇌 오가노이드의 유리한 성장과 발달을 제공하는 수많은 주요 단계가 포함된 자세한 프로토콜을 설명합니다. 멸균 바늘을 사용하여 배양 24시간(1일) 후 난자의 공기실에 구멍을 뚫을 것을 권장했습니다. 또한, 우리는 또한 4일째에 구멍을 뚫으려고 시도했습니다(건강한 배아에서만 일하고 있는지 확인하기 위해 혈관 발달을 테스?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse	BioLegend	801201	1:1,000
Anti-GFAP, rabbit	GeneTex	GTX108711	1:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat.	Invitrogen	A-21206	1:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat	Jackson ImmunoResearch	715-585-150	1:500
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs	Granja Gibert (Cambrils, Spain)
DAPI	Invitrogen	D1306	1:10,000
DPX	Sigma	100579	xylene-based mounting medium
Gentle Dissociation Solution	CreativeBiolabs	ITS-0622-YT187	cell dissociation solution
Matrigel	BD Biosciences	356234
Mowiol 4-88 mounting media	Merk	81381
Paper towel, lab-grade	Sigma-Aldrich	Z188956
ROCK inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	10 nM
Sharp-Point Surgical Scissors	VWR	470106-340
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ