אורגנואיד מוח אנושי מוקדם לא מונחה מידול נישה נוירו-וסקולרית לתוך קרום עובר אפרוח מתירני Chorioallantoic

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשתלת אורגנואידים במוח האנושי בשלבי הבשלה מרובים לתוך קרום כוריואלנטואי אפרוח (CAM). אורגנואידים במוח גודלו בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים לא מונחים.

Abstract

השתלת אורגנואידים ברקמות כלי דם בחיות מודל, כגון עכבר מדוכא חיסון או קרום כוריואלנטואי של עובר אפרוח (CAM), הוכחה כיעילה עבור מודלים neovascularization. ה- CAM הוא קרום חוץ-עוברי עשיר בכלי הדם, אשר מראה תגובתיות חיסונית מוגבלת, ובכך הופך למודל אירוח מצוין להשתלות תאים ממקור אנושי.

מאמר זה מתאר את האסטרטגיה להשתלת אורגנואידים במוח האנושי המובחנים בשלבי הבשלה מרובים לתוך CAM. ההרכב התאי של אורגנואידים במוח משתנה עם הזמן, ומשקף את אבני הדרך של התפתחות המוח האנושי. השתלנו אורגנואידים במוח בשלבי הבשלה רלוונטיים: התרחבות נוירואפיתל (18 DIV), נוירוגנזה מוקדמת (60 DIV) וגליוגנזה מוקדמת (180 DIV) לתוך CAM של עוברי תרנגולות ביום העוברי (E)7. אורגנואידים מושתלים במוח נקטפו 5 ימים לאחר מכן ותכונותיהם ההיסטולוגיות נותחו.

לא התגלו סימנים היסטולוגיים של ניאו-וסקולריזציה באורגנואידים המושתלים או בכלי דם חריגים הסמוכים להשתלות. יתר על כן, שינויים מדהימים נצפו בהרכב התאי של האורגנואידים המושתלים, כלומר, עלייה במספר האסטרוציטים של חלבון גליה פיברילרי חומצי-חיובי-תגובתי. עם זאת, השינויים הציטוארכיטקטוניים היו תלויים בשלב ההבשלה האורגנואידי. בסך הכל, תוצאות אלה מצביעות על כך שאורגנואידים במוח יכולים לגדול ב- CAM, והם מראים הבדלים בציטוארכיטקטורה בהתאם לשלב ההבשלה שלהם בהשתלה.

Introduction

אורגנואידים של המוח האנושי הם טכניקה מתפתחת המאפשרת לנו לשחזר את ההתפתחות המוקדמת של המוח האנושי במבחנה ^1,2,3. עם זאת, אחת המגבלות העיקריות של מודל זה היא חוסר כלי דם, אשר ממלא תפקידים חיוניים לא רק בהומאוסטזיס המוח אלא גם בהתפתחות המוח⁴. בנוסף לאספקת חמצן וחומרים מזינים, עדויות מצטברות מצביעות על כך שמערכת כלי הדם במוח מווסתת התמיינות עצבית, נדידה וסינפטוגנזה במהלך התפתחות ^5,6. לכן, יש צורך דחוף להקים מודלים אמינים שיכולים לספק את האיתות והמבנה הווסקולרי החסר לאורגנואידים במוח, ולשפר ....

Protocol

עוברי תרנגולת הלגהורן הלבנה (Gallus gallus) טופלו על ידי מעקב אחר המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה מהמכון למשאבי חיות מעבדה, הוועדה למדעי החיים, המועצה הלאומית למחקר, ארה"ב, והניסויים אושרו על ידי המועצה לטיפול ושימוש בחיות ניסוי מאוניברסיטת ברצלונה.

1. הכנת אורגנואיד מוח לא מונחה

1. שמור על תאי גזע עובריים אנושיים H9 (hESCs) ב- mTESR1 שחוממו מראש בטמפרטורת החדר (RT) תחת מפגש של 70% בצלחות 6 בארות מצופות במטריג'ל מומס ב- DMEM (1:40) באינקובטור 5% CO₂ ב- 37 ° C.
   הערה: יש לשמור את המטריגל בקרח עד לשימוש בו כציפוי למניעת פילמור.
2. יצירת אורגנואידים במוח בעקבות פרוטוקול המוח הלא מונחה

תוצאות

בחירת לוח הזמנים להבשלת העובר להשתלה
הניסוי מתחיל ב-D0 כאשר ביצים מופרות מודגרות בטמפרטורה של 38°C ו-60% לחות יחסית. הממברנה הכוריאואלנטואית (CAM) היא קרום חוץ-עוברי מאוד וסקולרי המתפתח לאחר דגירה של ביציות. הוא נוצר על ידי מיזוג של allantois ו chorion. ב-D1, לאחר 24 שעות של דגירה, תא האוויר מנוקב .......

Discussion

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עם שלבים מרכזיים רבים המספקים צמיחה והתפתחות חיובית של אורגנואידים במוח האנושי עם השתלתם מבלי להפריע להישרדותם של עוברי התרנגולות. המלצנו להשתמש במחטים סטריליות כדי לנקב את תא האוויר של הביצה לאחר 24 שעות של דגירה (יום 1). בנוסף, ניסינו גם לבצע את הניקור ב?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse	BioLegend	801201	1:1,000
Anti-GFAP, rabbit	GeneTex	GTX108711	1:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat.	Invitrogen	A-21206	1:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat	Jackson ImmunoResearch	715-585-150	1:500
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs	Granja Gibert (Cambrils, Spain)
DAPI	Invitrogen	D1306	1:10,000
DPX	Sigma	100579	xylene-based mounting medium
Gentle Dissociation Solution	CreativeBiolabs	ITS-0622-YT187	cell dissociation solution
Matrigel	BD Biosciences	356234
Mowiol 4-88 mounting media	Merk	81381
Paper towel, lab-grade	Sigma-Aldrich	Z188956
ROCK inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	10 nM
Sharp-Point Surgical Scissors	VWR	470106-340
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ