Modélisation précoce non guidée de la niche neurovasculaire organoïde du cerveau humain dans la membrane chorioallantoïde permissive de l’embryon de poussin

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour greffer des organoïdes cérébraux humains à plusieurs stades de maturation dans la membrane chorioallantoïdienne (CAM) du poulet. Les organoïdes cérébraux ont été cultivés selon des protocoles standardisés non guidés.

Résumé

La greffe d’organoïdes dans des tissus vascularisés chez des animaux modèles, tels que la membrane chorioallantoïde (CAM) immunodéficiente de souris ou d’embryon de poussin, s’est avérée efficace pour la modélisation de la néovascularisation. La CAM est une membrane extraembryonnaire richement vascularisée, qui présente une immunoréactivité limitée, devenant ainsi un excellent modèle d’accueil pour les greffes de cellules d’origine humaine.

Cet article décrit la stratégie pour greffer des organoïdes cérébraux humains différenciés à plusieurs stades de maturation dans la CAM. La composition cellulaire des organoïdes cérébraux change avec le temps, reflétant les étapes importantes du développement du cerveau humain. Nous avons greffé des organoïdes cérébraux aux stades de maturation pertinents : expansion neuroépithéliale (18 DIV), neurogenèse précoce (60 DIV) et gliogenèse précoce (180 DIV) dans la CAM d’embryons embryonnaires de poulet jour (E)7. Des organoïdes cérébraux greffés ont été prélevés 5 jours plus tard et leurs caractéristiques histologiques ont été analysées.

Aucun signe histologique de néovascularisation dans les organoïdes greffés ou vaisseaux sanguins anormaux adjacents aux greffes n’a été détecté. De plus, des changements remarquables ont été observés dans la composition cellulaire des organoïdes greffés, à savoir une augmentation du nombre d’astrocytes réactifs à l’acide fibrillaire glial. Cependant, les changements cytoarchitecturaux dépendaient du stade de maturation des organoïdes. Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent que les organoïdes cérébraux peuvent se développer dans la CAM, et ils montrent des différences dans la cytoarchitecture en fonction de leur stade de maturation à la greffe.

Introduction

Les organoïdes cérébraux humains sont une technique émergente qui nous permet de récapituler le développement précoce du cerveau humain in vitro ^1,2,3. Néanmoins, l’une des limites majeures de ce modèle est le manque de vascularisation, qui joue un rôle indispensable non seulement dans l’homéostasie cérébrale mais aussi dans le développement du cerveau⁴. En plus de l’apport d’oxygène et de nutriments, de plus en plus de preuves suggèrent que le système vasculaire du cerveau régule la différenciation, la migration et la synaptogenèse neuronales au cours du développement ^5,6. Par conséquent, il est urgent d’établir des modèles fiables capables de fournir la signalisation vasculaire et la structure manquantes aux organoïdes cérébraux, augmentant ainsi la complexité de la génération d’organoïdes cérébraux humains⁷.

Parmi les méthodes de vascularisation proposées, deux axes principaux peuvent être envisagés : la greffe d’organoïdes dans un organisme vivant et les technologies purement in vitro co-cultivant des cellules endothéliales et des cellules neurales 8,9,10,11,12. La transplantation intracérébrale chez la souris est coûteuse et prend du temps, ce qui rend d’autres technologies pertinentes pour des modèles plus simples. Le test de la membrane chorioallantoïdienne (CAM) du poulet a été largement utilisé pour étudier l’angiogenèse 13,14,15. Au cours de la dernière décennie, plusieurs groupes ont réussi à greffer différents types d’organoïdes, notamment des organoïdes rénaux^16,17, cardiaques¹⁸ et tumoraux^19,20, dans des CAM. Néanmoins, on sait peu de choses sur l’efficacité, la toxicité/rejet, l’effet physiologique et les méthodes de greffe d’organoïdes cérébraux humains dans la MCA. Un autre aspect intéressant et encore inexploré est la formation d’une barrière hémato-encéphalique chimérique (BHE) entre la CAM et l’interface astrocytaire organoïde. Des travaux pionniers antérieurs ont suggéré la faisabilité présumée de générer une BHE dans le CAM en transplantant des astrocytes et un milieu conditionné par les astrocytes 21,22,23. Cependant, les astrocytes matures semblent incapables d’atteindre ce^24,25. Ainsi, la formation de la BHE induite par les astrocytes reste discutable, et la transplantation d’organoïdes cérébraux humains permettrait de faire la lumière sur cette controverse.

Cet article vidéo décrit un protocole de greffe d’organoïdes cérébraux humains in ovo dans la MCA qui favorise la croissance, l’amélioration et la vascularisation, ce qui permet d’obtenir des organoïdes qui englobent des éléments de la BHE histologiquement compatibles. Ici, nous présentons un protocole assurant la survie de l’embryon de poulet et rapportons la permissivité de la CAM pour soutenir la croissance des organoïdes cérébraux.

Protocole

Les embryons de poulet Leghorn blanc (Gallus gallus) ont été traités en suivant le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Institut des ressources pour les animaux de laboratoire, Commission des sciences de la vie, Conseil national de la recherche, États-Unis, et les expériences ont été approuvées par le Conseil pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Université de Barcelone.

1. Préparation non guidée d’organoïdes cérébraux

1. Maintenir les cellules souches embryonnaires humaines H9 (CSEh) dans mTESR1 préchauffées à température ambiante (RT) sous une confluence de 70 % dans des plaques à 6 puits recouvertes de Matrigel dissous dans du DMEM (1:40) dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C.
   REMARQUE : Le Matrigel doit être conservé dans la glace jusqu’à son utilisation comme revêtement pour empêcher sa polymérisation.
2. Générer des organoïdes cérébraux en suivant le protocole cérébral non guidé ².
   1. Dissocier les CSEh H9 à l’aide de 500 μL de la solution de dissociation cellulaire et incuber pendant 3 à 5 min à 37 °C. Remise en suspension dans mTESR1 contenant un inhibiteur de ROCK Y27632 (concentration finale de 50 μM) et ensemencer 9 000 cellules par puits dans une plaque de 96 puits prétraitée à faible adhérence.
   2. Une fois que les organoïdes se sont agrégés dans mTESR1 contenant un inhibiteur de ROCK Y27632 (concentration finale de 50 μM), transférez-les dans un milieu d’induction pendant 5 à 6 jours.
   3. En suivant le protocole²⁶ des organoïdes cérébraux non guidés, transférer les organoïdes dans des milieux d’induction neuronale à ~jours 4-5.
   4. Une fois qu’ils ont acquis la taille et l’anneau de neuroépithélium, transférez-les dans une goutte de Matrigel glacée. Une fois le Matrigel polymérisé, transférez les organoïdes dans une boîte de Pétri à faible adhérence de 5 cm avec 5 ml de milieu de maturation préchauffé.
   5. Après 4 jours, mettez les organoïdes cérébraux sous agitation orbitaire.
3. Recueillir les organoïdes pour la récolte dans des DPBS frais immédiatement avant la greffe.

2. Entretien des œufs, activation du développement et perforation de la coquille d’œuf

1. Conserver les œufs fécondés (au jour 0) dans un incubateur à 18 °C jusqu’à utilisation.
   REMARQUE : À cette température, ils ne se développent pas, restant au même stade de maturation.
2. Si nécessaire, incubez-les à 38 °C et 60 % d’humidité relative avec une rotation à bascule douce à un angle de 45 °C.
3. Le jour 1, nettoyez la surface de la coquille d’œuf avec de l’éthanol à 70 % et séchez-la avec une serviette en papier pour la stériliser.
4. Placez un pansement adhésif en papier chirurgical, ci-après appelé « pansement », sur l’œuf, en recouvrant la chambre à air de l’œuf.
   REMARQUE : Cela empêchera la poussière de la coquille d’œuf de tomber dans le CAM où elle se coince.
5. Effectuer la ponction de perforation de la chambre à air, ci-après appelée trou de la chambre à air (ACH), avec une aiguille stérile de 21 G x 1 po, en perforant doucement la coquille de l’œuf. Ouvrez l’ACH à l’extrémité supérieure de l’œuf pour éviter de déranger le CAM, qui à ce stade pond séparé de la coquille.
6. Pour trouver la meilleure position pour percer l’ACH, utilisez une lampe pour déterminer la surface de la coquille d’œuf la plus fine à l’extrémité supérieure de l’œuf. La transmission directe du faisceau lumineux indique la meilleure position pour percer.
7. Couvrez l’ACH avec un nouveau pansement pour protéger l’embryon de l’environnement extérieur et replacez l’ovule dans l’incubateur.
8. À partir de ce moment, arrêtez la rotation dans l’incubateur et maintenez les œufs en position verticale avec la fenêtre sur le dessus.
   REMARQUE : Cela facilitera le développement de l’embryon, et le CAM devient disponible en haut avec une chambre d’air entre l’embryon et la coquille d’œuf, permettant une greffe ultérieure.
9. Ouvrez l’ACH du jour 1 au jour 4. La viabilité augmente le jour 4 (3 jours avant le jour du greffage).

3. Greffe d’organoïde cérébral

1. Effectuez le greffage le jour 7 lorsque la CAM est bien développée et vascularisée, couvrant l’ovule sur tout l’embryon.
2. Retirez le pansement et essuyez la surface de la coquille d’œuf avec de l’éthanol à 70 % pour stériliser la coquille d’œuf, avant d’élargir soigneusement l’ACH en une fenêtre de greffe.
3. Placez un nouveau pansement plus gros couvrant l’extension au-delà de la fenêtre de greffe finale pour éviter que des fragments de coquille d’œuf ne tombent dans le CAM tout en agrandissant la fenêtre de greffe.
   REMARQUE : Cette fenêtre plus grande est nécessaire pour sélectionner la meilleure position de greffage et pour la greffe ultérieure.
4. Agrandissez la fenêtre de greffe en perforant doucement la coquille d’œuf jusqu’à ce que la fenêtre atteigne un diamètre d’environ 2 cm. Retirez délicatement les bords de la fenêtre en coquille d’œuf avec une pince à épiler jusqu’à ce que la fenêtre soit agrandie. Enlevez la poussière restante et les morceaux de coquille d’œuf qui resteront attachés au pansement en décollant doucement le pansement.
5. Placez l’organoïde avec une pipette automatique P200. Coupez les pointes avec des ciseaux stériles et tranchants pour agrandir l’ouverture en fonction de la taille de l’organoïde et éviter d’endommager l’organoïde ou utilisez des pointes stériles de transfert de gros calibre. Prélevez l’organoïde dans un volume maximum de 50 μL de PBS et transférez-le directement dans le CAM, sur un côté opposé à l’emplacement de l’embryon.
6. Assurez-vous que la position du greffon est éloignée du jaune pour éviter sa rupture lors du prélèvement, et de préférence, placez-le près d’un vaisseau sanguin.
7. Placez une goutte de 7 μL de Matrigel autour de l’organoïde après avoir placé l’organoïde sur le CAM.
   REMARQUE : Cela empêchera l’organoïde de se déplacer autour de la membrane.
8. Fermez la fenêtre à l’aide d’un petit morceau de parafilm de la taille exacte de la fenêtre et fixez-le à la coque avec un pansement adhésif.
   REMARQUE : Il est important de couvrir entièrement la fenêtre avec le parafilm pour éviter que l’embryon ne se dessèche tout en permettant l’échange gazeux. Délimitez correctement l’extension de la couverture de la fenêtre, en évitant de dépasser la fenêtre, car cela pourrait entraver l’échange gazeux nécessaire au bon développement de l’embryon²⁷.

4. Prélèvement d’organoïdes transplantés

1. Récoltez les organoïdes greffés et le CAM environnant au jour 12 du développement du poulet, correspondant au stade de développement 38 Hamburger et Hamilton (HH38)²⁸, 5 jours après la greffe. À ce stade, le CAM est complètement différencié avec un système vasculaire mature tandis que les germes de plumes recouvrent les ailes ainsi que la paupière supérieure de l’embryon.
2. Après avoir retiré le pansement adhésif, agrandissez davantage la fenêtre pour faciliter la récolte des échantillons à l’aide de ciseaux et d’une pince à épiler fine.
3. Visualisez l’organoïde à l’aide d’une microscopie à dissection binoculaire si nécessaire, suivie d’une étape de préfixation de 2 minutes avec du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pour faciliter la récolte des organoïdes et des CAM.
4. Prélevez une section de 1,5 cm² du CAM contenant l’organoïde.
5. Fixation de l’échantillon
   1. Laver les échantillons avec 1x PBS et les fixer avec 4% de PFA (en PBS, pH 7,2) pendant 30 min à 4 °C. Ensuite, lavez les échantillons pendant 3 x 5 min dans du PBS.
   2. Stocker les échantillons à 4 °C dans du PBS avec de l’azoture de sodium ou les cryoprotéger directement dans du saccharose-PBS à 30 % pendant la nuit à 4 °C.
   3. Après cryoprotection, intégrer les échantillons dans un composé à température de coupe optimale (OCT) et les stocker à -20 °C jusqu’à la section. Couper des tranches de tissu de 20 μm d’épaisseur à l’aide d’un cryostat et les recueillir sur des lames xylanisées. Conservez les lames à -20 °C jusqu’à ce qu’elles soient utilisées pour la coloration.

5. Immunofluorescence

1. Retirer l’OCT des sections avec une solution PBS avec 0,1 % de Triton X-100 (PBS-T) pendant 10 min à température ambiante (RT).
2. Traiter les sections avec une solution de blocage (BS) avec une solution de PBS-T à 0,01 % de BSA à 2 %, 3 % de sérum d’ânesse pendant 1 h à RT.
3. Diluer l’anticorps primaire sélectionné (voir le tableau des matières) dans la BS et incuber les échantillons pendant la nuit à 4 °C.
4. Le lendemain, laver les échantillons 3 x 10 min dans 1x PBS à RT.
5. Diluer l’anticorps secondaire dans BS et incuber pendant 2 h à RT (voir le tableau des matériaux).
6. Incuber les échantillons pendant 10 min avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour marquer les noyaux cellulaires à RT, dilués dans du PBS-T à une dilution de 1:1 000.
7. Montez les diapositives avec un support de montage et recouvrez-les avec des lamelles en verre.
8. Prenez toutes les images à l’aide d’un microscope à fluorescence à grand champ à 2,5, 10, 20 et 40x.
9. Conservez les tranches à 4 °C.

6. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E)

REMARQUE : Pour prouver que la greffe a fonctionné, effectuez une coloration H&E.

1. Éliminer l’OCT avec PBS-T 0,1 % pendant 10 min à RT.
2. Effectuer une déshydratation en série dans une hotte comme suit : 10 min dans de l’eau distillée (DW), 45 s dans de l’hématoxyline, 1 min dans DW, 20 s dans du PBS, 2 x 30 s dans 70 % d’EtOH, 2 x 30 s dans 80 % d’EtOH, 2 x 30 s dans 96 % d’EtOH, 30 s dans de l’éosine, 2 x 15 s dans 96 % d’EtOH, 2 x 15 s dans 100 % d’EtOH, 1 min dans le xylol-100 % ETOH, 1 min dans le xylol, 1 min dans le xylol (frais).
3. Montez les lamelles en verre avec un support de montage à base de xylène.

Résultats

Sélection du calendrier de maturation embryonnaire pour la greffe
L’expérience commence à J0 lorsque les œufs fécondés sont incubés à 38 °C et 60 % d’humidité relative. La membrane chorioallantoïdienne (CAM) est une membrane extraembryonnaire hautement vascularisée qui se développe après l’incubation de l’œuf. Il est formé par la fusion de l’allantoïde et du chorion. À J1, après 24 h d’incubation, la chambre à air est perforée pour empêcher le CAM de se fixer à la me...

Discussion

Dans cette étude, nous décrivons un protocole détaillé avec de nombreuses étapes clés qui assurent une croissance et un développement favorables des organoïdes cérébraux humains lors de la greffe sans perturber la survie des embryons de poulet. Nous avons recommandé l’utilisation d’aiguilles stériles pour percer la chambre à air de l’œuf après 24 h d’incubation (jour 1). De plus, nous avons également essayé de faire la ponction au jour 4 (après avoir vérifié la coquille de l’œuf à la lumi?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse	BioLegend	801201	1:1,000
Anti-GFAP, rabbit	GeneTex	GTX108711	1:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat.	Invitrogen	A-21206	1:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat	Jackson ImmunoResearch	715-585-150	1:500
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs	Granja Gibert (Cambrils, Spain)
DAPI	Invitrogen	D1306	1:10,000
DPX	Sigma	100579	xylene-based mounting medium
Gentle Dissociation Solution	CreativeBiolabs	ITS-0622-YT187	cell dissociation solution
Matrigel	BD Biosciences	356234
Mowiol 4-88 mounting media	Merk	81381
Paper towel, lab-grade	Sigma-Aldrich	Z188956
ROCK inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	10 nM
Sharp-Point Surgical Scissors	VWR	470106-340
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ