寛容なニワトリ胚絨毛膜への初期の非誘導ヒト脳オルガノイド神経血管ニッチモデリング

要約

ここでは、複数の成熟段階にあるヒト脳オルガノイドをニワトリの絨毛膜膜(CAM)に生着させるプロトコルを紹介します。脳オルガノイドは、ガイドなしで標準化されたプロトコルに従って増殖しました。

要約

免疫不全マウスやニワトリ胚の絨毛膜膜(CAM)などのモデル動物の血管新生組織にオルガノイドを生着させることは、血管新生モデリングに有効であることが証明されています。CAMは血管新生した胚外膜であり、免疫反応性が限られているため、ヒト由来の細胞移植の優れた宿主モデルとなっています。

本稿では、複数の成熟段階で分化したヒト脳オルガノイドをCAMに生着させる戦略について述べる。脳オルガノイドの細胞組成は、ヒトの脳発達のマイルストーンを反映して、時間とともに変化します。神経上皮拡大(18 DIV)、初期神経新生(60 DIV)、および初期神経膠形成(180 DIV)の関連する成熟段階の脳オルガノイドを、胚日(E)7ニワトリ胚のCAMに移植しました。生着した脳オルガノイドを5日後に採取し、その組織学的特徴を分析した。

移植されたオルガノイドまたは移植片に隣接する異常な血管における血管新生の組織学的兆候は検出されませんでした。.さらに、移植されたオルガノイドの細胞組成に顕著な変化、すなわちグリア線維性酸性タンパク質陽性反応性アストロサイトの数の増加が観察されました。しかし、細胞構造の変化はオルガノイドの成熟段階に依存していました。これらの結果は、脳オルガノイドがCAM内で増殖できることを示唆しており、移植時の成熟段階に応じて細胞構造に違いがあることを示しています。

概要

ヒト脳オルガノイドは、ヒト脳の初期発生をin vitroで再現することを可能にする新しい技術です^1,2,3。しかし、このモデルの大きな限界の1つは、脳の恒常性だけでなく、脳の発達にも不可欠な役割を果たす血管新生の欠如です⁴。酸素と栄養素の供給に加えて、脳の血管系が発達中の神経分化、移動、シナプス形成を調節していることを示唆する証拠が蓄積されています^5,6。したがって、欠落している血管シグナル伝達と構造を脳オルガノイドに提供し、ヒト脳オルガノイド第⁷世代の複雑さを高めることができる信頼性の高いモデルを確立することが急務です。

血管新生のために提案された方法の中で、2つの主要な合理化ラインを考慮することができます:生体へのオルガノイド生着と、内皮細胞と^{神経細胞を}共培養する純粋なin vitro技術8,9,10,11,12。^<....

プロトコル

ホワイトレグホーンニワトリ(Gallus gallus)の胚は、米国国立研究評議会生命科学委員会実験動物資源研究所の実験動物のケアと使用に関するガイドに従って処理され、実験はバルセロナ大学の実験動物のケアと使用のための評議会によって承認されました。

1. 非誘導脳オルガノイド調製

1. 37°Cの5%_CO2 インキュベーターでDMEM(1:40)に溶解したマトリゲルでコーティングした6ウェルプレートで、室温(RT)で予熱したmTESR1で70%の合流点下でH9ヒト胚性幹細胞(hESC)を維持します。
   注:マトリゲルは、重合を防ぐためにコーティングとして使用するまで氷上に保管する必要があります。
2. 非誘導 ^{脳プロトコル2}に従って脳オルガノイドを生成します。
   1. 500 μLの細胞解離溶液を使用してH9 hESCを解離し、37°Cで3〜5分間インキュベートします。 ROCK 阻害剤 Y27632 を含む mTESR1 (最終濃度 50 μM) に再懸濁し、低接着性前処理済み 96 ウェルプレートにウェルあたり 9,000 個の細胞を播種します。
   2. オルガノイドがROCK阻害剤Y27632(最終濃度50 μM)を含むmTESR1に凝集したら、誘導培地に5〜6日間移します。
   3. ....

ディスカッション

この研究では、ニワトリ胚の生存を乱すことなく、移植時にヒト脳オルガノイドの良好な成長と発達を提供する多数の重要なステップを含む詳細なプロトコルについて説明します。24時間の孵化後(1日目)に卵の空気室に穴を開けるために滅菌針の使用を推奨しました。さらに、4日目に穿刺を試みました(卵の殻を光でチェックして血管系の発達をテストし、健康な胚のみで作業していることを.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse	BioLegend	801201	1:1,000
Anti-GFAP, rabbit	GeneTex	GTX108711	1:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat.	Invitrogen	A-21206	1:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat	Jackson ImmunoResearch	715-585-150	1:500
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs	Granja Gibert (Cambrils, Spain)
DAPI	Invitrogen	D1306	1:10,000
DPX	Sigma	100579	xylene-based mounting medium
Gentle Dissociation Solution	CreativeBiolabs	ITS-0622-YT187	cell dissociation solution
Matrigel	BD Biosciences	356234
Mowiol 4-88 mounting media	Merk	81381
Paper towel, lab-grade	Sigma-Aldrich	Z188956
ROCK inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	10 nM
Sharp-Point Surgical Scissors	VWR	470106-340
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ