寛容なニワトリ胚絨毛膜への初期の非誘導ヒト脳オルガノイド神経血管ニッチモデリング

要約

ここでは、複数の成熟段階にあるヒト脳オルガノイドをニワトリの絨毛膜膜(CAM)に生着させるプロトコルを紹介します。脳オルガノイドは、ガイドなしで標準化されたプロトコルに従って増殖しました。

要約

免疫不全マウスやニワトリ胚の絨毛膜膜(CAM)などのモデル動物の血管新生組織にオルガノイドを生着させることは、血管新生モデリングに有効であることが証明されています。CAMは血管新生した胚外膜であり、免疫反応性が限られているため、ヒト由来の細胞移植の優れた宿主モデルとなっています。

本稿では、複数の成熟段階で分化したヒト脳オルガノイドをCAMに生着させる戦略について述べる。脳オルガノイドの細胞組成は、ヒトの脳発達のマイルストーンを反映して、時間とともに変化します。神経上皮拡大(18 DIV)、初期神経新生(60 DIV)、および初期神経膠形成(180 DIV)の関連する成熟段階の脳オルガノイドを、胚日(E)7ニワトリ胚のCAMに移植しました。生着した脳オルガノイドを5日後に採取し、その組織学的特徴を分析した。

移植されたオルガノイドまたは移植片に隣接する異常な血管における血管新生の組織学的兆候は検出されませんでした。.さらに、移植されたオルガノイドの細胞組成に顕著な変化、すなわちグリア線維性酸性タンパク質陽性反応性アストロサイトの数の増加が観察されました。しかし、細胞構造の変化はオルガノイドの成熟段階に依存していました。これらの結果は、脳オルガノイドがCAM内で増殖できることを示唆しており、移植時の成熟段階に応じて細胞構造に違いがあることを示しています。

概要

ヒト脳オルガノイドは、ヒト脳の初期発生をin vitroで再現することを可能にする新しい技術です^1,2,3。しかし、このモデルの大きな限界の1つは、脳の恒常性だけでなく、脳の発達にも不可欠な役割を果たす血管新生の欠如です⁴。酸素と栄養素の供給に加えて、脳の血管系が発達中の神経分化、移動、シナプス形成を調節していることを示唆する証拠が蓄積されています^5,6。したがって、欠落している血管シグナル伝達と構造を脳オルガノイドに提供し、ヒト脳オルガノイド第⁷世代の複雑さを高めることができる信頼性の高いモデルを確立することが急務です。

血管新生のために提案された方法の中で、2つの主要な合理化ラインを考慮することができます:生体へのオルガノイド生着と、内皮細胞と^{神経細胞を}共培養する純粋なin vitro技術8,9,10,11,12。マウスの脳内移植はコストと時間がかかるため、より単純なモデルに関連する他の技術があります。ニワトリ絨毛膜(CAM)アッセイは、血管新生の研究に広く使用されています^13,14,15。過去10年間で、いくつかのグループが、腎臓^16,17、心臓¹⁸、腫瘍オルガノイド^19,20など、さまざまなタイプのオルガノイドをCAMに生着させることに成功しました。それにもかかわらず、ヒト脳オルガノイドをCAMに生着させる有効性、毒性/拒絶反応、生理学的効果、および方法についてはほとんど知られていません。また、CAMとオルガノイド星状細胞界面の間にキメラ血液脳関門(BBB)が形成されるという、興味深い点もあります。以前の先駆的な研究は、アストロサイトとアストロサイトコンディショニング培地を移植することにより、CAMでBBBを生成することの推定上の実現可能性を示唆しました21,22,23。しかし、成熟したアストロサイトはこれを達成できないようです^24,25。したがって、アストロサイトによるBBBの形成については議論の余地があり、ヒト脳オルガノイドを移植することで、この論争に光を当てることができます。

このビデオ記事では、成長、改善、血管新生を促進し、組織学的に適合するBBB要素を含むオルガノイドをもたらすCAMへの卵 子ヒト 脳オルガノイド移植のプロトコルについて説明します。ここでは、ニワトリ胚の生存を保証するプロトコルを提示し、脳オルガノイドの成長を維持するためのCAMの許容性について報告します。

プロトコル

ホワイトレグホーンニワトリ(Gallus gallus)の胚は、米国国立研究評議会生命科学委員会実験動物資源研究所の実験動物のケアと使用に関するガイドに従って処理され、実験はバルセロナ大学の実験動物のケアと使用のための評議会によって承認されました。

1. 非誘導脳オルガノイド調製

1. 37°Cの5%_CO2 インキュベーターでDMEM(1:40)に溶解したマトリゲルでコーティングした6ウェルプレートで、室温(RT)で予熱したmTESR1で70%の合流点下でH9ヒト胚性幹細胞(hESC)を維持します。
   注:マトリゲルは、重合を防ぐためにコーティングとして使用するまで氷上に保管する必要があります。
2. 非誘導 ^{脳プロトコル2}に従って脳オルガノイドを生成します。
   1. 500 μLの細胞解離溶液を使用してH9 hESCを解離し、37°Cで3〜5分間インキュベートします。 ROCK 阻害剤 Y27632 を含む mTESR1 (最終濃度 50 μM) に再懸濁し、低接着性前処理済み 96 ウェルプレートにウェルあたり 9,000 個の細胞を播種します。
   2. オルガノイドがROCK阻害剤Y27632(最終濃度50 μM)を含むmTESR1に凝集したら、誘導培地に5〜6日間移します。
   3. 非誘導脳オルガノイドプロトコル²⁶に続いて、オルガノイドを神経誘導培地に移します ~4-5日目。
   4. サイズと神経上皮リングを取得したら、氷冷したマトリゲル滴に移します。マトリゲルが重合したら、オルガノイドを5 mLの予熱熟成培地を入れた5cmの低粘着ペトリ皿に移します。
   5. 4日後、脳オルガノイドを眼窩攪拌下に置きます。
3. 移植直前に新鮮なDPBSで採取するためのオルガノイドを回収します。

2.卵の維持、発育の活性化、卵殻の穿刺

1. 受精卵(0日目)は、使用するまで18°Cのインキュベーターで保存します。
   注:この温度では、それらは発達せず、同じ成熟段階にとどまります。
2. 使用に必要な場合は、38°C、相対湿度60%で、45°Cの角度でソフトロッキング回転しながらインキュベートします。
3. 1日目に卵殻の表面を70%エタノールで洗浄し、ペーパータオルで乾かして殺菌します。
4. 卵の上に外科用紙の絆創膏(以下「包帯」と呼ぶ)を置き、卵の空気室を覆います。
   注意: これにより、卵殻のほこりがCAMに落ちて詰まるのを防ぐことができます。
5. 卵殻に滅菌針21 G x 11/2 ''で空気室穿孔(以下、空気室穴(ACH)と呼びます)を静かに穿刺します。卵の上端にあるACHを開いて、この時点で殻から離れているCAMを乱さないようにします。
6. ACHに穴を開けるのに最適な位置を見つけるには、ランプを使用して、卵の上端にある最も薄い卵殻の表面を決定します。直接光線透過は、掘削に最適な位置を示します。
7. ACHを新しい包帯で覆い、胚を外部環境から保護し、卵をインキュベーターに戻します。
8. この瞬間から、インキュベーターでの回転を停止し、窓を上にして卵を垂直位置に維持します。
   注:これにより、胚の発育が促進され、CAMは胚と卵殻の間に空気のチャンバーがあり、上部で利用可能になり、その後の接ぎ木が可能になります。
9. 1 日目から 4 日目までの ACH を開きます。生存率は4日目(移植日の3日前)に増加します。

3. 脳オルガノイド移植

1. CAMが十分に発達し、血管新生し、胚全体に卵を覆う7日目に移植を行います。
2. 包帯を取り除き、卵殻の表面を70%エタノールで拭いて卵殻を滅菌してから、ACHを接ぎ木窓に慎重に広げます。
3. 接ぎ木窓を広げながら卵殻の破片がCAMに落ちないように、最終的な接ぎ木窓を超えて延長部を覆う新しい大きな包帯を置きます。
   注:この大きなウィンドウは、最適な接ぎ木位置を選択し、その後の接ぎ木に必要です。
4. 窓が直径約2 cmに達するまで卵殻にそっと穴を開けて、接ぎ木窓を拡大します。窓が大きくなるまで、ピンセットで卵殻窓の端をそっと取り除きます。包帯をそっと剥がして、包帯に付着したままの残りのほこりや卵殻片を取り除きます。
5. オルガノイドをP200自動ピペットで配置します。チップを滅菌された鋭利なハサミでカットして、オルガノイドのサイズに応じて開口部を拡大し、オルガノイドの損傷を防ぐか、ワイドゲージのトランスファー滅菌チップを使用します。オルガノイドを最大容量50 μLのPBSで回収し、胚の位置とは反対側のCAMに直接移します。
6. 収穫中の破裂を避けるために、移植片の位置が卵黄から離れていることを確認し、できれば血管の近くに置きます。
7. オルガノイドをCAMに置いた後、オルガノイドを囲む7 μLのマトリゲルを滴下します。
   注:これにより、オルガノイドが膜の周りを移動するのを防ぎます。
8. 窓のサイズにぴったり合うパラフィルムの小片を使用して窓を閉じ、絆創膏でシェルに取り付けます。
   注:ガス交換を可能にしている間、胚が乾燥するのを防ぐために、窓をパラフィルムで完全に覆うことが重要です。正しい胚発生に必要なガス交換を妨げる可能性があるため、ウィンドウを超えないようにして、ウィンドウカバレッジの拡張を適切に区切ります²⁷。

4. 移植オルガノイド採取

1. 接ぎ木の5日後、38ハンバーガーとハミルトンの発育段階(HH38)²⁸に対応するニワトリ発育の12日目に、接ぎ木したオルガノイドと周囲のCAMを収穫します。この段階では、CAMは成熟した血管系で完全に分化しており、羽毛の細菌は胚の上まぶただけでなく翼も覆い隠しています。
2. 絆創膏を剥がしたら、ハサミや細いピンセットを使ってサンプルを採取しやすいように窓をさらに大きくします。
3. 必要に応じて両眼解剖顕微鏡でオルガノイドを可視化し、その後、オルガノイドとCAMの回収を助けるために、4%パラホルムアルデヒド(PFA)を用いた2分間のプレフィギュレーションステップを行います。
4. オルガノイドを含むCAMの1.5cm2切片を採取します。
5. サンプル固定
   1. サンプルを 1 x PBS で洗浄し、4% PFA(PBS、pH 7.2)で 4 °C で 30 分間固定します。 次に、サンプルをPBSで3 x 5分間洗浄します。
   2. サンプルは、アジ化ナトリウムを含むPBSで4°Cで保存するか、30%スクロース-PBSで4°Cで一晩凍結保護します。
   3. 凍結保護後、サンプルを最適な切断温度コンパウンド(OCT)に包埋し、切片化まで-20°Cで保存します。クライオスタットを用いて厚さ20 μmの組織切片を切断し、キシラン化スライド上に回収します。スライドは染色に使用するまで-20°Cで保管してください。

5. 免疫蛍光法

1. 0.1% Triton X-100(PBS-T)を含むPBS溶液で切片からOCT.を除去し、室温(RT)で10分間加熱します。
2. 切片をブロッキング溶液(BS)と2%BSA、3%ロバ血清PBS-T 0.01%溶液で1時間室温で処理します。
3. 選択した一次抗体( 材料表を参照)をBSで希釈し、サンプルを4°Cで一晩インキュベートします。
4. 翌日、RTでサンプルを1x PBSで10分×3回洗浄します。
5. 二次抗体をBSで希釈し、室温で2時間インキュベートします( 材料表を参照)。
6. サンプルを4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)と10分間インキュベートし、PBS-Tで希釈して1:1,000に希釈した細胞核を室温でマーキングします。
7. スライドに埋込剤を取り付け、ガラス製のカバーガラスで覆います。
8. 広視野蛍光顕微鏡を使用して、2.5倍、10倍、20倍、40倍ですべての画像を撮影します。
9. スライスは4°Cで保存します。

6. ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色

注:グラフトが機能したことを証明するには、H&E染色を行います。

1. PBS-T 0.1%でOCTを室温で10分間除去します。
2. 蒸留水(DW)で10分、ヘマトキシリンで45秒、DWで1分、PBSで20秒、70%EtOHで2 x 30秒、80%EtOHで2 x 30秒、96%EtOHで2 x 30秒、エオシンで30秒、96%EtOHで2 x 15秒、 100%EtOHで2 x 15秒、キシロール-100%ETOHで1分、キシロールで1分、キシロール(新鮮)で1分。
3. ガラスカバーガラスをキシレンベースの封入剤で取り付けます。

結果

移植のための胚成熟スケジュールの選択
実験は、受精卵を38°C、相対湿度60%で孵化させるD0から始まります。絨毛膜(CAM)は、卵の孵化後に発達する高度に血管新生した胚外膜です。それは尿膜と絨毛膜の融合によって形成されます。D1では、24時間のインキュベーション後、CAMが内殻膜に付着しないように空気室に穴を開けます。D1で空気室に穴を開けると、後の段階での穿刺(D4)...

ディスカッション

この研究では、ニワトリ胚の生存を乱すことなく、移植時にヒト脳オルガノイドの良好な成長と発達を提供する多数の重要なステップを含む詳細なプロトコルについて説明します。24時間の孵化後(1日目)に卵の空気室に穴を開けるために滅菌針の使用を推奨しました。さらに、4日目に穿刺を試みました(卵の殻を光でチェックして血管系の発達をテストし、健康な胚のみで作業していることを...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse	BioLegend	801201	1:1,000
Anti-GFAP, rabbit	GeneTex	GTX108711	1:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat.	Invitrogen	A-21206	1:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat	Jackson ImmunoResearch	715-585-150	1:500
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs	Granja Gibert (Cambrils, Spain)
DAPI	Invitrogen	D1306	1:10,000
DPX	Sigma	100579	xylene-based mounting medium
Gentle Dissociation Solution	CreativeBiolabs	ITS-0622-YT187	cell dissociation solution
Matrigel	BD Biosciences	356234
Mowiol 4-88 mounting media	Merk	81381
Paper towel, lab-grade	Sigma-Aldrich	Z188956
ROCK inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	10 nM
Sharp-Point Surgical Scissors	VWR	470106-340
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ