Modellazione precoce della nicchia neurovascolare dell'organoide umano non guidato nella membrana corioallantoica dell'embrione permissivo del pulcino

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per innestare organoidi cerebrali umani in più stadi di maturazione nella membrana corioallantoica (CAM) del pulcino. Gli organoidi cerebrali sono stati coltivati seguendo protocolli standardizzati non guidati.

Abstract

L'innesto di organoidi in tessuti vascolarizzati in animali modello, come la membrana corioallantoica (CAM) immunodeficiente di topo o di embrione di pulcino, si è dimostrata efficace per la modellizzazione della neovascolarizzazione. La CAM è una membrana extraembrionale riccamente vascolarizzata, che mostra una limitata immunoreattività, diventando così un eccellente modello di hosting per trapianti di cellule di origine umana.

Questo articolo descrive la strategia per innestare organoidi cerebrali umani differenziati a più stadi di maturazione nella CAM. La composizione cellulare degli organoidi cerebrali cambia nel tempo, riflettendo le pietre miliari dello sviluppo del cervello umano. Abbiamo innestato organoidi cerebrali nelle fasi di maturazione rilevanti: espansione neuroepiteliale (18 DIV), neurogenesi precoce (60 DIV) e gliogenesi precoce (180 DIV) nella CAM di embrioni di pollo del giorno embrionale (E)7. Gli organoidi cerebrali trapiantati sono stati raccolti 5 giorni dopo e le loro caratteristiche istologiche sono state analizzate.

Non sono stati rilevati segni istologici di neovascolarizzazione negli organoidi innestati o vasi sanguigni anomali adiacenti agli innesti. Inoltre, sono stati osservati notevoli cambiamenti nella composizione cellulare degli organoidi innestati, vale a dire, un aumento del numero di astrociti gliali fibrillari acidi positivi-reattivi. Tuttavia, i cambiamenti citoarchitettonici dipendevano dallo stadio di maturazione dell'organoide. Complessivamente, questi risultati suggeriscono che gli organoidi cerebrali possono crescere nella CAM e mostrano differenze nella citoarchitettura a seconda del loro stadio di maturazione all'innesto.

Introduzione

Gli organoidi cerebrali umani sono una tecnica emergente che ci permette di ricapitolare lo sviluppo precoce del cervello umano in vitro ^1,2,3. Tuttavia, uno dei principali limiti di questo modello è la mancanza di vascolarizzazione, che svolge ruoli indispensabili non solo nell'omeostasi cerebrale ma anche nello sviluppo cerebrale⁴. Oltre alla fornitura di ossigeno e sostanze nutritive, l'accumulo di prove suggerisce che il sistema vascolare del cervello regola la differenziazione neurale, la migrazione e la sinaptogenesi durante lo sviluppo ^5,6. Pertanto, c'è un urgente bisogno di stabilire modelli affidabili in grado di fornire la segnalazione vascolare mancante e la struttura agli organoidi cerebrali, migliorando la complessità della generazione di organoidi cerebrali umani⁷.

Tra i metodi proposti per la vascolarizzazione, si possono considerare due linee principali: l'innesto di organoidi in un organismo vivente e le tecnologie puramente in vitro che co-coltivano cellule endoteliali e cellule neurali 8,9,10,11,12. Il trapianto intracerebrale nei topi è costoso e richiede molto tempo, il che rende altre tecnologie rilevanti per modelli più semplici. Il test della membrana corioallantoica del pulcino (CAM) è stato ampiamente utilizzato per studiare l'angiogenesi 13,14,15. Nell'ultimo decennio, diversi gruppi hanno innestato con successo diversi tipi di organoidi, tra cui il rene^16,17, il cuore¹⁸ e gli organoidi tumorali^19,20, in CAM. Tuttavia, poco si sa sull'efficacia, la tossicità/rigetto, l'effetto fisiologico e i metodi per innestare organoidi cerebrali umani nella CAM. Un altro aspetto interessante e ancora inesplorato è la formazione di una barriera emato-encefalica chimerica (BBB) tra la CAM e l'interfaccia astrocitaria organoide. Precedenti lavori pionieristici hanno suggerito la fattibilità putativa della generazione di una BBB nella CAM mediante trapianto di astrociti e terreno condizionato da astrociti 21,22,23. Tuttavia, gli astrociti maturi sembrano non essere in grado di raggiungere questo^24,25. Pertanto, la formazione indotta dagli astrociti della BBB rimane discutibile e il trapianto di organoidi cerebrali umani ci permetterebbe di far luce su questa controversia.

Questo articolo video descrive un protocollo per un trapianto di organoidi cerebrali umani in OVO in CAM che promuove la crescita, il miglioramento e la vascolarizzazione, ottenendo organoidi che comprendono elementi BBB istologicamente compatibili. Qui, presentiamo un protocollo che garantisce la sopravvivenza dell'embrione di pollo e riportiamo la permissività della CAM per sostenere la crescita degli organoidi cerebrali.

Protocollo

Gli embrioni di pollo bianco livornese (Gallus gallus) sono stati trattati seguendo la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dell'Institute of Laboratory Animals Resources, Commission of Life Sciences, National Research Council, USA, e gli esperimenti sono stati approvati dal Council for Care and Use of Experiment Animals dell'Università di Barcellona.

1. Preparazione di organoidi cerebrali non guidati

1. Mantenere le cellule staminali embrionali umane (hESC) H9 in mTESR1 preriscaldate a temperatura ambiente (RT) sotto una confluenza del 70% in piastre a 6 pozzetti rivestite con Matrigel disciolto in DMEM (1:40) in un incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C.
   NOTA: Matrigel deve essere conservato in ghiaccio fino al suo utilizzo come rivestimento per prevenirne la polimerizzazione.
2. Generare organoidi cerebrali seguendo il protocollo cerebrale non guidato ².
   1. Dissociare le hESC H9 utilizzando 500 μL di soluzione di dissociazione cellulare e incubare per 3-5 minuti a 37 °C. Risospendere in mTESR1 contenente un inibitore ROCK Y27632 (concentrazione finale 50 μM) e seminare 9.000 cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti pretrattata a bassa adesione.
   2. Una volta che gli organoidi si sono aggregati in mTESR1 contenente un inibitore ROCK Y27632 (concentrazione finale 50 μM), trasferirli in mezzo di induzione per 5-6 giorni.
   3. Seguendo il protocollo²⁶ degli organoidi cerebrali non guidati, trasferire gli organoidi ai mezzi di induzione neurale a ~ giorni 4-5.
   4. Una volta acquisite le dimensioni e l'anello neuroepitelio, trasferiscili in una goccia di Matrigel ghiacciata. Una volta che il Matrigel è stato polimerizzato, trasferire gli organoidi in una capsula di Petri a bassa adesione di 5 cm con 5 ml di terreno di maturazione preriscaldato.
   5. Dopo 4 giorni, mettere gli organoidi cerebrali sotto agitazione orbitale.
3. Raccogliere gli organoidi per la raccolta in DPBS freschi immediatamente prima dell'innesto.

2. Mantenimento dell'uovo, attivazione dello sviluppo e puntura del guscio d'uovo

1. Conservare gli ovuli fecondati (al giorno 0) in un'incubatrice a 18 °C fino al momento dell'uso.
   NOTA: A questa temperatura non si sviluppano, rimanendo allo stesso stadio di maturazione.
2. Quando necessario per l'uso, incubarli a 38 °C e 60% di umidità relativa con rotazione a dondolo morbido con un angolo di 45 °C.
3. Il giorno 1, pulisci la superficie del guscio d'uovo con etanolo al 70% e asciugalo con un tovagliolo di carta per sterilizzarlo.
4. Posizionare una benda adesiva di carta chirurgica, di seguito denominata "benda", sopra l'uovo, coprendo la camera d'aria dell'uovo.
   NOTA: Ciò impedirà alla polvere del guscio d'uovo di cadere nel CAM dove si blocca.
5. Eseguire la perforazione della camera d'aria, di seguito denominata foro della camera d'aria (ACH), con un ago sterile da 21 G x 11/2'', perforando delicatamente il guscio d'uovo. Aprire l'ACH sulla punta superiore dell'uovo per evitare di disturbare il CAM, che a questo punto giace separato dal guscio.
6. Per trovare la posizione migliore per forare l'ACH, utilizzare una lampada per determinare la superficie più sottile del guscio d'uovo sulla punta superiore dell'uovo. La trasmissione diretta del fascio di luce indica la posizione migliore per forare.
7. Coprire l'ACH con una nuova benda per proteggere l'embrione dall'ambiente esterno e rimettere l'ovulo nell'incubatrice.
8. Da questo momento in poi, cessare la rotazione nell'incubatrice e mantenere le uova in posizione verticale con la finestra in alto.
   NOTA: Questo faciliterà lo sviluppo dell'embrione e il CAM diventa disponibile nella parte superiore con una camera d'aria tra l'embrione e il guscio dell'uovo, consentendo il successivo innesto.
9. Aprire l'ACH dal giorno 1 al giorno 4. La vitalità aumenta il giorno 4 (3 giorni prima del giorno dell'innesto).

3. Innesto di organoidi cerebrali

1. Eseguire l'innesto il giorno 7 quando la CAM è ben sviluppata e vascolarizzata, coprendo l'ovulo su tutto l'embrione.
2. Rimuovere la benda e pulire la superficie del guscio d'uovo con etanolo al 70% per sterilizzare il guscio d'uovo, prima di allargare con cura l'ACH in una finestra di innesto.
3. Posizionare una nuova benda più grande che copra l'estensione oltre la finestra di innesto finale per evitare che frammenti di guscio d'uovo cadano nel CAM durante l'allargamento della finestra di innesto.
   NOTA: Questa finestra più grande è necessaria per selezionare la migliore posizione di innesto e per il successivo innesto.
4. Ingrandire la finestra di innesto forando delicatamente il guscio d'uovo fino a raggiungere un diametro di circa 2 cm. Rimuovere delicatamente i bordi della finestra del guscio d'uovo con una pinzetta fino a quando la finestra non viene ingrandita. Rimuovere la polvere rimanente e i pezzi di guscio d'uovo che rimarranno attaccati alla benda staccando delicatamente la benda.
5. Posizionare l'organoide con una pipetta automatica P200. Tagliare le punte con forbici sterili e affilate per allargare l'apertura in base alle dimensioni dell'organoide e prevenire danni all'organoide o utilizzare punte sterili di trasferimento di ampio calibro. Raccogliere l'organoide in un volume massimo di 50 μL di PBS e trasferirlo direttamente nel CAM, su un lato opposto alla posizione dell'embrione.
6. Assicurarsi che la posizione dell'innesto sia distante dal tuorlo per evitarne la rottura durante la raccolta e, preferibilmente, posizionarlo vicino a un vaso sanguigno.
7. Posizionare una goccia di 7 μL di Matrigel intorno all'organoide dopo aver posizionato l'organoide sul CAM.
   NOTA: Ciò impedirà all'organoide di muoversi intorno alla membrana.
8. Chiudere la finestra utilizzando un piccolo pezzo di parafilm adatto alle dimensioni esatte della finestra e fissarlo al guscio con una benda adesiva.
   NOTA: È importante coprire completamente la finestra con il parafilm per evitare che l'embrione si secchi e consentire lo scambio di gas. Delimitare adeguatamente l'estensione della copertura della finestra, evitando di superare la finestra, in quanto potrebbe ostacolare lo scambio gassoso necessario per il corretto sviluppo dell'embrione²⁷.

4. Raccolta di organoidi trapiantati

1. Raccogliere gli organoidi innestati e il CAM circostante il 12° giorno di sviluppo del pollo, corrispondente a 38 Hamburger e Hamilton stadio di sviluppo (HH38)²⁸, 5 giorni dopo l'innesto. In questa fase, la CAM è completamente differenziata con la vascolarizzazione matura mentre i germi delle piume coprono le ali e la palpebra superiore dell'embrione.
2. Dopo aver rimosso la benda adesiva, allargare ulteriormente la finestra per facilitare la raccolta del campione utilizzando forbici e pinzette sottili.
3. Visualizzare l'organoide con l'aiuto di una microscopia di dissezione binoculare, se necessario, seguita da una fase di prefissazione di 2 minuti con paraformaldeide (PFA) al 4% per aiutare la raccolta di organoidi e CAM.
4. Raccogli una sezione di 1,5 cm² del CAM contenente l'organoide.
5. Fissaggio del campione
   1. Lavare i campioni con 1x PBS e fissarli con PFA al 4% (in PBS, pH 7,2) per 30 minuti a 4 °C. Quindi, lavare i campioni per 3 x 5 minuti in PBS.
   2. Conservare i campioni a 4 °C in PBS con azoturo di sodio o crioproteggerli direttamente in saccarosio-PBS al 30% per una notte a 4 °C.
   3. Dopo la crioprotezione, incorporare i campioni in un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) e conservarli a -20 °C fino al sezionamento. Tagliare fette di tessuto spesse 20 μm utilizzando un criostato e raccoglierle su vetrini xilanizzati. Conservare i vetrini a -20 °C fino a quando non vengono utilizzati per la colorazione.

5. Immunofluorescenza

1. Rimuovere l'OCT dalle sezioni con una soluzione PBS con Triton X-100 allo 0,1% (PBS-T) per 10 minuti a temperatura ambiente (RT).
2. Trattare le sezioni con una soluzione bloccante (BS) con una soluzione PBS-T 0,01% di siero d'asina al 2% e al 3% per 1 ora a RT.
3. Diluire l'anticorpo primario selezionato (vedere la tabella dei materiali) in BS e incubare i campioni per una notte a 4 °C.
4. Il giorno successivo, lavare i campioni 3 x 10 min in 1x PBS a RT.
5. Diluire l'anticorpo secondario in BS e incubare per 2 ore a RT (vedere la tabella dei materiali).
6. Incubare i campioni per 10 minuti con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per marcare i nuclei cellulari a RT, diluito in PBS-T a una diluizione 1:1.000.
7. Montare le guide con il mezzo di montaggio e coprire con vetrini coprioggetti.
8. Scatta tutte le immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza a campo largo a 2,5, 10, 20 e 40x.
9. Conservare le fette a 4 °C.

6. Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E)

NOTA: Per dimostrare che l'innesto ha funzionato, eseguire la colorazione H&E.

1. Rimuovere l'OCT con PBS-T 0,1% per 10 minuti a RT.
2. Eseguire la disidratazione seriale in cappa come segue: 10 min in acqua distillata (DW), 45 s in ematossilina, 1 min in DW, 20 s in PBS, 2 x 30 s in EtOH al 70%, 2 x 30 s in EtOH all'80%, 2 x 30 s in EtOH al 96%, 30 s in eosina, 2 x 15 s in EtOH al 96%, 2 x 15 s in 100% EtOH, 1 min in xilolo-100% ETOH, 1 min in xilolo, 1 min in xilolo (fresco).
3. Montare i vetrini coprioggetti con un mezzo di montaggio a base di xilene.

Risultati

Selezione del programma di maturazione dell'embrione per il trapianto
L'esperimento inizia a D0 quando le uova fecondate vengono incubate a 38 °C e al 60% di umidità relativa. La membrana corioallantoica (CAM) è una membrana extraembrionale altamente vascolarizzata che si sviluppa dopo l'incubazione dell'uovo. È formato dalla fusione dell'allantoide e del corion. A D1, dopo 24 ore di incubazione, la camera d'aria viene perforata per evitare che il CAM si attacchi alla membrana del guscio interno. ...

Discussione

In questo studio, descriviamo un protocollo dettagliato con numerosi passaggi chiave che forniscono una crescita e uno sviluppo favorevoli degli organoidi cerebrali umani dopo l'innesto senza perturbare la sopravvivenza degli embrioni di pollo. Si consiglia l'uso di aghi sterili per perforare la camera d'aria dell'uovo dopo 24 ore di incubazione (giorno 1). Inoltre, abbiamo anche provato a fare la puntura al giorno 4 (dopo aver controllato attraverso il guscio d'uovo con la luce per testare lo sviluppo della vascolarizza...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse	BioLegend	801201	1:1,000
Anti-GFAP, rabbit	GeneTex	GTX108711	1:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat.	Invitrogen	A-21206	1:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat	Jackson ImmunoResearch	715-585-150	1:500
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs	Granja Gibert (Cambrils, Spain)
DAPI	Invitrogen	D1306	1:10,000
DPX	Sigma	100579	xylene-based mounting medium
Gentle Dissociation Solution	CreativeBiolabs	ITS-0622-YT187	cell dissociation solution
Matrigel	BD Biosciences	356234
Mowiol 4-88 mounting media	Merk	81381
Paper towel, lab-grade	Sigma-Aldrich	Z188956
ROCK inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	10 nM
Sharp-Point Surgical Scissors	VWR	470106-340
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ