Frühe ungesteuerte neurovaskuläre Nischenmodellierung des menschlichen Gehirns in die permissive Chorioallantoismembran des Hühnerembryos

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um menschliche Gehirnorganoide in mehreren Reifungsstadien in die Chorioallantoismembran (CAM) des Kükens einzutransplantieren. Gehirnorganoide wurden nach ungesteuerten standardisierten Protokollen gezüchtet.

Zusammenfassung

Die Transplantation von Organoiden in vaskularisierte Gewebe von Modelltieren, wie z. B. der immundefizienten Chorioallantoismembran (CAM) von Maus- oder Hühnerembryonen, hat sich für die Modellierung der Neovaskularisation als effizient erwiesen. Die CAM ist eine reich vaskularisierte extraembryonale Membran, die eine begrenzte Immunreaktivität aufweist und somit zu einem hervorragenden Wirtsmodell für Zelltransplantationen menschlichen Ursprungs wird.

Diese Arbeit beschreibt die Strategie, menschliche Gehirnorganoide, die sich in mehreren Reifungsstadien differenziert haben, in die CAM zu transplantieren. Die zelluläre Zusammensetzung von Gehirnorganoiden ändert sich mit der Zeit und spiegelt die Meilensteine der menschlichen Gehirnentwicklung wider. Wir transplantierten Gehirnorganoide in relevanten Reifungsstadien: neuroepitheliale Expansion (18 DIV), frühe Neurogenese (60 DIV) und frühe Gliogenese (180 DIV) in das CAM von embryonalen Tag (E)7 Hühnerembryonen. Transplantierte Hirnorganoide wurden 5 Tage später entnommen und ihre histologischen Merkmale analysiert.

Es wurden keine histologischen Anzeichen einer Neovaskularisation in den transplantierten Organoiden oder abnormalen Blutgefäßen neben den Transplantaten festgestellt. Darüber hinaus wurden bemerkenswerte Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung der transplantierten Organoide beobachtet, nämlich eine Zunahme der Anzahl der sauren Gliaprotein-positiv-reaktiven Astrozyten. Die zytoarchitektonischen Veränderungen waren jedoch vom Organoid-Reifungsstadium abhängig. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Gehirnorganoide in der CAM wachsen können, und sie zeigen Unterschiede in der Zytoarchitektur in Abhängigkeit von ihrem Reifestadium bei der Transplantation.

Einleitung

Organoide des menschlichen Gehirns sind eine aufstrebende Technik, die es uns ermöglicht, die frühe Entwicklung des menschlichen Gehirns in vitro zu rekapitulieren ^1,2,3. Eine der größten Einschränkungen dieses Modells ist jedoch die fehlende Vaskularisierung, die nicht nur bei der Homöostase des Gehirns, sondern auch bei der Entwicklung des Gehirns eine unverzichtbare Rolle spielt⁴. Zusätzlich zur Zufuhr von Sauerstoff und Nährstoffen gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass das Gefäßsystem des Gehirns die neuronale Differenzierung, Migration....

Protokoll

Die Embryonen des Weißen Leghornhuhns (Gallus gallus) wurden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren des Institute of Laboratory Animals Resources, Commission of Life Sciences, National Research Council, USA, behandelt, und die Experimente wurden vom Council for Care and Use of Experimental Animals der Universität Barcelona genehmigt.

1. Ungesteuerte Präparation von Gehirnorganoiden

1. Halten Sie H9 humane embryonale Stammzellen (hESCs) in mTESR1, die bei Raumtemperatur (RT) unter einem Konfluenz von 70 % in 6-Well-Platten beschichtet sind, die mit in DMEM gelöstem Matrigel (1:40) b....

Diskussion

In dieser Studie beschreiben wir ein detailliertes Protokoll mit zahlreichen Schlüsselschritten, die ein günstiges Wachstum und eine günstige Entwicklung menschlicher Gehirnorganoide nach der Transplantation ermöglichen, ohne das Überleben der Hühnerembryonen zu beeinträchtigen. Wir empfahlen die Verwendung steriler Nadeln, um die Luftkammer des Eies nach 24 Stunden Inkubation (Tag 1) zu punktieren. Zusätzlich versuchten wir auch, die Punktion an Tag 4 durchzuführen (nachdem wir die Eierschale mit Licht überpr?.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse	BioLegend	801201	1:1,000
Anti-GFAP, rabbit	GeneTex	GTX108711	1:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat.	Invitrogen	A-21206	1:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat	Jackson ImmunoResearch	715-585-150	1:500
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs	Granja Gibert (Cambrils, Spain)
DAPI	Invitrogen	D1306	1:10,000
DPX	Sigma	100579	xylene-based mounting medium
Gentle Dissociation Solution	CreativeBiolabs	ITS-0622-YT187	cell dissociation solution
Matrigel	BD Biosciences	356234
Mowiol 4-88 mounting media	Merk	81381
Paper towel, lab-grade	Sigma-Aldrich	Z188956
ROCK inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	10 nM
Sharp-Point Surgical Scissors	VWR	470106-340
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ