Frühe ungesteuerte neurovaskuläre Nischenmodellierung des menschlichen Gehirns in die permissive Chorioallantoismembran des Hühnerembryos

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um menschliche Gehirnorganoide in mehreren Reifungsstadien in die Chorioallantoismembran (CAM) des Kükens einzutransplantieren. Gehirnorganoide wurden nach ungesteuerten standardisierten Protokollen gezüchtet.

Zusammenfassung

Die Transplantation von Organoiden in vaskularisierte Gewebe von Modelltieren, wie z. B. der immundefizienten Chorioallantoismembran (CAM) von Maus- oder Hühnerembryonen, hat sich für die Modellierung der Neovaskularisation als effizient erwiesen. Die CAM ist eine reich vaskularisierte extraembryonale Membran, die eine begrenzte Immunreaktivität aufweist und somit zu einem hervorragenden Wirtsmodell für Zelltransplantationen menschlichen Ursprungs wird.

Diese Arbeit beschreibt die Strategie, menschliche Gehirnorganoide, die sich in mehreren Reifungsstadien differenziert haben, in die CAM zu transplantieren. Die zelluläre Zusammensetzung von Gehirnorganoiden ändert sich mit der Zeit und spiegelt die Meilensteine der menschlichen Gehirnentwicklung wider. Wir transplantierten Gehirnorganoide in relevanten Reifungsstadien: neuroepitheliale Expansion (18 DIV), frühe Neurogenese (60 DIV) und frühe Gliogenese (180 DIV) in das CAM von embryonalen Tag (E)7 Hühnerembryonen. Transplantierte Hirnorganoide wurden 5 Tage später entnommen und ihre histologischen Merkmale analysiert.

Es wurden keine histologischen Anzeichen einer Neovaskularisation in den transplantierten Organoiden oder abnormalen Blutgefäßen neben den Transplantaten festgestellt. Darüber hinaus wurden bemerkenswerte Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung der transplantierten Organoide beobachtet, nämlich eine Zunahme der Anzahl der sauren Gliaprotein-positiv-reaktiven Astrozyten. Die zytoarchitektonischen Veränderungen waren jedoch vom Organoid-Reifungsstadium abhängig. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Gehirnorganoide in der CAM wachsen können, und sie zeigen Unterschiede in der Zytoarchitektur in Abhängigkeit von ihrem Reifestadium bei der Transplantation.

Einleitung

Organoide des menschlichen Gehirns sind eine aufstrebende Technik, die es uns ermöglicht, die frühe Entwicklung des menschlichen Gehirns in vitro zu rekapitulieren ^1,2,3. Eine der größten Einschränkungen dieses Modells ist jedoch die fehlende Vaskularisierung, die nicht nur bei der Homöostase des Gehirns, sondern auch bei der Entwicklung des Gehirns eine unverzichtbare Rolle spielt⁴. Zusätzlich zur Zufuhr von Sauerstoff und Nährstoffen gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass das Gefäßsystem des Gehirns die neuronale Differenzierung, Migration und Synaptogenese während der Entwicklung reguliert ^5,6. Daher ist es dringend erforderlich, zuverlässige Modelle zu etablieren, die die fehlende vaskuläre Signalübertragung und Struktur für Gehirnorganoide liefern können, was die Komplexität der Generation menschlicher Gehirnorganoide^{erhöht 7}.

Unter den vorgeschlagenen Methoden zur Vaskularisierung können zwei Hauptstromlinien in Betracht gezogen werden: die Organoid-Transplantation in einen lebenden Organismus und reine In-vitro-Technologien zur Kokultivierung von Endothelzellen und Nervenzellen 8,9,10,11,12. Die intrazerebrale Transplantation bei Mäusen ist kostspielig und zeitaufwändig, so dass andere Technologien für einfachere Modelle relevant sind. Der Chick Chorioallantoic Membran (CAM)-Assay wurde ausgiebig zur Untersuchung der Angiogenese^verwendet 13,14,15. In den letzten zehn Jahren haben mehrere Gruppen erfolgreich verschiedene Arten von Organoiden, darunter Nieren^16,17, Herz¹⁸ und Tumororganoide^19,20, in CAMs transplantiert. Dennoch ist wenig über die Wirksamkeit, Toxizität/Abstoßung, physiologische Wirkung und Methoden zur Transplantation menschlicher Gehirnorganoide in die CAM bekannt. Ein weiterer interessanter und noch unerforschter Aspekt ist die Bildung einer chimären Blut-Hirn-Schranke (BHS) zwischen der CAM und der organoiden astrozytischen Grenzfläche. Frühere Pionierarbeiten deuteten auf die mutmaßliche Machbarkeit der Erzeugung einer BHS in der CAM durch Transplantation von Astrozyten und Astrozyten-konditioniertem Medium^hin 21,22,23. Reife Astrozyten scheinen jedoch nicht in der Lage zu sein, dies zu erreichen^24,25. Daher bleibt die Astrozyten-induzierte Bildung der BHS umstritten, und die Transplantation menschlicher Gehirnorganoide würde es uns ermöglichen, Licht in diese Kontroverse zu bringen.

Dieser Videoartikel beschreibt ein Protokoll für eine In-Ovo-Organoidtransplantation des menschlichen Gehirns in CAM, die Wachstum, Verbesserung und Vaskularisierung fördert und zu Organoiden führt, die histologisch kompatible BHS-Elemente umfassen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das das Überleben des Hühnerembryos sicherstellt, und berichten über die Permissivität der CAM zur Aufrechterhaltung des Wachstums von Gehirnorganoiden.

Protokoll

Die Embryonen des Weißen Leghornhuhns (Gallus gallus) wurden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren des Institute of Laboratory Animals Resources, Commission of Life Sciences, National Research Council, USA, behandelt, und die Experimente wurden vom Council for Care and Use of Experimental Animals der Universität Barcelona genehmigt.

1. Ungesteuerte Präparation von Gehirnorganoiden

1. Halten Sie H9 humane embryonale Stammzellen (hESCs) in mTESR1, die bei Raumtemperatur (RT) unter einem Konfluenz von 70 % in 6-Well-Platten beschichtet sind, die mit in DMEM gelöstem Matrigel (1:40) beschichtet sind, in einem 5 % CO₂ -Inkubator bei 37 °C.
   HINWEIS: Matrigel muss bis zu seiner Verwendung als Beschichtung in Eis aufbewahrt werden, um seine Polymerisation zu verhindern.
2. Generieren Sie Gehirnorganoide nach dem ungesteuerten Gehirnprotokoll ².
   1. Dissoziieren Sie H9-hES-Zellen mit 500 μl der Zelldissoziationslösung und inkubieren Sie sie 3-5 Minuten lang bei 37 °C. Resuspendieren Sie in mTESR1 mit einem ROCK-Inhibitor Y27632 (Endkonzentration 50 μM) und säen Sie 9.000 Zellen pro Well in einer vorbehandelten 96-Well-Platte mit geringer Adhäsion aus.
   2. Sobald die Organoide in mTESR1 mit einem ROCK-Inhibitor Y27632 (Endkonzentration 50 μM) aggregiert sind, werden sie für 5-6 Tage in Induktionsmedium überführt.
   3. Übertragen Sie die Organoide nach dem ungesteuerten Gehirn-Organoid-Protokoll²⁶ an ~ Tagen 4-5 auf neuronale Induktionsmedien.
   4. Sobald sie die Größe und den Neuroepithelring angenommen haben, überführen Sie sie in einen eiskalten Matrigel-Tropfen. Sobald das Matrigel polymerisiert ist, werden die Organoide in eine 5 cm große, adhäsionsarme Petrischale mit 5 ml vorgewärmtem Reifungsmedium gegeben.
   5. Setzen Sie die Gehirnorganoide nach 4 Tagen unter orbitale Bewegung.
3. Sammeln Sie die Organoide für die Ernte in frischem DPBS unmittelbar vor dem Pfropfen.

2. Eierhaltung, Entwicklungsaktivierung und Eierschalenpunktion

1. Befruchtete Eier (am Tag 0) bis zur Verwendung in einem Inkubator bei 18 °C lagern.
   HINWEIS: Bei dieser Temperatur entwickeln sie sich nicht und bleiben im gleichen Reifestadium.
2. Bei Bedarf bei 38 °C und 60 % relativer Luftfeuchtigkeit mit sanfter Schaukelrotation in einem Winkel von 45 °C inkubieren.
3. Reinigen Sie an Tag 1 die Eierschalenoberfläche mit 70% Ethanol und trocknen Sie sie mit einem Papiertuch ab, um sie zu sterilisieren.
4. Legen Sie einen chirurgischen Papierklebeverband, im Folgenden als "Verband" bezeichnet, auf das Ei und bedecken Sie die Luftkammer des Eies.
   Anmerkungen: Dadurch wird verhindert, dass Staub von der Eierschale in das CAM fällt, wo er stecken bleibt.
5. Führen Sie die Luftkammerperforationspunktion, im Folgenden als Luftkammerloch (ACH) bezeichnet, mit einer sterilen Nadel 21 G x 11/2'' durch und stechen Sie die Eierschale sanft durch. Öffnen Sie den ACH an der oberen Spitze des Eies, um das CAM nicht zu stören, das an dieser Stelle von der Schale getrennt liegt.
6. Um die beste Position zum Durchstechen des ACH zu finden, verwenden Sie eine Lampe, um die dünnste Eierschalenoberfläche an der oberen Spitze des Eies zu bestimmen. Die direkte Lichtdurchlässigkeit zeigt die beste Position zum Bohren an.
7. Decken Sie den ACH mit einem neuen Verband ab, um den Embryo vor der äußeren Umgebung zu schützen, und legen Sie das Ei zurück in den Inkubator.
8. Beenden Sie von diesem Moment an die Rotation im Inkubator und halten Sie die Eier in vertikaler Position mit dem Fenster oben.
   HINWEIS: Dies erleichtert die Entwicklung des Embryos, und die CAM wird oben mit einer Luftkammer zwischen dem Embryo und der Eierschale verfügbar, was eine anschließende Transplantation ermöglicht.
9. Öffnen Sie das ACH von Tag 1 bis Tag 4. Die Lebensfähigkeit nimmt am Tag 4 (3 Tage vor dem Transplantationstag) zu.

3. Transplantation von Gehirnorganoiden

1. Führen Sie die Transplantation am 7. Tag durch, wenn die CAM gut entwickelt und vaskularisiert ist, und bedecken Sie die Eizelle über den gesamten Embryo.
2. Entfernen Sie den Verband und wischen Sie die Oberfläche der Eierschale mit 70% Ethanol ab, um die Eierschale zu sterilisieren, bevor Sie den ACH vorsichtig in ein Veredelungsfenster erweitern.
3. Legen Sie einen neuen, größeren Verband an, der die Verlängerung über das endgültige Pfropffenster hinaus abdeckt, um zu vermeiden, dass Eierschalenfragmente in das CAM fallen, während das Pfropffenster vergrößert wird.
   HINWEIS: Dieses größere Fenster wird benötigt, um die beste Pfropfposition auszuwählen und anschließend zu pfropfen.
4. Vergrößern Sie das Veredelungsfenster, indem Sie die Eierschale sanft durchstechen, bis das Fenster einen Durchmesser von ca. 2 cm erreicht. Entfernen Sie vorsichtig die Ränder des Eierschalenfensters mit einer Pinzette, bis das Fenster vergrößert ist. Entfernen Sie den restlichen Staub und die Eierschalenstücke, die am Verband haften, indem Sie den Verband vorsichtig abziehen.
5. Platzieren Sie das Organoid mit einer automatischen P200-Pipette. Schneiden Sie die Spitzen mit einer sterilen und scharfen Schere ab, um die Öffnung entsprechend der Größe des Organoids zu vergrößern und eine Beschädigung des Organoids zu vermeiden, oder verwenden Sie sterile Breitbandspitzen. Sammeln Sie das Organoid in einem maximalen Volumen von 50 μl PBS und übertragen Sie es direkt in das CAM auf einer Seite, die der Position des Embryos gegenüberliegt.
6. Stellen Sie sicher, dass die Position des Transplantats vom Eigelb entfernt ist, um einen Bruch während der Entnahme zu vermeiden, und legen Sie es vorzugsweise in die Nähe eines Blutgefäßes.
7. Geben Sie einen Tropfen von 7 μl Matrigel um das Organoid, nachdem Sie das Organoid auf das CAM gelegt haben.
   HINWEIS: Dadurch wird verhindert, dass sich das Organoid um die Membran bewegt.
8. Schließen Sie das Fenster mit einem kleinen Stück Parafilm, das genau auf die Größe des Fensters passt, und befestigen Sie es mit einem Klebeverband an der Schale.
   HINWEIS: Es ist wichtig, das Fenster vollständig mit dem Parafilm abzudecken, um ein Austrocknen des Embryos zu verhindern und gleichzeitig einen Gasaustausch zu ermöglichen. Die Ausdehnung der Fensterabdeckung ist richtig abzugrenzen und eine Überschreitung des Fensters zu vermeiden, da dies den notwendigen Gasaustausch für eine korrekte Embryonalentwicklung behindern könnte²⁷.

4. Transplantierte Organoid-Ernte

1. Ernten Sie die gepfropften Organoide und das umgebende CAM am Tag 12 der Hühnerentwicklung, entsprechend 38 Hamburger und Hamilton Entwicklungsstadium (HH38)²⁸, 5 Tage nach der Pfropfung. In diesem Stadium ist die CAM mit dem reifen Gefäßsystem vollständig differenziert, während die Federkeime sowohl die Flügel als auch das obere Augenlid des Embryos bedecken.
2. Vergrößern Sie nach dem Entfernen des Klebeverbandes das Fenster weiter, um die Probenentnahme mit einer Schere und einer feinen Pinzette zu erleichtern.
3. Visualisieren Sie das Organoid bei Bedarf mit Hilfe einer binokularen Dissektionsmikroskopie, gefolgt von einem 2-minütigen Präfixierungsschritt mit 4 % Paraformaldehyd (PFA), um die Organoid- und CAM-Ernte zu unterstützen.
4. Entnehmen Sie einen 1,5 cm² großen Abschnitt des CAM, der das Organoid enthält.
5. Probenfixierung
   1. Waschen Sie die Proben mit 1x PBS und fixieren Sie sie mit 4% PFA (in PBS, pH 7,2) für 30 min bei 4 °C. Waschen Sie die Proben dann 3 x 5 Minuten lang in PBS.
   2. Lagern Sie die Proben bei 4 °C in PBS mit Natriumazid oder kryokontieren Sie sie direkt in 30 % Saccharose-PBS über Nacht bei 4 °C.
   3. Betten Sie die Proben nach der Kryoprotektion in eine Verbindung mit optimaler Schneidtemperatur (OCT) ein und lagern Sie sie bis zum Schneiden bei -20 °C. Schneiden Sie 20 μm dicke Gewebescheiben mit einem Kryostaten und sammeln Sie sie auf xylanisierten Objektträgern. Lagern Sie die Objektträger bei -20 °C, bis sie zum Färben verwendet werden.

5. Immunfluoreszenz

1. OCT. mit einer PBS-Lösung mit 0,1% Triton X-100 (PBS-T) für 10 min bei Raumtemperatur (RT) aus den Schnitten entfernen.
2. Behandeln Sie die Schnitte mit einer Blockierungslösung (BS) mit einer 2% BSA, 3% Eselsserum PBS-T 0,01% Lösung für 1 h bei RT.
3. Verdünnen Sie den ausgewählten Primärantikörper (siehe Materialtabelle) in BS und inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 4 °C.
4. Am nächsten Tag waschen Sie die Proben 3 x 10 min in 1x PBS bei RT.
5. Verdünnen Sie den Sekundärantikörper in BS und inkubieren Sie ihn 2 h lang bei RT (siehe Materialtabelle).
6. Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), um die Zellkerne bei RT zu markieren, verdünnt in PBS-T in einer Verdünnung von 1:1.000.
7. Montieren Sie die Dias mit Montagemedium und decken Sie sie mit Glasabdeckgläsern ab.
8. Nehmen Sie alle Bilder mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop bei 2,5, 10, 20 und 40x auf.
9. Die Scheiben bei 4 °C lagern.

6. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H & E)

HINWEIS: Um zu beweisen, dass die Transplantation funktioniert hat, führen Sie eine H&E-Färbung durch.

1. OCT mit PBS-T 0,1% für 10 min bei RT entfernen.
2. Führen Sie die serielle Dehydratisierung in einer Haube wie folgt durch: 10 min in destilliertem Wasser (DW), 45 s in Hämatoxylin, 1 min in DW, 20 s in PBS, 2 x 30 s in 70 % EtOH, 2 x 30 s in 80 % EtOH, 2 x 30 s in 96 % EtOH, 30 s in Eosin, 2 x 15 s in 96 % EtOH, 2 x 15 s in 100% EtOH, 1 min in Xylol-100% ETOH, 1 min in Xylol, 1 min in Xylol (frisch).
3. Montieren Sie die Glasdeckgläser mit einem Eindeckmedium auf Xylolbasis.

Ergebnisse

Auswahl des Embryoreifungsplans für die Transplantation
Das Experiment beginnt bei D0, wenn befruchtete Eier bei 38 °C und 60 % relativer Luftfeuchtigkeit bebrütet werden. Die Chorioallantoismembran (CAM) ist eine stark vaskularisierte extraembryonale Membran, die sich nach der Inkubation von Eiern entwickelt. Es entsteht durch die Verschmelzung von Allantois und Chorion. Bei D1, nach 24 Stunden Inkubation, wird die Luftkammer punktiert, um zu verhindern, dass sich das CAM an der inneren Schalenmem...

Diskussion

In dieser Studie beschreiben wir ein detailliertes Protokoll mit zahlreichen Schlüsselschritten, die ein günstiges Wachstum und eine günstige Entwicklung menschlicher Gehirnorganoide nach der Transplantation ermöglichen, ohne das Überleben der Hühnerembryonen zu beeinträchtigen. Wir empfahlen die Verwendung steriler Nadeln, um die Luftkammer des Eies nach 24 Stunden Inkubation (Tag 1) zu punktieren. Zusätzlich versuchten wir auch, die Punktion an Tag 4 durchzuführen (nachdem wir die Eierschale mit Licht überpr?...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse	BioLegend	801201	1:1,000
Anti-GFAP, rabbit	GeneTex	GTX108711	1:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat.	Invitrogen	A-21206	1:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat	Jackson ImmunoResearch	715-585-150	1:500
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs	Granja Gibert (Cambrils, Spain)
DAPI	Invitrogen	D1306	1:10,000
DPX	Sigma	100579	xylene-based mounting medium
Gentle Dissociation Solution	CreativeBiolabs	ITS-0622-YT187	cell dissociation solution
Matrigel	BD Biosciences	356234
Mowiol 4-88 mounting media	Merk	81381
Paper towel, lab-grade	Sigma-Aldrich	Z188956
ROCK inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	10 nM
Sharp-Point Surgical Scissors	VWR	470106-340
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ