单层石墨烯在冷冻电子显微镜网格中的应用，用于高分辨率结构测定

摘要

在低温电子显微镜（cryoEM）网格中应用支撑层可以增加颗粒密度，限制与空气-水界面的相互作用，减少光束引起的运动，并改善颗粒取向的分布。本文描述了一种用单层石墨烯涂覆冷冻电镜网格以改进冷冻样品制备的稳健方案。

摘要

在低温电子显微镜（cryoEM）中，纯化的大分子被施加到带有多孔碳箔的网格上;然后将分子吸干以除去多余的液体，并迅速冻结在大约20-100nm厚的玻璃冰层中，悬浮在大约1μm宽的箔孔上。使用低温透射电子显微镜对所得样品进行成像，并使用合适的软件进行图像处理后，可以确定近原子分辨率的结构。尽管冷冻电镜已被广泛采用，但样品制备仍然是冷冻电镜工作流程中的一个严重瓶颈，用户经常遇到与样品在悬浮玻璃冰中表现不佳相关的挑战。最近，已经开发出用单个连续石墨烯层修改冷冻电镜网格的方法，石墨烯作为支撑表面，通常增加成像区域中的颗粒密度，并可以减少颗粒与空气-水界面之间的相互作用。在这里，我们提供了将石墨烯应用于冷冻电镜网格的详细方案，并用于快速评估所得网格的相对亲水性。此外，我们还描述了一种基于电磁的方法，通过可视化石墨烯的特征衍射图来确认石墨烯的存在。最后，我们通过使用相对低浓度的纯样品快速重建Cas9复合物的2.7 Å分辨率密度图，证明了这些石墨烯载体的实用性。

引言

单颗粒低温电子显微镜 （cryoEM） 已发展成为一种广泛使用的可视化生物大分子的方法¹。在直接电子检测^2、3、4、数据采集⁵ 和图像处理算法^{6、7、8、9、10} 的进步推动下，cryoEM 现在能够产生快速增长的大分子数量的近原子分辨率^{3D 结构 11}.此外，通过利用该方法的单分子性质，用户可以从单个样品12,13,14,15中确定多个结构，突出了使用生成的数据来理解异质结构集合^16,17

研究方案

1. CVD石墨烯的制备

1. 如下所述制备石墨烯蚀刻溶液。
   1. 将 4.6 g 过硫酸铵 （APS） 溶解在 50 mL 烧杯中的 20 mL 分子级水中，形成 1 M 溶液，并用铝箔覆盖。让 APS 在继续执行步骤 1.2 时完全溶解。
2. 制备一段用于甲基丙烯酸甲酯（MMA）涂层的CVD石墨烯。小心地切割一块正方形的CVD石墨烯。将方块转移到干净的培养皿中的盖玻片（50 mm x 24 mm）中，并在运输到旋涂机的过程中盖上盖子。
   注意：一个 18 mm x 18 mm 的正方形应该产生 25-36 个石墨烯涂层网格。

2. 用MMA涂覆CVD石墨烯

1. 将旋涂机设置设置为 60 秒高速旋，转速为 2,500 rpm。小心地将CVD石墨烯放在适当尺寸的卡盘上。
   注意：理想情况下，CVD石墨烯将在所选卡盘的边缘延伸1-2毫米，以防止MMA吸入真空系统。
2. 按下 Take/Absorb 按钮接合真空泵并将 CVD 石墨烯固定到卡盘上。将MMA涂抹在CVD石墨烯正方形的中心，盖上盖子，然后立即按 下开始/停止 按钮。对于 18 mm x 18 mm 见方的 CVD 石墨烯，40 μL MMA 就足够了。

结果

使用此处概述的设备（图1）和协议（图2）成功制造石墨烯涂层的冷冻电镜网格将导致覆盖箔孔的单层石墨烯，这可以通过其特征衍射图案来证实。为了促进蛋白质吸附到石墨烯表面，可以使用紫外线/臭氧处理通过安装含氧官能团来使表面具有亲水性。然而，空气中的碳氢化合物污染物可以在紫外线/臭氧处理后5分钟内吸附到石墨烯表面，并抵消这种?.......

讨论

冷冻电镜样品制备涉及许多技术挑战，大多数工作流程要求研究人员极其小心地手动操作易碎的网格，以避免损坏它们。此外，任何样品对玻璃化的适应性都是不可预测的;颗粒经常与空气-水界面或覆盖网格的固体支撑箔相互作用，这可能导致颗粒采用首选方向或无法进入成像孔，除非施加非常高的蛋白质浓度²⁴。用连续的单层石墨烯覆盖多孔的冷冻电镜网格在改善显微照片上的.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
250 mL beaker (3x)	Fisher	02-555-25B
50 mL beaker (2x)	Corning	1000-50
Acetone	Fisher	A949-4
Aluminum foil	Fisher	15-078-292
Ammonium persulfate	Fisher	(I17874
Coverslips 50 mm x 24 mm	Mattek	PCS-1.5-5024
CVD graphene	Graphene Supermarket	CVD-Cu-2x2
easiGlow discharger	Ted-Pella	91000S
Ethanol	Millipore-Sigma	1.11727
Flat-tip tweezers	Fisher	50-239-60
Glass cutter	Grainger	21UE26
Glass petri plate and cover	VWR	75845-544
Glass serological pipette	Fisher	13-676-34D
Grid Storage Case	EMS	71146-02
Hot plate	Fisher	07-770-108
Isopropanol	Sigma	W292907
Kimwipe	Fisher	06-666
Lab scissors	Fisher	13-806-2
Methyl-Methacrylate EL-6	Kayaku	MMA M310006 0500L1GL
Molecular grade water	Corning	46-000-CM
Negative action tweezers (2x)	Fisher	50-242-78
P20 pipette	Rainin	17014392
P200 pipette	Rainin	17008652
Parafilm	Fisher	13-374-12
Pipette tips	Rainin	30389291
Quantifoil grids with holey carbon	EMS	Q2100CR1
Spin coater	SetCas	KW-4A	with chuck SCA-19-23
Straightedge	ULINE	H-6560
Thermometer	Grainger	3LRD1
UV/Ozone cleaner	BioForce	SKU: PC440
Vacuum desiccator	Thomas Scientific	1159X11
Whatman paper	VWR	28297-216