Anwendung von Monolayer-Graphen auf Kryo-Elektronenmikroskopie-Gitter zur hochauflösenden Strukturbestimmung

Zusammenfassung

Die Anwendung von Trägerschichten auf kryogene Elektronenmikroskopie-Gitter (KryoEM) kann die Partikeldichte erhöhen, Wechselwirkungen mit der Luft-Wasser-Grenzfläche begrenzen, strahlinduzierte Bewegungen reduzieren und die Verteilung der Partikelorientierungen verbessern. In diesem Artikel wird ein robustes Protokoll für die Beschichtung von KryoEM-Gittern mit einer Monoschicht aus Graphen beschrieben, um die Vorbereitung von Kryoproben zu verbessern.

Zusammenfassung

Bei der kryogenen Elektronenmikroskopie (KryoEM) werden gereinigte Makromoleküle auf ein Gitter aufgebracht, das eine löchrige Kohlenstofffolie trägt. Die Moleküle werden dann getupft, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und schnell in einer etwa 20-100 nm dicken Schicht aus glasartigem Eis eingefroren, die über etwa 1 μm breite Folienlöcher schwebt. Die resultierende Probe wird mittels kryogener Transmissionselektronenmikroskopie abgebildet und nach der Bildverarbeitung mit geeigneter Software können nahezu atomar aufgelöste Strukturen bestimmt werden. Trotz der weit verbreiteten Akzeptanz der KryoEM bleibt die Probenvorbereitung ein schwerwiegender Engpass in den Arbeitsabläufen der KryoEM, wobei die Anwender oft auf Herausforderungen stoßen, die mit dem schlechten Verhalten von Proben im schwebenden Glaseis zusammenhängen. In jüngster Zeit wurden Methoden entwickelt, um KryoEM-Gitter mit einer einzigen kontinuierlichen Schicht aus Graphen zu modifizieren, die als Stützfläche fungiert, die oft die Partikeldichte im abgebildeten Bereich erhöht und Wechselwirkungen zwischen Partikeln und der Luft-Wasser-Grenzfläche reduzieren kann. Hier stellen wir detaillierte Protokolle für die Anwendung von Graphen auf KryoEM-Gitter und für die schnelle Bewertung der relativen Hydrophilie der resultierenden Gitter zur Verfügung. Darüber hinaus beschreiben wir eine EM-basierte Methode, um das Vorhandensein von Graphen zu bestätigen, indem wir sein charakteristisches Beugungsmuster visualisieren. Schließlich demonstrieren wir den Nutzen dieser Graphenträger, indem wir eine Dichtekarte mit einer Auflösung von 2,7 Å eines Cas9-Komplexes unter Verwendung einer reinen Probe in relativ niedriger Konzentration schnell rekonstruieren.

Einleitung

Die kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie (KryoEM) hat sich zu einer weit verbreiteten Methode zur Visualisierung biologischer Makromoleküle entwickelt¹. Angetrieben von Fortschritten bei der direkten Elektronendetektion ^2,3,4, der Datenerfassung⁵ und den Bildverarbeitungsalgorithmen ^6,7,8,9,10 ist die KryoEM nun in der Lage, 3D-Strukturen mit nahezu atomarer Auflösung einer schnell ....

Protokoll

1. Herstellung von CVD-Graphen

1. Bereiten Sie die Graphenätzlösung wie unten beschrieben vor.
   1. 4,6 g Ammoniumpersulfat (APS) in 20 ml Wasser in molekularer Qualität in einem 50-ml-Becherglas für eine 1-m-Lösung auflösen und mit Aluminiumfolie abdecken. Lassen Sie APS vollständig auflösen, während Sie mit Schritt 1.2 fortfahren.
2. Bereiten Sie einen Abschnitt CVD-Graphen für die Methylmethacrylat-Beschichtung (MMA) vor. Schneiden Sie vorsichtig einen quadratischen Abschnitt CVD-Graphen ab. Übertragen Sie das Quadrat in ein Deckglas (50 mm x 24 mm) in einer sauberen Petrischale und decken Sie es während des Transports z....

Diskussion

Die CryoEM-Probenvorbereitung bringt eine Vielzahl technischer Herausforderungen mit sich, wobei die meisten Arbeitsabläufe erfordern, dass Forscher zerbrechliche Gitter manuell mit äußerster Sorgfalt manipulieren, um sie nicht zu beschädigen. Darüber hinaus ist die Zugänglichkeit einer Probe für die Vitrifikation unvorhersehbar; Partikel interagieren häufig mit der Luft-Wasser-Grenzfläche oder mit der festen Trägerfolie, die die Gitter überlagert, was dazu führen kann, dass Partikel bevorzugte Orientierungen.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
250 mL beaker (3x)	Fisher	02-555-25B
50 mL beaker (2x)	Corning	1000-50
Acetone	Fisher	A949-4
Aluminum foil	Fisher	15-078-292
Ammonium persulfate	Fisher	(I17874
Coverslips 50 mm x 24 mm	Mattek	PCS-1.5-5024
CVD graphene	Graphene Supermarket	CVD-Cu-2x2
easiGlow discharger	Ted-Pella	91000S
Ethanol	Millipore-Sigma	1.11727
Flat-tip tweezers	Fisher	50-239-60
Glass cutter	Grainger	21UE26
Glass petri plate and cover	VWR	75845-544
Glass serological pipette	Fisher	13-676-34D
Grid Storage Case	EMS	71146-02
Hot plate	Fisher	07-770-108
Isopropanol	Sigma	W292907
Kimwipe	Fisher	06-666
Lab scissors	Fisher	13-806-2
Methyl-Methacrylate EL-6	Kayaku	MMA M310006 0500L1GL
Molecular grade water	Corning	46-000-CM
Negative action tweezers (2x)	Fisher	50-242-78
P20 pipette	Rainin	17014392
P200 pipette	Rainin	17008652
Parafilm	Fisher	13-374-12
Pipette tips	Rainin	30389291
Quantifoil grids with holey carbon	EMS	Q2100CR1
Spin coater	SetCas	KW-4A	with chuck SCA-19-23
Straightedge	ULINE	H-6560
Thermometer	Grainger	3LRD1
UV/Ozone cleaner	BioForce	SKU: PC440
Vacuum desiccator	Thomas Scientific	1159X11
Whatman paper	VWR	28297-216