Применение монослойного графена в решетках криоэлектронной микроскопии для определения структуры с высоким разрешением

Резюме

Применение опорных слоев к сеткам криогенной электронной микроскопии (криоЭМ) может увеличить плотность частиц, ограничить взаимодействие с границей раздела воздух-вода, уменьшить движение, индуцированное лучом, и улучшить распределение ориентаций частиц. В данной работе описан надежный протокол покрытия криоЭМ-решеток монослоем графена для улучшения подготовки криообразцов.

Аннотация

В криогенной электронной микроскопии (криоЭМ) очищенные макромолекулы наносятся на сетку, несущую дырявую углеродную фольгу; Затем молекулы промокают, чтобы удалить лишнюю жидкость, и быстро замораживают в слое стекловидного льда толщиной примерно 20-100 нм, взвешенном в отверстиях фольги шириной примерно 1 мкм. Полученный образец получают с помощью криогенной просвечивающей электронной микроскопии, а после обработки изображения с помощью соответствующего программного обеспечения можно определить структуры с близким к атомному разрешению. Несмотря на широкое распространение криоЭМ, подготовка образцов остается серьезным узким местом в рабочих процессах криоЭМ, и пользователи часто сталкиваются с проблемами, связанными с плохим поведением образцов во взвешенном стекловидном льду. В последнее время были разработаны методы модификации криоЭМ-сеток с помощью одного непрерывного слоя графена, который действует как опорная поверхность, часто увеличивающая плотность частиц в изображаемой области и может уменьшить взаимодействие между частицами и границей раздела воздух-вода. Здесь мы приводим подробные протоколы для нанесения графена на криоЭМ-решетки и для быстрой оценки относительной гидрофильности полученных сеток. Кроме того, мы описываем метод на основе ЭМ для подтверждения присутствия графена путем визуализации его характерной дифракционной картины. Наконец, мы демонстрируем полезность этих графеновых носителей, быстро реконструируя карту плотности с разрешением 2,7 Å комплекса Cas9 с использованием чистого образца при относительно низкой концентрации.

Введение

Криогенная электронная микроскопия одиночных частиц (криоЭМ) превратилась в широко используемый метод визуализации биологических макромолекул¹. Благодаря достижениям в области прямого обнаружения электронов ^2,3,4, сбора данных⁵ и алгоритмов обработки изображений ^6,7,8,9,10, cryoEM теперь способна создавать 3D-структуры с близким к атомному разрешением быстро растущего числа макромолекул

протокол

1. Приготовление графена CVD

1. Приготовьте раствор для травления графена, как описано ниже.
   1. Растворите 4,6 г персульфата аммония (APS) в 20 мл молекулярной воды в стакане объемом 50 мл для раствора 1 М и накройте алюминиевой фольгой. Дайте APS полностью раствориться, переходя к шагу 1.2.
2. Подготовьте участок графена CVD для покрытия метилметакрилатом (ММА). Аккуратно вырежьте квадратный срез CVD графена. Перенесите квадрат на покровный лист (50 мм x 24 мм) в чистую чашку Петри и накройте крышкой во время транспортировки в машину для нанесения покрытий.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Квадрат размером 18 мм x 18 мм должен дать 25-36 ....

Результаты

Успешное изготовление криоЭМ сеток с графеновым покрытием с использованием оборудования (рис. 1) и протокола (рис. 2), описанных здесь, приведет к появлению монослоя графена, покрывающего отверстия фольги, что может быть подтверждено его характерной дифра.......

Обсуждение

Подготовка образцов для криоЭМ сопряжена с множеством технических проблем, при этом большинство рабочих процессов требуют от исследователей ручных манипуляций с хрупкими сетками с особой осторожностью, чтобы не повредить их. Кроме того, восприимчивость любого образца к витрификации .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
250 mL beaker (3x)	Fisher	02-555-25B
50 mL beaker (2x)	Corning	1000-50
Acetone	Fisher	A949-4
Aluminum foil	Fisher	15-078-292
Ammonium persulfate	Fisher	(I17874
Coverslips 50 mm x 24 mm	Mattek	PCS-1.5-5024
CVD graphene	Graphene Supermarket	CVD-Cu-2x2
easiGlow discharger	Ted-Pella	91000S
Ethanol	Millipore-Sigma	1.11727
Flat-tip tweezers	Fisher	50-239-60
Glass cutter	Grainger	21UE26
Glass petri plate and cover	VWR	75845-544
Glass serological pipette	Fisher	13-676-34D
Grid Storage Case	EMS	71146-02
Hot plate	Fisher	07-770-108
Isopropanol	Sigma	W292907
Kimwipe	Fisher	06-666
Lab scissors	Fisher	13-806-2
Methyl-Methacrylate EL-6	Kayaku	MMA M310006 0500L1GL
Molecular grade water	Corning	46-000-CM
Negative action tweezers (2x)	Fisher	50-242-78
P20 pipette	Rainin	17014392
P200 pipette	Rainin	17008652
Parafilm	Fisher	13-374-12
Pipette tips	Rainin	30389291
Quantifoil grids with holey carbon	EMS	Q2100CR1
Spin coater	SetCas	KW-4A	with chuck SCA-19-23
Straightedge	ULINE	H-6560
Thermometer	Grainger	3LRD1
UV/Ozone cleaner	BioForce	SKU: PC440
Vacuum desiccator	Thomas Scientific	1159X11
Whatman paper	VWR	28297-216