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요약

극저온 전자 현미경(cryoEM) 그리드에 지지층을 적용하면 입자 밀도를 높이고, 공기-물 계면과의 상호 작용을 제한하고, 빔 유도 동작을 줄이고, 입자 배향 분포를 개선할 수 있습니다. 이 백서에서는 cryoEM 그리드를 그래핀 단층으로 코팅하여 cryo-sample 전처리를 개선하기 위한 강력한 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

극저온 전자 현미경(cryoEM)에서 정제된 거대분자는 구멍이 있는 탄소박이 있는 그리드에 적용됩니다. 그런 다음 분자를 블롯트하여 과도한 액체를 제거하고 약 20-100nm 두께의 유리질 얼음 층에서 약 1μm 너비의 호일 구멍에 부유하여 빠르게 동결합니다. 결과 샘플은 극저온 투과 전자 현미경을 사용하여 이미지화되고 적절한 소프트웨어를 사용하여 이미지 처리 후 거의 원자 분해능 구조를 결정할 수 있습니다. CryoEM이 널리 채택되었음에도 불구하고 시료 전처리는 CryoEM 워크플로우에서 여전히 심각한 병목 현상을 겪고 있으며, 사용자는 부유 유리체 얼음에서 시료가 제대로 작동하지 않는 것과 관련된 문제에 자주 직면합니다. 최근에는 그래핀의 단일 연속 층으로 CryoEM 그리드를 수정하는 방법이 개발되었으며, 그래핀은 종종 이미징 영역의 입자 밀도를 증가시키고 입자와 공기-물 계면 간의 상호 작용을 줄일 수 있는 지지 표면 역할을 합니다. 여기에서는 CryoEM 그리드에 그래핀을 적용하고 결과 그리드의 상대적 친수성을 신속하게 평가하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 또한 특징적인 회절 패턴을 시각화하여 그래핀의 존재를 확인하는 EM 기반 방법을 설명합니다. 마지막으로, 상대적으로 낮은 농도의 순수 샘플을 사용하여 Cas9 복합체의 2.7 Å 분해능 밀도 맵을 신속하게 재구성하여 이러한 그래핀 지지체의 유용성을 입증합니다.

서문

단일 입자 극저온 전자 현미경(cryoEM)은 생물학적 거대분자를 시각화하는 데 널리 사용되는 방법으로 발전했습니다1. 직접 전자 검출 2,3,4, 데이터 수집5 및 이미지 처리 알고리즘 6,7,8,9,10의 발전에 힘입어 CryoEM은 이제 빠르게 증가하는 거대분자11의 원자 분해능에 가까운 3D 구조를 생성할 수 있습니다. 더욱이, 접근법의 단일 분자 특성을 활용함으로써, 사용자는 단일 샘플 12,13,14,15로부터 여러 구조를 결정할 수 있으며, 이는 이종 구조 앙상블을 이해하기 위해 생성된 데이터를 사용할 수 있는 가능성을 강조합니다(16,17). 이러한 진전에도 불구하고 극저온 시료 그리드 준비의 병목 현상은 지속되고 있습니다.

CryoEM에 의한 구조적 특성 분석을 위해 생물학적 시료는 수용액에 잘 분산된 다음 유리화18,19라는 공정을 통해 급속 동결되어야 합니다. 목표는 일반적으로 비정질 탄소 층으로 절단되는 규칙적인 간격의 구멍에 부유하는 유리화된 얼음의 균일하게 얇은 층에서 입자를 포착하는 것입니다. 이 패턴이 있는 비정질 탄소 호일은 구리 또는 금 지지대 메쉬가 있는 TEM 그리드에 의해 지지됩니다. 표준 워크플로우에서 그리드는 시료를 적용하기 전에 글로우 방전 플라즈마 처리를 사용하여 친수성으로 렌더링됩니다. 과도한 액체는 여과지로 블링되어 단백질 용액이 플런지 동결 중에 쉽게 유리화될 수 있는 구멍을 가로질러 얇은 액체 막을 형성할 수 있습니다. 일반적인 과제는 공기-물 계면(AWI)에 대한 입자 국소화 및 후속 변성(20,21,22) 또는 바람직한 방향(23,24,25)의 채택, 구멍으로 이동하지 않고 탄소박에 입자가 부착되는 것, 구멍(26) 내의 입자의 클러스터링 및 응집을 포함한다 . 불균일한 얼음 두께는 또 다른 문제입니다. 두꺼운 얼음은 전자 산란의 증가로 인해 현미경 사진에서 더 높은 수준의 배경 잡음을 초래할 수 있는 반면, 극도로 얇은 얼음은 더 큰 입자를 배제할 수 있다27.

이러한 문제를 해결하기 위해 다양한 박막 지지 필름을 사용하여 그리드 표면을 코팅하여 입자가 이러한 지지체에 놓일 수 있도록 하고 이상적으로는 공기-물 계면과의 상호 작용을 피할 수 있습니다. 그래핀 지지체는 부분적으로는 지지층(28)에 의해 추가되는 배경 신호를 감소시키는 그들의 최소 산란 단면과 결합된 높은 기계적 강도 때문에 큰 가능성을 보여주었다. 배경 잡음에 대한 기여를 최소화하는 것 외에도, 그래핀은 또한 현저한 전기 및 열 전도성을 나타낸다29. 그래핀 및 그래핀 산화물 코팅 그리드는 더 높은 입자 밀도, 더 균일한 입자 분포(30) 및 AWI22에 대한 국소화 감소를 생성하는 것으로 나타났습니다. 또한, 그래핀은 다음과 같이 추가로 변형될 수 있는 지지면을 제공한다: 1) 기능화(31,32,33)를 통해 격자 표면의 물리화학적 특성을 조정하고; 또는 2) 관심 단백질의 친화성 정제를 촉진하는 커플 연결제 34,35,36.

이 기사에서는 CryoEM 그리드를 그래핀30의 단일 균일한 층으로 코팅하는 기존 절차를 수정했습니다. 이러한 수정은 수율과 재현성을 높이는 것을 목표로 프로토콜 전반에 걸쳐 그리드 처리를 최소화하는 것을 목표로 합니다. 또한 플런지 전에 그리드를 친수성으로 렌더링하는 다양한 UV/오존 처리의 효능을 평가하기 위한 접근 방식에 대해 논의합니다. 그래핀 코팅 그리드를 사용한 CryoEM 시료 전처리의 이 단계는 매우 중요하며, 결과 그리드의 상대적 친수성을 정량화하는 간단한 방법이 유용하다는 것을 알게 되었습니다. 이 프로토콜을 사용하여 가이드 RNA 및 표적 DNA와 복합체에서 촉매적으로 비활성 S. pyogenes Cas9의 고해상도 3D 재구성을 생성하여 구조 결정을 위해 그래핀 코팅 그리드를 사용하는 유용성을 입증합니다.

프로토콜

1. CVD 그래핀의 제조

  1. 아래와 같이 그래핀 에칭 용액을 준비한다.
    1. 4.6g의 과황산암모늄(APS)을 1M 용액용 50mL 비커에 있는 분자 등급 물 20mL에 녹이고 알루미늄 호일로 덮습니다. 1.2단계를 진행하는 동안 APS가 완전히 용해되도록 합니다.
  2. 메틸 메타크릴레이트(MMA) 코팅을 위한 CVD 그래핀 절편을 준비합니다. CVD 그래핀의 정사각형 부분을 조심스럽게 자릅니다. 깨끗한 페트리 접시 안에 있는 커버슬립(50mm x 24mm)에 사각형을 옮기고 스핀 코터로 운반하는 동안 덮습니다.
    알림: 18mm x 18mm 정사각형은 25-36개의 그래핀 코팅 그리드를 생성해야 합니다.

2. CVD 그래핀에 MMA 코팅

  1. 스핀 코터 설정을 60rpm에서 2,500초 고속 스핀으로 설정합니다. CVD 그래핀을 적절한 크기의 척에 조심스럽게 놓습니다.
    참고: 이상적으로는 CVD 그래핀이 선택한 척의 가장자리 위로 1-2mm 확장되어 진공 시스템으로의 MMA 흡인을 방지합니다.
  2. Take/Absorb 버튼을 눌러 진공 펌프를 결합하고 CVD 그래핀을 척에 부착합니다. CVD 그래핀 사각형의 중앙에 MMA를 도포하고 뚜껑을 닫은 후 바로 Start/Stop 버튼을 누릅니다. 18mm x 18mm 정사각형의 CVD 그래핀의 경우 40μL의 MMA면 충분합니다.
  3. 회전이 멈추면 진공 펌프를 해제하고 핀셋으로 MMA 코팅된 CVD 그래핀을 조심스럽게 회수합니다. MMA 코팅면이 아래를 향하도록 CVD 그래핀을 뒤집어 유리 커버슬립에 다시 놓습니다.

3. 그래핀 뒷면의 플라즈마 에칭

  1. 커버슬립의 CVD 그래핀을 글로우 디데스터로 옮기고 플랫 팁 핀셋을 사용하여 25mA에서 30초 동안 글로우 방전을 수행합니다.
  2. 커버슬립의 CVD 그래핀을 페트리 접시에 다시 넣고 구리 에칭 영역으로 운반하는 동안 커버합니다. MMA 코팅은 플라즈마 에칭으로부터 상부 그래핀 층을 보호합니다.

4. 격자 크기의 MMA 코팅 CVD 그래핀 사각형 절단

  1. 두 쌍의 핀셋을 사용하여 CVD 그래핀 사각형을 지지합니다. CVD 그래핀 사각형의 방향에 유의하고 핀셋에 부착한 상태에서 MMA 쪽을 위로 유지하십시오(CRITICAL).
  2. CVD 그래핀을 약 3mm x 3mm 정사각형으로 자릅니다. 이 단계에서 두 세트의 역작용 집게를 사용하여 CVD 그래핀 정사각형을 오른쪽이 위로 향하게 잡고 제자리에 고정하고 3mm x 3mm 정사각형의 가장자리를 나머지 정사각형에서 잘라낸 후 고정합니다.

5. MMA 코팅 CVD 그래핀에서 구리 기판 용해

  1. APS 용액에 각 3mm x 3mm 정사각형을 조심스럽게 띄웁니다. 각 사각형을 해제하기 전에 APS 용액의 표면과 접촉하십시오. 각 사각형이 얕은 각도로 용액에 놓일 수 있도록 비커를 기울입니다. 이렇게 하면 사각형이 가라앉지 않습니다.
  2. 알루미늄 호일로 비커를 덮고 25°C에서 밤새 배양합니다.

6. APS에서 MMA/그래핀 필름 제거

  1. 크기가 12mm x 50mm인 유리 커버슬립을 사용하고 커버슬립을 APS에 수직으로 부드럽게 넣은 다음 커버슬립을 측면으로 움직여 떠 있는 MMA/그래핀 정사각형에 맞닿도록 하여 APS에서 MMA/그래핀 사각형을 추출합니다.
  2. 커버슬립을 조심스럽게 제거하고 제거 시 사각형이 커버슬립 측면에 완전히 부착되었는지 확인합니다.
  3. MMA/그래핀 사각형을 분자 등급의 물로 채워진 깨끗한 50mL 비커에 20분 동안 옮깁니다. MMA/그래핀 사각형이 부착된 커버슬립을 수직으로 물에 부드럽게 담그고 사각형이 수면과 상호 작용할 때 커버슬립에서 빠지도록 합니다. 모든 MMA/그래핀 사각형에 대해 반복합니다.

7. 그래핀을 그리드에 부착

  1. 네거티브 액션 핀셋을 사용하여 탄소 면이 떠 있는 MMA/그래핀 사각형을 향하도록 그리드를 물에 수직으로 부드럽게 담그십시오. 사각형과 접촉하면 그리드를 조심스럽게 제거하고 제거 시 사각형이 그리드의 탄소 쪽에 완전히 부착되었는지 확인합니다. 그리드 사각형이 손상되는 것을 방지하기 위해 물에 잠겼을 때 그리드의 측면 이동을 최소화합니다(CRITICAL).
  2. 깨끗한 커버슬립 MMA/그래핀 면이 위로 향하게 하여 그리드를 놓고 1-2분 동안 자연 건조시킵니다. 플랫 팁 핀셋을 사용하여 커버슬립 그래핀/MMA 코팅 그리드를 130°C로 설정된 핫 플레이트로 옮깁니다.
  3. 유리 페트리 접시의 상단으로 덮고 20분 동안 배양합니다. 불을 끄고 실온으로 1-2분 동안 식힙니다.
    주의 : 페트리 접시 상단이 매우 뜨거울 수 있으므로 주의하십시오.

8. 아세톤으로 MMA 용해

  1. 커버슬립 전체를 15mL의 아세톤으로 채워진 페트리 접시에 옮깁니다. 30분 동안 배양합니다.
  2. 깨끗한 유리 혈청학 피펫을 사용하여 그리드가 배양 된 아세톤을 폐기물 용기로 옮깁니다. 깨끗한 유리 혈청학적 피펫을 사용하여 페트리 접시에 신선한 아세톤 15mL를 조심스럽게 추가합니다. 30분 동안 배양합니다.
  3. 이 세척 단계를 반복하여 총 3번의 아세톤 세척을 반복합니다.

9. 이소프로판올로 잔류 아세톤 제거

  1. 아세톤을 3회 세척한 후 아세톤을 제거하고 깨끗한 유리 혈청학적 피펫을 사용하여 15mL의 이소프로판올로 교체합니다. 20분 동안 배양합니다.
  2. 총 4회 이소프로판올 세척을 위해 3회를 반복합니다. 이소프로판올에서 그리드를 조심스럽게 제거하고 핀셋을 사용하여 깨끗한 커버슬립에서 자연 건조합니다.
    알림: 잔류 이소프로판올은 핀셋에서 그리드를 분리하기 어렵게 만들 수 있습니다. 핀셋에서 그리드를 풀기 전에 그리드와 깨끗한 커버슬립을 접촉하면 이 문제를 완화할 수 있습니다.
  3. 그래핀 코팅 그리드가 있는 커버슬립을 10분 동안 100°C로 설정된 핫플레이트에 옮겨 잔류 유기물을 증발시킵니다. 실온으로 식히고 사용할 때까지 진공 상태에서 보관하십시오.

10. 그래핀 코팅 그리드의 UV/오존 처리

  1. 역작용 핀셋을 사용하여 그래핀으로 코팅된 면이 위를 향하도록 하여 UV/오존 클리너의 깨끗한 조명 영역에 그리드를 부드럽게 놓습니다.
  2. 조명 영역을 닫고 기기를 켭니다. 타임 다이얼을 지정된 처리 시간으로 돌려 그리드 UV/오존 처리를 시작합니다..
    알림: 처리 기간은 조정 가능한 매개변수이며 과도한 처리는 그리드를 손상시킬 가능성이 있습니다. Han et al.30 은 10분의 UV/오존 처리를 권장하며, 10분 처리로도 충분하다는 것을 발견했습니다. 이 치료 시간 조정에 대한 지침은 12단계를 참조하십시오.
  3. Koh et al.37에 설명된 플런지 단계에 따라 처리된 그리드에 CryoEM 샘플을 직접 플런징합니다.
    알림: 대기 탄화수소는 UV/오존 처리 후 그리드 표면에 축적되어 그래핀 표면38,39의 소수성을 증가시킬 수 있습니다. 이를 방지하려면 UV/오존 처리된 그리드를 즉시 플런지하십시오. UV/오존 처리 그리드를 배치로 처리하는 것이 유리할 수 있는데, 예를 들어, UV/오존은 6개의 그리드를 처리하고 그 6개의 그리드를 즉시 플런징한 다음, UV/오존은 그리드의 두 번째 배치를 처리한 후 두 번째 배치를 플런징합니다.

11. 회절 이미지 캡처

  1. 평행 조명이 설정된 상태에서 현미경이 잘 조정되었는지 확인하고 최종 디포커스를 -0.2μm로 설정합니다.
  2. 형광등을 삽입하면 빔이 완전히 멈춥니다. 회절 모드로 들어가 회절 지점을 명확하게 시각화합니다.
  3. CCD 카메라를 사용하여 이미지를 획득하고 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 평가합니다.
    참고: 그래핀 단층에 의해 생성된 가장 쉽게 관찰되고 식별 가능한 회절 스폿은 2.13Å의 공간 주파수에 해당하는 6개의 스폿입니다. 측정 도구를 사용하여 회절된 빔의 중심에서 이러한 회절 지점 중 하나까지의 거리를 역수 단위로 추정합니다. 특히 2.13 Å figure-protocol-4758 0.47 Å-1.

12. 그리드 친수성 평가

  1. 이미징 설정을 준비합니다. 휴대폰 스탠드, 탁상용 이미징 표면, 카메라가 있는 휴대폰, 유리 커버슬립 및 파라핀 필름을 찾습니다. 여기에 표시된 이미지는 제공된 .stl 파일을 사용하여 3D 프린팅된 휴대폰 스탠드 및 탁상용 이미징 표면을 사용하여 얻은 것이므로 보다 쉽게 재현 가능하고 정량화할 수 있는 접촉각 측정이 가능합니다(보충 그림 1A).
  2. 유리 커버슬립을 평평한 표면에 놓은 다음 1cm x 1cm 정사각형의 파라핀 필름을 잘라 유리 커버슬립 위에 놓습니다. 전화기를 전화기 스탠드에 놓고 카메라가 유리 커버슬립과 면이 맞도록 전화기 방향을 맞춥니다. 고무 밴드를 사용하여 이 위치에서 전화기를 고정합니다(보충 그림 1B). 샘플 사진을 찍어 카메라가 이미징 표면과 정렬되었는지 확인합니다.
  3. 그래핀 코팅 그리드의 UV/오존 처리 직후 유리 커버슬립의 파라핀 필름 사각형에 단일 그리드를 놓습니다. 그래핀 면이 위쪽을 향하도록 합니다. 피펫으로 격자 표면 중앙에 2μL의 물방울을 추가하고 즉시 사진을 찍습니다.
    알림: 다음 후에 이 단계를 반복합니다: i) 충분한 처리 기간을 결정하기 위해 원하는 UV/오존 처리 간격; 또는 ii) UV/오존 처리 후 원하는 시간 간격으로 처리 후 그리드 표면이 친수성 특성을 유지하는 기간을 측정합니다.
  4. 사진을 ImageJ43 으로 가져오고 접촉각 플러그인을 사용하여 사진의 접촉각을 계산합니다.

13. dCas9 복합 데이터 세트의 단일 입자 분석

참고: 이 프로토콜에 설명된 모든 이미지 처리는 cryoSPARC 버전 4.2.1을 사용하여 수행되었습니다.

  1. Patch Motion Correction 및 Patch CTF Estimation 작업을 사용하여 동영상을 사전 처리합니다. 직경이 115 Å에서 135 Å 사이인 구형 블롭을 사용하여 블롭 선택기 작업을 사용하여 입자 피킹을 수행합니다.
  2. 현미경 사진에서 추출 작업을 사용하여 입자를 추출하고, 정규화된 상관 계수(NCC) 및 검정력 임계값을 사용하여 현미경 사진당 약 200-300개의 입자를 생성합니다. 적절한 임계값과 그에 따른 입자 수는 다를 수 있으며, 사용자는 적절한 조건을 식별하기 위해 다양한 현미경 사진에서 피킹 품질을 검사해야 합니다.
  3. Ab-initio 재구성 작업을 사용하여 다중 클래스 초기 재구성을 수행하며, 세 개의 클래스가 필요합니다. 세 가지 클래스 중 두 가지에는 표면 오염 물질을 포함하여 Cas9이 아닌 입자가 포함될 가능성이 높습니다. 추가 처리를 위해 dCas9와 유사한 클래스를 선택합니다.
    참고: 파티클 스택을 더욱 미세 조정하기 위해 다중 클래스 Ab-initio 재구성 또는 이종 미세 조정의 추가 라운드를 적용할 수 있습니다.
  4. 기본 매개변수를 선택한 Non-uniform Refinement 작업을 사용하여 3D 미세 조정을 수행합니다. 검증(FSC) 및 ThreeDFSC 작업을 사용하여 최종 3D 미세 조정의 맵과 마스크를 사용하여 재구성의 해상도를 추정합니다.

결과

여기에 설명된 장비(그림 1)와 프로토콜(그림 2)을 사용하여 그래핀 코팅 CryoEM 그리드를 성공적으로 제작하면 호일 구멍을 덮는 그래핀 단층이 생성되며, 이는 특징적인 회절 패턴으로 확인할 수 있습니다. 그래핀 표면에 대한 단백질 흡착을 촉진하기 위해 UV/오존 처리를 사용하여 산소 함유 작용기를 설치하여 표면을 친수성으로 만들 수 있습니다. 그?...

토론

CryoEM 시료 전처리에는 여러 가지 기술적 문제가 수반되며, 대부분의 워크플로우에서는 연구원이 손상을 방지하기 위해 극도로 주의를 기울여 깨지기 쉬운 그리드를 수동으로 조작해야 합니다. 또한 유리화에 대한 모든 샘플의 적합성은 예측할 수 없습니다. 입자는 종종 공기-물-계면 또는 그리드를 덮고 있는 고체 지지 포일과 상호 작용하며, 이는 매우 높은 단백질 농도가 적용되지 않는 한 입자...

공개

저자는 공개할 갈등이 없습니다.

감사의 말

표본은 MIT.nano의 CryoEM 시설에서 Arnold and Mabel Beckman Foundation 덕분에 획득한 현미경으로 준비되고 이미지화되었습니다. 접촉각 이미징 장치는 MIT Metropolis Maker Space에서 인쇄되었습니다. 우리는 Nieng Yan과 Yimo Han의 실험실, 그리고 이 방법의 채택을 통하여 그들의 지원을 위한 MIT.nano에 직원에게 감사한다. 특히 통찰력 있는 토론과 피드백을 주신 Guanhui Gao 박사와 Sarah Sterling 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 NIH 보조금 R01-GM144542, 5T32-GM007287 및 NSF-CAREER 보조금 2046778의 지원을 받았습니다. 데이비스 연구실의 연구는 알프레드 P. 슬론 재단(Alfred P. Sloan Foundation), 제임스 H. 페리 기금(James H. Ferry Fund), MIT J-클리닉(MIT J-Clinic) 및 화이트헤드 가족(Whitehead Family)의 지원을 받고 있습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
250 mL beaker (3x)Fisher02-555-25B
50 mL beaker (2x)Corning1000-50
AcetoneFisherA949-4
Aluminum foilFisher15-078-292
Ammonium persulfateFisher(I17874
Coverslips 50 mm x 24 mmMattekPCS-1.5-5024
CVD grapheneGraphene SupermarketCVD-Cu-2x2
easiGlow dischargerTed-Pella91000S
EthanolMillipore-Sigma1.11727
Flat-tip tweezers Fisher50-239-60
Glass cutterGrainger21UE26
Glass petri plate and cover VWR75845-544
Glass serological pipetteFisher13-676-34D
Grid Storage CaseEMS71146-02
Hot plateFisher07-770-108
IsopropanolSigmaW292907
KimwipeFisher06-666
Lab scissors Fisher13-806-2
Methyl-Methacrylate EL-6 KayakuMMA M310006 0500L1GL
Molecular grade waterCorning46-000-CM
Negative action tweezers (2x)Fisher50-242-78
P20 pipetteRainin17014392
P200 pipetteRainin17008652 
ParafilmFisher13-374-12
Pipette tipsRainin30389291
Quantifoil grids with holey carbon EMSQ2100CR1
Spin coater SetCasKW-4Awith chuck SCA-19-23
StraightedgeULINEH-6560
Thermometer Grainger3LRD1
UV/Ozone cleaner BioForceSKU: PC440
Vacuum desiccatorThomas Scientific1159X11
Whatman paperVWR28297-216

참고문헌

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