一种在野外和实验室条件下诊断人畜共患线虫的简单粪便浮选方法

摘要

这项工作描述了使用浮选方法鉴定 2017 年至 2021 年在野外条件下从墨西哥狗身上收集的粪便样本中检测到 的犬弓蛔虫 和 Ancylostoma spp.。

摘要

由于墨西哥农村和郊区的实验室有限，在野外条件下诊断具有人畜共患潜力的犬类寄生虫，如 犬弓蛔 虫和 犬弓 蛔虫，通常很困难。本研究旨在检测 2017 年至 2021 年在野外条件下从墨西哥狗身上采集的粪便样本中的犬 锥虫 和 Ancylostoma spp.。样本量计算得出全国 534 只狗的目标招募。

排便后直接从直肠或地面采集样本。将样品储存在4°C的单独密封塑料袋中。 在现场和实验室条件下制备氯化钠饱和溶液（比重 [SpG] 1.20）。在收集后3天内，通过将每个粪便样品悬浮在盐水溶液中，使用浮选方法测试2-4g粪便的寄生虫。将粪便与浮选液混合，并用金属勺压碎。

一旦达到均匀的稠度，用筛子将粪便样品倒入新的塑料杯中，静置10-15分钟。使用灭菌接种环从混合物顶部收集三滴。将载玻片放在显微镜上，由训练有素的寄生虫学家识别寄生虫。对1,055只狗的粪便样本进行了显微镜筛查。犬 绦 虫阳性样本数为833个（78.95%）， 犬绦虫阳性样本数为222个（21.04%）。这些发现说明了在实验室和野外条件下使用寄生虫镜技术识别生活在墨西哥城市和农村地区的狗中的人畜共患蠕虫的重要性。

引言

胃肠道寄生虫是影响狗的最常见健康问题之一¹.据估计，全世界有 ~7 亿只家犬，大约 1.75 亿只可归类为自由漫游²。狗和人类之间共有 60 多种寄生虫，这表明狗可能是人类感染这些寄生虫的感染源³.犬弓蛔虫和犬弓蛔虫是两种寄生物种，它们会感染狗，并意外地感染人类宿主。目前，有几项关于这些蠕虫能够在墨西哥生存和繁殖的地点的研究。在美国、墨西哥、中美洲和加勒比地区，狗弓蛔虫的患病率从 0% 到 87% 以上不等⁴.犬弓蛔虫属（Toxocara canis）和犬弓蛔虫属（Ancylostoma spp.）以及狗的其他寄生物种，以前在墨西哥报道过^{5,6,7,8,9,10,11,12,13}（表1）。

寄生物种	地区	患病率 （%）	参考
犬棘口	克雷塔罗	42.90	5
	塔巴斯科州	15.90	6
	坎佩切	35.7 – 42.9	7
	尤卡坦州	73.8	8
巴贝虫	莫雷洛斯	13.60	9
	韦拉克鲁斯	10.00
球虫卵囊	尤卡坦州	2.30	8
栉头菌类	莫雷洛斯	30.3	10
犬双歧杆菌 Dipylidium caninum	尤卡坦州	2.30	8
Dirofilaria	尤卡坦州	7.0 – 8.3	11
贾弟虫	塔巴斯科州	3.00	6
	尤卡坦州	18.8	8
利什曼原虫	恰帕斯	19.00	12
绦虫	下加利福尼亚州	6.79	13
犬弓蛔虫	克雷塔罗	22.10	5
	尤卡坦州	6.20	8
Trichuris vulpis （英语：Trichuris vulpis）	尤卡坦州	25.40	8
锥虫属	哈利斯科州	8.10	9
	坎佩切	7.60
	恰帕斯	4.5 – 42.8
	金塔纳罗奥州	20.1 – 21.3
	托卢卡	17.50
	尤卡坦州	9.8 – 34

表 1：2001 年至 2020 年墨西哥狗寄生虫的区域流行率 （%）。 从2001年到2020年进行的先前调查的结果使得能够识别出犬类寄生虫在墨西哥几个城市和农村环境中的分布。这些研究深入了解了有利于犬类寄生虫在不同生态系统中持续存在的流行病学因素，有助于全面评估某些寄生虫物种的人畜共患影响。

肠道寄生虫（如卵、囊肿、卵囊或幼虫）的生命周期阶段可以在粪便样本中找到。因此，对粪便物质的检查提供了有关动物寄生虫的宝贵信息。1878 年，由于需要一种方法来检测人类粪便中的 Ancylostomidae 卵，因此使用了简单的粪便涂片，该涂片多年来一直用于检测胃肠道寄生虫，但被认为不是很敏感。因此，需要开发更好的共显微镜方法¹⁴.自首次描述用于回收和计数粪便样本中寄生虫卵的浮选技术以来，已经过去了^{100 多年 15}.从那时起，浮选技术的几种方法和变体被认为是检测宿主中某些寄生虫的标准。

例如，Lane 在 1924 年描述了一种涉及直接离心浮选技术的方法，该技术将离心过程一体化，然后将沉积物漂浮在饱和氯化钠溶液中，SpG 为 1.2 in 1 g（Lane）或 10 g（Stoll 的改进）。随后通过使用具有不同SpG¹⁴的溶液对浮选技术进行了修改。1939 年，Gordon 和 Whitlock 报告了 Stoll 技术的缺点，即由于碎屑干扰寄生虫卵的可视化，并开发了称为 McMaster¹⁶ 的定量方法。1979 年，O'Grady 和 Slocombe 证明，溶液的比重、时间和过滤器的网孔尺寸会影响使用浮选技术^{检测鸡蛋的准确性 17}。在过去的几十年里，由于对浮选技术进行了一些修改，迫切需要对浮选方法进行标准化。目前，需要在预防人畜共患寄生虫的背景下检测犬蠕虫感染，以应用适当的驱虫治疗，以限制人畜共患线虫传染性阶段的环境污染¹⁸。

在定性方法中，粪便浮选技术被广泛使用和接受，因为它不需要太多设备，简单、便宜、可重复;然而，它有一个主要缺点，即当感染强度较低时，它缺乏敏感性¹⁹.揭示大量寄生元件（如卵、卵囊、包囊或线虫幼虫）的存在的能力通常由溶液²⁰的密度决定。

以前的报告比较了用于检测犬线虫卵的寄生虫学技术。关于运动原生动物的检测，使用直接粪便涂片;而沉降方法可用于诊断吸虫等寄生虫的重卵²¹.粪便涂片法是应用最广泛的现场诊断测试之一。然而，这种技术的灵敏度低可能归因于它确实含有干扰寄生虫卵检测的碎片。通过将筛分步骤与提供适当SpG的溶液相结合，浮选方法可以更清晰、更不杂乱地观察蛔虫和钩虫卵。这导致了更精确和高效的显微镜筛选^过程22。同样，简单的浮选和直接离心浮选技术也非常常用于回收寄生虫卵和卵囊¹⁴。经典的浮选方法可以被认为是定性的或定量的，这取决于计数室的使用，如麦克马斯特方法¹⁵。尽管如此，由于浮选技术的灵敏度较低，并且侧重于专利期内寄生虫的检测，因此不应将阴性结果视为决定性结果。然而，准确性不仅取决于粪便样品的保存程序或浮选溶液的SpG，还取决于用户进行粪便检查的技术熟练程度和经验。

因此，已经探索了其他方法来检测粪便中的犬类寄生虫。人们普遍认为，诊断狗肠道蠕虫感染最广泛使用的方法之一是 FLOTAC 技术，这是一种多价、灵敏和准确的方法，与管中的浮选方案和 McMaster 技术相比，可为诊断狗 的犬蠕虫产生 准确可靠的结果^19，23.沉降方法可用于回收吸虫卵、胚胎线虫卵和大多数绦虫卵，这些卵不能在浮选液表面回收，因为这些结构不漂浮²⁴.一种已被证明优于浮选/沉降技术的方法是改良的双离心浮选法，因为它能够检测粪便中的绦虫卵，耗时更少，将 Anoplocephala 卵与粪便碎片分离，并减少结晶²⁵。此外，该技术已成功用于检测高灵敏度的蛔虫卵²⁶。然而，与本研究中提出的浮选方案相反，上述一些技术和离心方法（例如 Ovassay）需要将样品保存在福尔马林等试剂中、商业试剂盒、实验室条件下的样品处理以及使用硫酸锌²⁷ 等试剂，这些试剂价格昂贵且需要特殊的处置程序以避免环境毒性。

最近，人们倾向于使用通过添加高SpG溶液来提高浮选方法灵敏度的技术。然而，必须考虑到这些解决方案的缺点是最终制备过程中碎片的增加，因此寄生虫卵的检测不准确。此外，材料、试剂的商业可用性、成本、环境影响问题以及离心方法的使用难度影响了浮选技术^{的选择 14}，与我们在这项工作中提出的方案相比，浮选技术在现场条件下可能具有挑战性。用食盐制备浮选液比利用糖更有利，因为在田间条件下，糖会吸引黄蜂和蜜蜂等昆虫，并使制剂变得粘稠。此外，苯酚等溶液（为避免粘性而添加到糖溶液中）或 ZnSO₄等溶液根据环保准则难以正确丢弃，不能在现场处置;与食盐溶液不同。

本手稿的目的是演示在现场和实验室条件下使用简单浮选技术检测粪便样品中犬 绦虫 和 犬绦虫 卵的步骤。按照本文描述的方案并使用带有备用电池的显微镜，在没有实验室设备和基础设施的情况下，可以在农村和郊区诊断这些犬类人畜共患寄生虫。本文中描述的简单浮选方法可以快速提供结果，是一种非侵入性且具有成本效益的常规筛选技术。

研究方案

狗的使用和护理得到了墨西哥国立自治大学的批准。

1. 粪便样本采集

注意： 在兽医或动物主人的帮助下处理狗。

1. 对于野狗（图1A）或紧张的动物，在排便后立即或不超过10分钟后从地面收集样本。
2. 用水或凡士林润滑手术手套或薄壁聚乙烯袋。要从直肠收集粪便样本，请戴上手术手套或薄壁聚乙烯袋。
3. 从每只狗身上收集至少2克粪便（图1B）。
4. 按如下方式识别单个粪便样本：日期、位置（使用谷歌地图的全球定位系统 [GPS] 坐标）、为每只动物分配一个识别号、狗的大致年龄、狗的性别、品种、室内或室外（野）狗。
5. 用一个紧结关闭装有粪便样本的袋子。如果在收集后3-4小时内未分析粪便样品，则将袋子冷藏（4-8°C）。

2.制备用于现场诊断的饱和盐溶液

注意：如果无法获得天平、测量材料、炉子或燃气来烧开水或受到限制，则可以使用水、普通食盐、12 盎司（355 毫升）塑料杯和 1 升苏打水塑料空瓶轻松制备饱和盐水溶液。

1. 彻底清洗一个空的 1 升汽水瓶。用 1 升水装满瓶子。
2. 用普通食盐装满一个 12 盎司的塑料杯。
3. 将盐转移到汽水瓶中。
4. 用螺旋盖紧紧苏打水瓶。剧烈摇晃溶液，直到盐不再溶解。
   注意：在汽水瓶中摇晃溶液直到盐完全溶解可能需要长达 90 分钟的时间。

3.制备用于实验室诊断的饱和盐溶液

1. 称取420克普通食盐。
2. 将 420 克盐溶解在 1 升水中。
3. 将溶液煮沸，直到不再有盐溶解。
4. 过滤溶液以丢弃未溶解的盐。
5. 使用重流体比重计或密度计检查溶液的浓度。
   注意：理想浓度的SpG为1.20，以获得更好的结果（图2A）。鸡蛋的漂浮能力受其与溶液相互作用的影响，导致鸡蛋在具有相同比重的溶液中漂浮的能力不同。因此，为了实现最佳的卵回收率，必须考虑浮选液中的比重上限范围，确保其超过目标寄生虫元素的比重^范围6。

4.浮选法

注意： 如果粪便样品太干或太硬，请将它们浸渍在研钵中。

1. 用勺子将大约 3 克粪便放入一个塑料杯（高 ~8.5 厘米，直径 ~5.5 厘米）中。
2. 加入 1 mL 饱和盐溶液，直至获得糊状物。
3. 搅拌 1 分钟，加入 100 mL 饱和盐溶液。
4. 将该悬浮液通过塑料过滤器进入第二个塑料杯中，以避免产生粗颗粒（图2B）。
5. 让悬架静置 15-20 分钟。
6. 将接种环置于火焰中1秒，以确保其没有卵，囊肿或卵囊（图2C）。
7. 等待5秒，使接种环冷却（图2D）。
8. 用接种环从悬浮液表面滴三滴。将三滴中的每一滴分别放在一个载玻片上（图2E-G）
   注意：确保液滴不相互接触（图2H）。
9. 用10倍物镜在显微镜下观察（图2I）。如果放大倍数增加到 40 倍，请放置盖玻片。
10. 当在液滴中观察到阳性结果时，在实验室日志中分配一个叉号 （+），以记录专利期内粪便悬浮表面随机部位寄生虫的存在。

五、浮选法解读

注意：阴性结果尚无定论。

1. 对连续 3 天的样品进行一系列的三项测试，以提高测试的灵敏度。
   注：阳性结果表明专利期内存在寄生虫。

结果

在这项工作中，描述了用于鉴定 犬绦虫 和 犬绦虫 属的收集和共寄生虫镜程序。采用简单的粪便浮选方法检测犬蠕虫卵的基本原理是，由于解决方案、设备和材料价格低廉，因此该技术具有成本效益。因此，该方法具有很高的样品处理能力，因为可以在短时间内处理多个样品。此外，简单的粪便浮选方法易于执行且相对敏感。

动物的样本量和选择主要取决于动?...

讨论

犬线虫和犬线虫等线虫可以栖息在狗的小肠中，并有可能传播给人类。犬绦虫引起的临床症状在幼犬中很严重，表现为生长不良、呼吸系统问题或消化道病变²⁸.在成年犬中，感染通常趋于轻微。诊断依赖于识别粪便样本中的特征性虫卵。这种情况是给狗开驱虫药治疗的常见原因²⁹.要了解弓蛔虫的流行病学，必须认识到寄生虫可以在出?...

材料

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