Eine einfache Kotflotationsmethode zur Diagnose zoonotischer Nematoden unter Feld- und Laborbedingungen

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt die Verwendung einer Flotationsmethode zur Identifizierung von Toxocara canis und Ancylostoma spp., die in Kotproben von Hunden in Mexiko von 2017 bis 2021 unter Feldbedingungen nachgewiesen wurden.

Zusammenfassung

Die Diagnose von Hundeparasiten mit zoonotischem Potenzial wie Toxocara canis und Ancylostoma caninum unter Feldbedingungen ist in der Regel schwierig, da der Zugang zu einem Labor in ländlichen und vorstädtischen Gebieten Mexikos begrenzt ist. Ziel dieser Studie war es, T. canis und Ancylostoma spp. in Kotproben von Hunden nachzuweisen, die von 2017 bis 2021 in Mexiko unter Feldbedingungen gesammelt wurden. Die Berechnung der Stichprobengröße ergab eine Zieleinschreibung von 534 Hunden im ganzen Land.

Die Proben wurden nach dem Stuhlgang direkt aus dem Rektum oder dem Boden entnommen. Die Proben wurden in einzelnen, dicht verschlossenen Plastikbeuteln bei 4 °C gelagert. Eine gesättigte Natriumchloridlösung (spezifisches Gewicht [SpG] 1,20) wurde sowohl unter Feld- als auch unter Laborbedingungen hergestellt. Innerhalb von 3 Tagen nach der Entnahme wurden 2-4 g Kot mit einer Flotationsmethode auf Parasiten getestet, indem jede Kotprobe in einer Kochsalzlösung suspendiert wurde. Der Kot wurde mit der Flotationslösung vermischt und mit einem Metalllöffel zerkleinert.

Sobald eine gleichmäßige Konsistenz erreicht war, wurde die Kotprobe mit einem Sieb in einen neuen Plastikbecher gegossen und 10-15 Minuten ruhen gelassen. Drei Tropfen von der Oberseite der Mischung wurden mit einer sterilisierten Impföse aufgefangen. Die Objektträger wurden auf das Mikroskop gelegt und die Parasiten wurden von ausgebildeten Parasitologen identifiziert. Kotproben von 1.055 Hunden wurden mikroskopisch untersucht. Die Anzahl der positiven Proben für Ancylostoma spp. betrug 833 (78,95 % Häufigkeit) und 222 (21,04 %) für T. canis. Diese Ergebnisse verdeutlichen, wie wichtig es ist, zoonotische Helminthen bei Hunden zu identifizieren, die in städtischen und ländlichen Gebieten in Mexiko leben, und zwar mit einer koproparasitoskopischen Technik im Labor und unter Feldbedingungen.

Einleitung

Magen-Darm-Parasiten sind eines der häufigsten Gesundheitsprobleme, die Hunde betreffen¹. Schätzungen gehen davon aus, dass es weltweit ~700 Millionen Haushunde gibt, und etwa 175 Millionen können als freilaufend eingestuft werden². Mehr als 60 Parasitenarten werden zwischen Hunden und Menschen geteilt, was darauf hindeutet, dass Hunde eine Infektionsquelle für Menschen mit diesen Parasiten sein könnten³. Toxocara canis und Ancylostoma caninum sind zwei parasitäre Arten, die Hunde und versehentlich auch menschliche Wirte infizieren. Derzeit gibt es mehrere Studien über die Orte, an denen diese Helminthen in Mexiko überleben und sich vermehren können. Die Prävalenz von Toxocara bei Hunden variiert zwischen 0 % und über 87 % in den Vereinigten Staaten, Mexiko, Mittelamerika und der Karibik⁴. Toxocara canis und Ancylostoma spp. sowie andere parasitäre Arten bei Hunden wurden zuvor in Mexiko ^berichtet 5,6,7,8,9,10,11,12,13 (Tabelle 1).

Parasitäre Arten	Region	Prävalenz (%)	Referenz
Ancylostoma caninum	Querétaro	42.90	5
	Tabasco	15.90	6
	Campeche	35.7 – 42.9	7
	Yucatán	73.8	8
Babesia	Morelos	13.60	9
	Veracruz	10.00
Kokzidien-Oozysten	Yucatán	2.30	8
Ctenocephalides	Morelos	30.3	10
Dipylidium caninum	Yucatán	2.30	8
Dirofilaria	Yucatán	7.0 – 8.3	11
Giardia	Tabasco	3.00	6
	Yucatán	18.8	8
Leishmania	Chiapas	19.00	12
Bandwürmer	Baja California	6.79	13
Toxocara canis	Querétaro	22.10	5
	Yucatán	6.20	8
Trichuris vulpis	Yucatán	25.40	8
Trypanosoma	Jalisco	8.10	9
	Campeche	7.60
	Chiapas	4.5 – 42.8
	Quintana Roo	20.1 – 21.3
	Toluca	17.50
	Yucatán	9.8 – 34

Tabelle 1: Regionale Prävalenz (%) von Hundeparasiten in Mexiko von 2001 bis 2020. Die Ergebnisse früherer Untersuchungen, die von 2001 bis 2020 durchgeführt wurden, haben die Identifizierung der Verbreitung von Hundeparasiten in verschiedenen städtischen und ländlichen Gebieten Mexikos ermöglicht. Diese Studien bieten ein tiefes Verständnis der epidemiologischen Elemente, die für die Persistenz von Hundeparasiten in verschiedenen Ökosystemen förderlich sind, und tragen zu einer umfassenden Bewertung der zoonotischen Auswirkungen einiger Parasitenarten bei.

Lebenszyklusstadien von Darmparasiten wie Eiern, Zysten, Oozysten oder Larven können in Stuhlproben gefunden werden. So liefert die Untersuchung von Fäkalien wertvolle Informationen über die Parasiten eines Tieres. Die Notwendigkeit einer Methode zum Nachweis von Ancylostomidae-Eiern im menschlichen Kot führte 1878 zur Verwendung des einfachen Kotabstrichs, der viele Jahre lang zum Nachweis von Magen-Darm-Parasiten verwendet wurde, aber als nicht sehr empfindlich galt. Daher entstand die Notwendigkeit, bessere kopromikroskopische Methoden zu entwickeln¹⁴. Mehr als 100 Jahre sind vergangen, seit die Flotationstechnik zur Gewinnung und Zählung von Parasiteneiern in Kotproben erstmals beschrieben wurde¹⁵. Seitdem gelten mehrere Methoden und Varianten der Flotationstechnik als Standard für den Nachweis einiger Parasiten in ihren Wirten.

Zum Beispiel beschrieb Lane 1924 ein Verfahren mit der direkten Zentrifugalflotationstechnik, bei der das Sediment zentrifugiert und anschließend in einer gesättigten Natriumchloridlösung mit SpG 1,2 in 1 g (Lane) oder 10 g (Stoll-Modifikation) aufgewirbelt wird. Die Flotationstechnik wurde anschließend durch die Verwendung von Lösungen mit unterschiedlichem SpG¹⁴ modifiziert. Im Jahr 1939 berichteten Gordon und Whitlock über die Nachteile von Stolls Technik aufgrund von Störungen durch Detritus bei der Visualisierung von Parasiteneiern und entwickelten die quantitative Methode, die als McMaster¹⁶ bekannt ist. Im Jahr 1979 zeigten O'Grady und Slocombe, dass das spezifische Gewicht der Lösung, der Zeitpunkt und die Maschenweiten der Siebe die Genauigkeit der Eiererkennung mit der Flotationstechnik^{beeinflussen 17}. Da in den letzten Jahrzehnten mehrere Modifikationen an der Flotationstechnik vorgenommen wurden, besteht ein dringender Bedarf an einer Standardisierung der Flotationsmethoden. Derzeit ist der Nachweis von Helmintheninfektionen bei Hunden im Rahmen der Prävention von zoonotischen Parasiten erforderlich, um geeignete Anthelminthika-Behandlungen anzuwenden, um die Umweltkontamination mit infektiösen Stadien zoonotischer Nematoden zu begrenzen¹⁸.

Unter den qualitativen Methoden ist die Kotflotationstechnik weit verbreitet und akzeptiert, da sie nicht viel Ausrüstung erfordert, einfach, kostengünstig und reproduzierbar ist. Es hat jedoch einen großen Nachteil, da es ihm an Empfindlichkeit mangelt, wenn die Intensität der Infektion niedrig^{ist 19}. Die Fähigkeit, das Vorhandensein einer größeren Anzahl parasitärer Elemente wie Eier, Oozysten, Zysten oder Nematodenlarven aufzudecken, wird normalerweise durch die Dichte der Lösung^{bestimmt 20}.

Frühere Berichte haben koproparasitologische Techniken zum Nachweis von Nematodeneiern bei Hunden verglichen. Im Hinblick auf den Nachweis von beweglichen Protozoen werden direkte Stuhlabstriche verwendet; während Sedimentationsmethoden nützlich sind, um schwere Eier von Parasiten wie Trematoden zu diagnostizieren²¹. Einer der am weitesten verbreiteten feldbasierten diagnostischen Tests ist die Stuhlabstrichmethode. Die geringe Empfindlichkeit dieser Technik kann jedoch auf die Tatsache zurückgeführt werden, dass sie Schmutz enthält, der die Erkennung von Parasiteneiern stört. Durch die Integration eines Siebschritts zusammen mit Lösungen, die den richtigen SpG liefern, bietet die Flotationsmethode eine klarere und weniger überladene Beobachtung von Ascarid- und Hakenwurmeiern. Dies führt zu einem präziseren und effizienteren Verfahren für das mikroskopische Screening²². Ebenso werden einfache Flotations- und direkte Zentrifugalflotationstechniken sehr häufig verwendet, um Parasiteneier und Oozysten zu gewinnen¹⁴. Die klassischen Flotationsmethoden können je nach Verwendung einer Zählkammer als qualitativ oder quantitativ angesehen werden, wie z. B. die McMaster-Methode¹⁵. Da die Flotationstechnik jedoch eine geringe Empfindlichkeit aufweist und sich auf den Nachweis von Parasiten während der Patentlaufzeit konzentriert, sollten negative Ergebnisse nicht als schlüssig angesehen werden. Die Genauigkeit hängt jedoch nicht nur vom Konservierungsverfahren von Kotproben oder der SpG von Flotationslösungen ab, sondern auch von der technischen Kompetenz und Erfahrung in der Durchführung von Kotuntersuchungen des Anwenders.

Daher wurden andere Methoden zum Nachweis von Hundeparasiten im Kot erforscht. Es ist allgemein anerkannt, dass einer der am weitesten verbreiteten Ansätze für die Diagnose von intestinalen Helmintheninfektionen bei Hunden die FLOTAC-Technik ist, eine multivalente, empfindliche und genaue Methode, die im Vergleich zu einem Flotationsprotokoll in einem Röhrchen und der McMaster-Technik genaue und zuverlässige Ergebnisse für die Diagnose von A. caninum bei Hunden liefert^{19. 23}. Urheberrecht Sedimentationsmethoden sind nützlich für die Rückgewinnung von Egeleiern, embryonierten Nematodeneiern und den meisten Bandwurmeiern, die nicht an der Oberfläche einer Flotationslösung gewonnen werden können, da diese Strukturen nicht schwimmen²⁴. Eine Methode, die sich als überlegen gegenüber Flotations-/Sedimentationstechniken erwiesen hat, ist die modifizierte Doppelzentrifugalflotationsmethode, da sie den Nachweis von Cestode-Eiern im Kot ermöglicht, weniger zeitaufwändig ist, Anoplocephala-Eier von Fäkalien trennt und die Kristallisation verringert²⁵. Darüber hinaus wurde diese Technik erfolgreich zum Nachweis von Askarideneiern mit hoher Empfindlichkeit eingesetzt²⁶. Einige dieser oben genannten Techniken und Zentrifugalmethoden wie der Ovassay erfordern jedoch im Gegensatz zu dem in dieser Studie vorgeschlagenen Flotationsprotokoll die Probenkonservierung in Reagenzien wie Formalin, kommerziellen Kits, Probenverarbeitung unter Laborbedingungen und die Verwendung von Reagenzien wie Zinksulfat²⁷, die teuer sind und spezielle Entsorgungsverfahren erfordern, um Umwelttoxizität zu vermeiden.

Die Verwendung von Techniken, die die Empfindlichkeit der Flotationsmethode durch Zugabe von Lösungen mit hohem SpG erhöhen, wurde in letzter Zeit bevorzugt. Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass der Nachteil dieser Lösungen die Zunahme von Schmutz in der Endzubereitung und damit die ungenaue Erkennung von Parasiteneiern ist. Darüber hinaus beeinflussen die kommerzielle Verfügbarkeit von Materialien, Reagenzien, Kosten, Umweltverträglichkeitsfragen und die Schwierigkeit der Anwendung von Zentrifugalmethoden die Auswahl einer Flotationstechnik¹⁴, die unter Feldbedingungen im Gegensatz zu dem Protokoll, das wir in dieser Arbeit vorstellen, eine Herausforderung darstellen kann. Die Herstellung der Flotationslösungen mit Speisesalz ist gegenüber der Verwertung von Zucker vorteilhaft, da Zucker unter Feldbedingungen Insekten wie Wespen und Bienen anlockt und Präparate klebrig werden. Darüber hinaus sind Lösungen wie Phenol, das Zuckerlösungen zugesetzt wird, um Klebrigkeit zu vermeiden, oder ZnSO₄gemäß den Umweltschutzrichtlinien komplex zu entsorgen und können nicht vor Ort entsorgt werden. im Gegensatz zu einer Kochsalzlösung.

Das Ziel dieses Manuskripts ist es, die Schritte zum Nachweis von T . canis - und Ancylostoma spp.-Eiern in Stuhlproben unter Verwendung einer Anpassung der einfachen Flotationstechnik unter Feld- und Laborbedingungen zu demonstrieren. Nach dem hier beschriebenen Protokoll und unter Verwendung eines Mikroskops mit einer Pufferbatterie ist die Diagnose dieser tierischen Parasiten in ländlichen und vorstädtischen Gebieten möglich, wenn keine Laborgeräte und -infrastruktur verfügbar sind. Die in dieser Arbeit beschriebene einfache Flotationsmethode kann schnelle Ergebnisse liefern und ist eine nicht-invasive und kostengünstige Technik für das Routine-Screening.

Protokoll

Der Einsatz und die Pflege von Hunden wurde von der Nationalen und Autonomen Universität von Mexiko genehmigt.

1. Entnahme von Kotproben

HINWEIS: Behandeln Sie den Hund mit Hilfe eines Tierarztes oder des Besitzers des Tieres.

1. Bei verwilderten Hunden (Abbildung 1A) oder nervösen Tieren sollten Sie direkt nach dem Stuhlgang oder spätestens 10 Minuten später Proben vom Boden sammeln.
2. Schmieren Sie OP-Handschuhe oder dünnwandige Polyethylenbeutel mit Wasser oder Vaseline. Um Kotproben aus dem Rektum zu entnehmen, tragen Sie OP-Handschuhe oder dünnwandige Polyethylenbeutel.
3. Sammeln Sie mindestens 2 g Kot von jedem Hund (Abbildung 1B).
4. Identifizieren Sie einzelne Kotproben wie folgt: Datum, Ort (GPS-Koordinaten des Global Positioning System [GPS] mit Google Maps), Zuweisung einer Identifikationsnummer für jedes Tier, ungefähres Alter des Hundes, Geschlecht des Hundes, Rasse, Haus- oder Außenhund (Wildhund).
5. Verschließen Sie die Beutel mit der Kotprobe mit einem festen Knoten. Bewahren Sie die Beutel gekühlt auf (4-8 °C), wenn Stuhlproben nicht innerhalb von 3-4 Stunden nach der Entnahme analysiert werden.

2. Herstellung einer gesättigten Salzlösung für die Felddiagnose

Anmerkungen: Wenn der Zugang zu einer Waage, Messmaterial, Herden oder Gas zum Kochen von Wasser nicht vorhanden oder eingeschränkt ist, kann die gesättigte Kochsalzlösung einfach mit Wasser, gewöhnlichem Speisesalz, einem 12 oz (355 ml) Plastikbecher und einer leeren 1-Liter-Soda-Plastikflasche hergestellt werden.

1. Waschen Sie eine leere 1-Liter-Limonadenflasche gründlich. Füllen Sie die Flasche mit 1 l Wasser.
2. Füllen Sie einen 12-Unzen-Plastikbecher mit gewöhnlichem Speisesalz.
3. Gib das Salz in die Limonadenflasche.
4. Verschließen Sie die Limonadenflasche fest mit dem Schraubverschluss. Schütteln Sie die Lösung kräftig, bis sich das Salz nicht mehr auflöst.
   HINWEIS: Das Schütteln der Lösung in der Sodaflasche bis zur vollständigen Auflösung des Salzes kann bis zu 90 Minuten dauern.

3. Herstellung einer gesättigten Salzlösung für die Labordiagnostik

1. Wiegen Sie 420 g Kochsalz.
2. 420 g Salz in 1 l Wasser auflösen.
3. Kochen Sie die Lösung, bis sich kein Salz mehr auflöst.
4. Filtern Sie die Lösung, um das ungelöste Salz zu entsorgen.
5. Überprüfen Sie die Konzentration der Lösung mit einem Hydrometer oder Densitometer für schwere Flüssigkeiten.
   HINWEIS: Die ideale Konzentration hat einen SpG von 1,20, um bessere Ergebnisse zu erzielen (Abbildung 2A). Die Schwimmfähigkeit eines Eies wird durch seine Wechselwirkung mit der Lösung beeinflusst, was zu der unterschiedlichen Fähigkeit von Eiern beiträgt, in Lösungen mit dem gleichen spezifischen Gewicht zu schwimmen. Um eine optimale Eirückgewinnung zu erreichen, ist es daher wichtig, den oberen Bereich des spezifischen Gewichts in der Flotationslösung zu berücksichtigen, um sicherzustellen, dass er den der Zielparasitenelemente⁶ übersteigt.

4. Flotationsmethode

HINWEIS: Wenn Kotproben zu trocken oder hart sind, mazerieren Sie sie in einem Mörser.

1. Geben Sie mit einem Löffel ca. 3 g Kot in einen Plastikbecher (~8,5 cm Höhe und ~5,5 cm Durchmesser).
2. Fügen Sie 1 ml der gesättigten Salzlösung hinzu, bis eine Paste erhalten wird.
3. 1 Minute umrühren und 100 ml gesättigte Salzlösung hinzufügen.
4. Geben Sie diese Suspension durch ein Kunststoffsieb in einen zweiten Plastikbecher, um grobe Partikel zu vermeiden (Abbildung 2B).
5. Lassen Sie die Aufhängung 15-20 Minuten stehen.
6. Legen Sie eine Impfschlaufe 1 s lang in eine Flamme, um sicherzustellen, dass sie frei von Eiern, Zysten oder Oozysten ist (Abbildung 2C).
7. Warten Sie 5 s, bis die Impfschlaufe abgekühlt ist (Abbildung 2D).
8. Nehmen Sie drei Tropfen von der Oberfläche der Suspension mit der Impfschlaufe. Legen Sie jeden der drei Tropfen separat auf einen Objektträger (Abbildung 2E-G)
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Tropfen nicht miteinander in Berührung kommen (Abbildung 2H).
9. Beobachten Sie unter dem Mikroskop mit einem 10-fachen Objektiv (Abbildung 2I). Legen Sie ein Deckglas an, wenn die Vergrößerung auf 40x erhöht wird.
10. Wenn ein positives Ergebnis im Tröpfchen beobachtet wird, weisen Sie dem Laborlogbuch ein Kreuz (+) zu, um das Vorhandensein von Parasiten während der Patentperiode an zufälligen Stellen der Stuhlsuspensionsoberfläche aufzuzeichnen.

5. Auslegung der Flotationsmethode

HINWEIS: Negative Ergebnisse sind nicht schlüssig.

1. Führen Sie eine Reihe von drei Tests mit Proben von 3 aufeinanderfolgenden Tagen durch, um die Empfindlichkeit des Tests zu erhöhen.
   HINWEIS: Positive Ergebnisse weisen auf das Vorhandensein von Parasiten während der Patentlaufzeit hin.

Ergebnisse

In dieser Arbeit werden Sammel- und koproparasitoskopische Verfahren zur Identifizierung von T. canis und Ancylostoma spp. beschrieben. Der Grund für die Anpassung der einfachen Kotflotationsmethode zum Nachweis von Helmintheneiern bei Hunden ist, dass diese Technik kostengünstig ist, da die Lösungen, Geräte und Materialien kostengünstig sind. Daher hat die Methode eine hohe Probenhandhabungskapazität, da mehrere Proben in kurzer Zeit verarbeitet werden können. Darüber hinaus ist die einfache Ko...

Diskussion

Nematoden wie T. canis und Ancylostoma spp. können den Dünndarm von Hunden bewohnen und haben das Potenzial, auf den Menschen übertragen zu werden. Klinische Symptome, die durch T. canis verursacht werden, sind bei jungen Hunden schwerwiegend und äußern sich in schlechtem Wachstum, Atemproblemen oder Läsionen des Verdauungstrakts²⁸. Bei erwachsenen Hunden verläuft die Infektion in der Regel mild. Die Diagnose beruht auf der Identifizierung charakteristischer Eier ...

Materialien

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Disposable 12-oz glass cup	Uline Mexico	S-22275	Sold in retail stores
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