Zoonotik Nematodların Tarla ve Laboratuvar Koşullarında Teşhis Edilmesi İçin Basit Bir Fekal Flotasyon Yöntemi

Özet

Bu çalışma, tarla koşullarında 2017'den 2021'e kadar Meksika'daki köpeklerden toplanan dışkı örneklerinde tespit edilen Toxocara canis ve Ancylostoma spp.'yi tanımlamak için bir yüzdürme yönteminin kullanımını açıklamaktadır.

Özet

Toxocara canis ve Ancylostoma caninum gibi zoonotik potansiyele sahip köpek parazitlerinin tarla koşullarında teşhisi, Meksika'daki kırsal ve banliyö alanlarında bir laboratuvara sınırlı erişim nedeniyle genellikle zordur. Bu çalışmada 2017-2021 yılları arasında Meksika'daki köpeklerden alınan dışkı örneklerinde tarla koşullarında T. canis ve Ancylostoma spp.'nin saptanması amaçlanmıştır. Örneklem büyüklüğü hesaplaması, ülke genelinde 534 köpeğin hedef kaydıyla sonuçlandı.

Örnekler dışkılama sonrası doğrudan rektumdan veya yerden toplandı. Numuneler ayrı, sıkıca kapatılmış plastik torbalarda 4 °C'de saklandı. Hem saha hem de laboratuvar koşullarında doymuş bir sodyum klorür çözeltisi (özgül ağırlık [SpG] 1.20) hazırlandı. Toplandıktan sonraki 3 gün içinde, her bir dışkı örneğini bir tuzlu su çözeltisinde süspanse ederek yüzdürme yöntemi kullanılarak 2-4 g dışkı parazitler açısından test edildi. Dışkı yüzdürme çözeltisi ile karıştırıldı ve metal bir kaşık kullanılarak ezildi.

Düzgün bir kıvam elde edildikten sonra, dışkı örneği bir elek kullanılarak yeni bir plastik kaba döküldü ve 10-15 dakika bekletildi. Karışımın üstünden üç damla, sterilize edilmiş bir aşılama halkası kullanılarak toplandı. Slaytlar mikroskoba yerleştirildi ve parazitler eğitimli parazitologlar tarafından tanımlandı. 1.055 köpekten alınan dışkı örnekleri mikroskobik olarak tarandı. Ancylostoma spp. için pozitif örnek sayısı 833 (%78.95) ve T. canis için 222 (%21.04) idi. Bu bulgular, Meksika'da kentsel ve kırsal alanlarda yaşayan köpeklerde zoonotik helmintlerin laboratuvarda ve tarla koşullarında koproparasitoskopik bir teknik kullanılarak tanımlanmasının önemini göstermektedir.

Giriş

Gastrointestinal parazitler, köpekleri etkileyen en yaygın sağlık sorunlarından biridir¹. Tahminler, dünya çapında ~ 700 milyon evcil köpek olduğunu ve yaklaşık 175 milyonunun serbest dolaşım² olarak kategorize edilebileceğini göstermektedir. Köpekler ve insanlar arasında 60'tan fazla parazit türü paylaşılmaktadır, bu da köpeklerin bu parazitlerle insanlar için bir enfeksiyon kaynağı olabileceğini düşündürmektedir³. Toxocara canis ve Ancylostoma caninum, köpekleri ve yanlışlıkla insan konakçıları enfekte eden iki parazitik türdür. Şu anda, bu helmintlerin Meksika'da hayatta kalabildikleri ve üreyebildikleri yerler hakkında birkaç çalışma var. Köpeklerde Toxocara prevalansı Amerika Birleşik Devletleri, Meksika, Orta Amerika ve Karayipler'de %0 ile %87 arasında değişmektedir⁴. Toxocara canis ve Ancylostoma spp., köpeklerde diğer parazitik türlerin yanı sıra, daha önce Meksika'da ^{5,6,7,8,9,10,11,12,13} bildirilmiştir (Tablo 1).

Parazit türler	Bölge	Yaygınlık (%)	Referans
Ancylostoma caninum	Querétaro	42.90	5
	Tabasco	15.90	6
	Campeche	35.7 – 42.9	7
	Yucatán	73.8	8
Babesia Belediyesi	Morelos	13.60	9
	Veracruz	10.00
Koksidiyal ookistler	Yucatán	2.30	8
Ktenosefalitler	Morelos	30.3	10
Dipylidium caninum	Yucatán	2.30	8
Dirofilaria (Dirofilaria Bölgesi)	Yucatán	7.0 – 8.3	11
Fransa	Tabasco	3.00	6
	Yucatán	18.8	8
Leishmania (Leishmania)	Chiapas	19.00	12
Tenyalar	Baja Kaliforniya	6.79	13
Toxocara canis	Querétaro	22.10	5
	Yucatán	6.20	8
Trichuris vulpis (Trichuris vulpis)	Yucatán	25.40	8
Tripanosoma (Tripanozoma)	Jalisco	8.10	9
	Campeche	7.60
	Chiapas	4.5 – 42.8
	Quintana Roo	20.1 – 21.3
	Toluca	17.50
	Yucatán	9.8 – 34

Tablo 1: 2001'den 2020'ye kadar Meksika'da köpek parazitlerinin bölgesel yaygınlığı (%) 2001'den 2020'ye kadar yürütülen önceki araştırmalardan elde edilen bulgular, Meksika'daki çeşitli kentsel ve kırsal ortamlarda köpek parazit dağılımının belirlenmesini sağlamıştır. Bu çalışmalar, farklı ekosistemlerde köpek parazitlerinin kalıcılığına yardımcı olan epidemiyolojik unsurların derinlemesine anlaşılmasını sağlayarak, bazı parazit türlerinin zoonotik etkisinin kapsamlı bir değerlendirmesine katkıda bulunur.

Yumurtalar, kistler, ookistler veya larvalar gibi bağırsak parazitlerinin yaşam döngüsü aşamaları dışkı örneklerinde bulunabilir. Bu nedenle, dışkı materyalinin incelenmesi, bir hayvanın parazitleri hakkında değerli bilgiler sağlar. İnsan dışkısında Ancylostomidae yumurtalarını tespit etmek için bir yönteme duyulan ihtiyaç, 1878'de gastrointestinal parazitleri tespit etmek için uzun yıllar kullanılan ancak çok hassas olmadığı düşünülen basit dışkı yaymasının kullanılmasına yol açtı. Bu nedenle, daha iyi kopromikroskobik yöntemler geliştirme ihtiyacı ortaya çıkmıştır¹⁴. Dışkı örneklerinde parazit yumurtalarının geri kazanılması ve sayılması için yüzdürme tekniğinin ilk kez tanımlanmasından bu yana¹⁰⁰ yıldan fazla zaman geçmiştir 15. O zamandan beri, yüzdürme tekniğinin çeşitli yöntemleri ve varyantları, konakçılarında bazı parazitlerin tespiti için bir standart olarak kabul edilmiştir.

Örneğin, Lane, 1924'te, santrifüjlemeyi ve ardından tortuyu 1 g (Lane) veya 10 g (Stoll'un modifikasyonu) SpG 1.2 ile doymuş bir sodyum klorür çözeltisi içinde yüzdürmeyi entegre eden doğrudan santrifüjlü yüzdürme tekniğini içeren bir yöntem tanımladı. Yüzdürme tekniği daha sonra farklı SpG^14'e sahip çözeltiler kullanılarak değiştirildi. 1939'da Gordon ve Whitlock, parazit yumurtalarının görselleştirilmesinde döküntülerin müdahalesi nedeniyle Stoll'un tekniğinin dezavantajlarını bildirdiler ve McMaster¹⁶ olarak bilinen kantitatif yöntemi geliştirdiler. 1979'da O'Grady ve Slocombe, çözeltinin özgül ağırlığının, zamanlamasının ve süzgeçlerin ağ boyutlarının, yüzdürme tekniğini kullanarak yumurta tespitinin doğruluğunu etkilediğini^{gösterdi 17}. Son yıllarda, yüzdürme tekniğinde çeşitli değişiklikler yapıldığından, yüzdürme yöntemlerinin standardizasyonuna acil bir ihtiyaç vardır. Şu anda, zoonotik nematodların enfeksiyöz aşamaları ile çevresel kontaminasyonu sınırlamak için uygun antelmintik tedavilerin uygulanması için zoonotik parazitlerin önlenmesi bağlamında köpek helmint enfeksiyonlarının saptanması gerekmektedir¹⁸.

Kalitatif yöntemler arasında fekal flotasyon tekniği, fazla ekipman gerektirmediği, basit, ucuz ve tekrarlanabilir olduğu için yaygın olarak kullanılmakta ve kabul edilmektedir; Yine de, enfeksiyonun yoğunluğu düşük olduğunda duyarlılıktan yoksun olması nedeniyle büyük bir dezavantajı vardır¹⁹. Yumurtalar, ookistler, kistler veya nematod larvaları gibi daha fazla sayıda parazitik elementin varlığını ortaya çıkarma yeteneği genellikle çözeltinin^{yoğunluğu ile belirlenir 20}.

Önceki raporlar, köpek nematod yumurtalarının tespiti için koproparazitolojik teknikleri karşılaştırmıştır. Hareketli protozoaların tespiti ile ilgili olarak, doğrudan dışkı yaymaları kullanılır; Sedimantasyon yöntemleri ise trematodlar gibi parazitlerin ağır yumurtalarını teşhis etmek için yararlıdır²¹. En yaygın kullanılan alan bazlı tanı testlerinden biri fekal smear yöntemidir. Bununla birlikte, bu tekniğin düşük hassasiyet seviyesi, parazit yumurtalarının tespitine müdahale eden döküntüler içermesine bağlanabilir. Uygun SpG'yi sağlayan çözümlerle birlikte bir eleme adımını dahil ederek, yüzdürme yöntemi, ascarid ve kancalı kurt yumurtalarının daha net ve daha az karmaşık bir gözlemini sunar. Bu, mikroskobik tarama için daha hassas ve verimli bir sürece yol açar²². Benzer şekilde, parazit yumurtalarını ve ookistlerini geri kazanmak için basit yüzdürme ve doğrudan santrifüj yüzdürme teknikleri çok yaygın olarak kullanılmaktadır¹⁴. Klasik yüzdürme yöntemleri, McMaster yöntemi¹⁵ gibi bir sayma odasının kullanımına bağlı olarak kalitatif veya kantitatif olarak kabul edilebilir. Bununla birlikte, yüzdürme tekniğinin duyarlılığı düşük olduğundan ve patent döneminde parazitlerin tespitine odaklandığından, olumsuz sonuçlar kesin olarak kabul edilmemelidir. Bununla birlikte, doğruluk sadece dışkı örneklerinin koruma prosedürüne veya yüzdürme çözeltilerinin SpG'sine bağlı değildir, aynı zamanda kullanıcının dışkı muayenelerini yapmadaki teknik yeterliliğine ve deneyimine de bağlıdır.

Sonuç olarak, dışkıdaki köpek parazitlerinin tespiti için başka yöntemler araştırılmıştır. Köpeklerde bağırsak helmint enfeksiyonlarının teşhisi için en yaygın kullanılan yaklaşımlardan birinin, bir tüpteki yüzdürme protokolü ve McMaster tekniği ile karşılaştırıldığında köpeklerde A. caninum tanısı için doğru ve güvenilir sonuçlar veren çok değerli, hassas ve doğru bir yöntem olan FLOTAC tekniği olduğu genel olarak kabul edilmiştir^{19, 23}. Sedimantasyon yöntemleri, fluke yumurtalarının, embriyonlu nematod yumurtalarının ve çoğu tenya yumurtasının geri kazanılması için kullanışlıdır, bu yapılar yüzmediği için bir yüzdürme çözeltisinin yüzeyinde geri kazanılamaz²⁴. Yüzdürme/sedimantasyon tekniklerinden daha üstün olduğu kanıtlanmış bir yöntem, dışkıda sestod yumurtalarının saptanmasını sağladığı, daha az zaman aldığı, Anoplocephala yumurtalarını dışkı kalıntılarından ayırdığı ve kristalleşmeyi azalttığı için Modifiye Çift Santrifüj Flotasyon yöntemidir²⁵. Ayrıca, bu teknik, yüksek hassasiyete sahip ascarid yumurtalarını tespit etmek için başarıyla kullanılmıştır²⁶. Yine de, yukarıda bahsedilen bu tekniklerden bazıları ve Ovassay gibi santrifüj yöntemleri, bu çalışmada önerdiğimiz yüzdürme protokolünün aksine, formalin, ticari kitler, laboratuvar koşullarında numune işleme gibi reaktiflerde numune muhafazasını ve çinko sülfat²⁷ gibi pahalı olan ve çevresel toksisiteyi önlemek için özel imha prosedürleri gerektiren reaktiflerin kullanılmasını gerektirir.

Yüksek SpG'li solüsyonlar ekleyerek flotasyon yönteminin hassasiyetini arttıran tekniklerin kullanılması son zamanlarda tercih edilmektedir. Bununla birlikte, bu çözümlerin dezavantajının, son preparasyonda döküntülerin artması ve dolayısıyla parazit yumurtalarının yanlış tespiti olduğu düşünülmelidir. Ek olarak, malzemelerin, reaktiflerin ticari mevcudiyeti, maliyet, çevresel etki sorunları ve santrifüj yöntemlerinin kullanım zorluğu, bu çalışmada sunduğumuz protokolün aksine saha koşullarında zor olabilen bir yüzdürme tekniğinin¹⁴ seçimini etkiler. Yüzdürme çözeltilerinin sofra tuzu ile hazırlanması şeker kullanımına göre avantajlıdır çünkü tarla koşullarında şeker, yaban arısı ve arı gibi böcekleri çeker ve müstahzarlar yapışkan hale gelir. Ayrıca, yapışkanlığı önlemek için şeker çözeltilerine eklenen fenol veya ZnS04 gibi çözeltiler, çevre koruma yönergelerine göre uygun şekilde atılmak için karmaşıktır ve sahada atılamaz; sofra tuzu çözeltisinin aksine.

Bu makalenin amacı, tarla ve laboratuvar koşullarında basit yüzdürme tekniğinin bir uyarlamasını kullanarak dışkı örneklerinde T. canis ve Ancylostoma spp. yumurtalarını tespit etme adımlarını göstermektir. Burada açıklanan protokolü takiben ve yedek pilli bir mikroskop kullanarak, kırsal ve banliyö alanlarında bu köpek zoonotik parazitlerinin teşhisi, laboratuvar ekipmanı ve altyapısı mevcut olmadığında mümkündür. Bu çalışmada açıklanan basit yüzdürme yöntemi hızlı sonuçlar sağlayabilir ve rutin tarama için non-invaziv ve uygun maliyetli bir tekniktir.

Protokol

Köpeklerin kullanımı ve bakımı Meksika Ulusal ve Özerk Üniversitesi tarafından onaylandı.

1. Dışkı örneklerinin toplanması

NOT: Köpeği bir veteriner veya hayvanın sahibinin yardımıyla tutun.

1. Yabani köpekler (Şekil 1A) veya gergin hayvanlar söz konusu olduğunda, dışkılamadan hemen sonra veya en fazla 10 dakika sonra yerden örnekler toplayın.
2. Cerrahi eldivenleri veya ince duvarlı polietilen torbaları su veya vazelin ile yağlayın. Rektumdan dışkı örnekleri toplamak için cerrahi eldiven veya ince duvarlı polietilen torbalar kullanın.
3. Her köpekten en az 2 g dışkı toplayın (Şekil 1B).
4. Tek tek dışkı örneklerini şu şekilde tanımlayın: tarih, konum (Google Haritalar'ı kullanarak Küresel Konumlandırma Sistemi [GPS] koordinatları), her hayvan için bir kimlik numarası atayın, köpeğin yaklaşık yaşı, köpeğin cinsiyeti, cins, iç veya dış mekan (vahşi) köpek.
5. Dışkı örneğini içeren torbaları sıkı bir düğümle kapatın. Dışkı numuneleri alındıktan sonra 3-4 saat içinde analiz edilmezse, torbaları buzdolabında (4-8 °C) saklayın.

2. Saha teşhisi için doymuş bir tuz çözeltisinin hazırlanması

NOT: Suyu kaynatmak için teraziye, ölçüm malzemesine, sobaya veya gaza erişim yoksa veya sınırlıysa, doymuş tuzlu su çözeltisi su, genel sofra tuzu, plastik 12 oz (355 mL) fincan ve 1 L soda plastik boş şişe kullanılarak kolayca hazırlanabilir.

1. Boş bir 1 L soda şişesini iyice yıkayın. Şişeyi 1 L su ile doldurun.
2. 12 oz'luk plastik bir bardağı ortak sofra tuzu ile doldurun.
3. Tuzu soda şişesine aktarın.
4. Soda şişesini vidalı kapakla sıkıca kapatın. Tuz artık çözünmeyene kadar çözeltiyi kuvvetlice çalkalayın.
   NOT: Tuzun tamamen eriyene kadar çözeltiyi soda şişesinde çalkalamak 90 dakika kadar sürebilir.

3. Laboratuvar tanısı için doymuş bir tuz çözeltisinin hazırlanması

1. 420 g ortak sofra tuzu ağırlığında.
2. 420 g tuzu 1 L suda eritin.
3. Çözeltiyi daha fazla tuz eriyene kadar kaynatın.
4. Çözünmemiş tuzu atmak için çözeltiyi süzün.
5. Ağır bir sıvı hidrometresi veya dansitometre kullanarak çözeltinin konsantrasyonunu kontrol edin.
   NOT: Daha iyi sonuçlar elde etmek için ideal konsantrasyonun SpG'si 1.20'dir (Şekil 2A). Bir yumurtanın yüzdürme kabiliyeti, çözelti ile etkileşiminden etkilenir ve yumurtaların aynı özgül ağırlığa sahip çözeltilerde yüzdürme kabiliyetine katkıda bulunur. Bu nedenle, optimum yumurta geri kazanımını elde etmek için, yüzdürme çözeltisindeki üst özgül ağırlık aralığını dikkate almak ve hedeflenen parazit elementlerininkini aşmasını sağlamak önemlidir⁶.

4. Yüzdürme yöntemi

NOT: Dışkı örnekleri çok kuru veya sertse, bunları bir havanda yumuşatın.

1. Bir kaşık kullanarak, yaklaşık 3 g dışkıyı bir plastik kaba (~8,5 cm yüksekliğinde ve ~5,5 cm çapında) koyun.
2. Bir macun elde edilene kadar 1 mL doymuş tuz çözeltisi ekleyin.
3. 1 dakika karıştırın ve 100 mL doymuş tuz çözeltisi ekleyin.
4. Kaba parçacıkları önlemek için bu süspansiyonu plastik bir süzgeçten ikinci bir plastik kaba geçirin (Şekil 2B).
5. Süspansiyonu 15-20 dakika bekletin.
6. Yumurta, kist veya ookist içermediğinden emin olmak için 1 saniye boyunca aleve bir aşılama halkası yerleştirin (Şekil 2C).
7. Aşılama döngüsünün soğuması için 5 saniye bekleyin (Şekil 2D).
8. Aşılama halkası ile süspansiyon yüzeyinden üç damla alın. Üç damlanın her birini ayrı ayrı bir cam slayt üzerine yerleştirin (Şekil 2E-G)
   NOT: Damlaların birbiriyle temas etmediğinden emin olun (Şekil 2H).
9. Mikroskop altında 10x objektifle gözlemleyin (Şekil 2I). Büyütme 40x'e yükseltilirse bir lamel yerleştirin.
10. Damlacıkta pozitif bir sonuç gözlendiğinde, dışkı süspansiyon yüzeyinin rastgele bölgelerinde patent döneminde parazitlerin varlığını kaydetmek için laboratuvar kayıt defterine bir çarpı (+) atayın.

5. Yüzdürme yönteminin yorumlanması

NOT: Olumsuz sonuçlar kesin değildir.

1. Testin hassasiyetini artırmak için art arda 3 günden alınan numunelerle bir dizi üç test gerçekleştirin.
   NOT: Olumlu sonuçlar, patent döneminde parazitlerin varlığını gösterir.

Sonuçlar

Bu çalışmada, T. canis ve Ancylostoma spp.'nin tanımlanması için toplama ve koproparasitoskopik prosedürler anlatılmıştır. Köpek helmint yumurtalarını tespit etmek için basit dışkı yüzdürme yönteminin uyarlanmasının arkasındaki mantık, çözümler, ekipman ve malzemeler ucuz olduğu için bu tekniğin uygun maliyetli olmasıdır. Bu nedenle, kısa sürede birden fazla numune işlenebildiğinden yöntem yüksek bir numune işleme kapasitesine sahiptir. Ayrıca, basit dışkı yü...

Tartışmalar

T. canis ve Ancylostoma spp. gibi nematodlar köpeklerin ince bağırsağında yaşayabilir ve insanlara bulaşma potansiyeline sahiptir. T. canis'in neden olduğu klinik belirtiler genç köpeklerde ciddidir ve zayıf büyüme, solunum sorunları veya sindirim sistemi lezyonları olarak kendini gösterir²⁸. Yetişkin köpeklerde enfeksiyon tipik olarak hafif olma eğilimindedir. Teşhis, dışkı örneğindeki karakteristik yumurtaların tanımlanmasına dayanır. Bu du...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 x 1.2 V AA rechargeable batteries	Energizer		Sold in retail stores
Bunsen burner	Viresa	FER-M224
Disposable 12-oz glass cup	Uline Mexico	S-22275	Sold in retail stores
Glass slides	Velab, Mexico	VEP-P20
Inoculating loop	VelaQuin, Mexico	CRM-5010PH
Light Microscope	VelaQuin, Mexico	VE-B2
Lighter	Bic	J25	Sold in retail stores
One plastic cup (12 oz)	Amazon	ASIN B08C2CRHSH	Can be any kitchen plastic reuseable cup
Plastic cups  (size of a dice or urine sample cup) diameter 5.5 cm and height 8.5 cm, two cups	Amazon	Layhit-Containers-ZYHD192919	Can be any kitchen plastic reuseable cup
Plastic strainer 10 cm	Ecko	ASIN B00TUAAVWI	Can be any kitchen plastic strainer
Soda bottle	Coca-Cola	1-liter	Sold in retail stores
Spoon	Amazon Basics	ASIN B00TUAAVWI	Can be any kitchen spoon
Table salt	La Fina		Sold in retail stores