Un método simple de flotación fecal para diagnosticar nematodos zoonóticos en condiciones de campo y laboratorio

Resumen

En este trabajo se describe el uso de un método de flotación para identificar Toxocara canis y Ancylostoma spp. detectados en muestras fecales colectadas de perros en México de 2017 a 2021 en condiciones de campo.

Resumen

El diagnóstico de parásitos caninos con potencial zoonótico como Toxocara canis y Ancylostoma caninum en condiciones de campo suele ser difícil debido al acceso limitado a un laboratorio en zonas rurales y suburbanas de México. Este estudio tuvo como objetivo detectar T. canis y Ancylostoma spp. en muestras fecales colectadas de perros en México de 2017 a 2021 en condiciones de campo. El cálculo del tamaño de la muestra dio como resultado una inscripción objetivo de 534 perros en todo el país.

Las muestras se recogieron directamente del recto o del suelo después de la defecación. Las muestras se almacenaron en bolsas de plástico individuales, herméticamente cerradas, a 4 °C. Se preparó una solución saturada de cloruro de sodio (gravedad específica [SpG] 1,20) tanto en condiciones de campo como de laboratorio. Dentro de los 3 días posteriores a la recolección, se analizaron de 2 a 4 g de heces para detectar parásitos utilizando un método de flotación suspendiendo cada muestra fecal en una solución salina. Las heces se mezclaron con la solución de flotación y se trituraron con una cuchara de metal.

Una vez que se logró una consistencia uniforme, la muestra fecal se vertió en un nuevo vaso de plástico con un colador y se dejó reposar durante 10-15 minutos. Se recogieron tres gotas de la parte superior de la mezcla utilizando un asa de inoculación esterilizada. Los portaobjetos se colocaron en el microscopio y los parásitos fueron identificados por parasitólogos capacitados. Las muestras fecales de 1.055 perros se examinaron microscópicamente. El número de muestras positivas para Ancylostoma spp. fue de 833 (78,95% de frecuencia) y de 222 (21,04%) para T. canis. Estos hallazgos ilustran la importancia de identificar helmintos zoonóticos en perros que viven en zonas urbanas y rurales de México utilizando una técnica coproparasitoscópica en laboratorio y en condiciones de campo.

Introducción

Los parásitos gastrointestinales son uno de los problemas de salud más comunes que afectan^{a los perros}. Las estimaciones sugieren que hay ~ 700 millones de perros domésticos en todo el mundo, y aproximadamente 175 millones pueden clasificarse como vagabundos². Más de 60 especies de^{parásitos son} compartidas entre perros y humanos, lo que sugiere que los perros podrían ser una fuente de infección para los humanos con estos parásitos. Toxocara canis y Ancylostoma caninum son dos especies parásitas que infectan a los perros y, accidentalmente, a los huéspedes humanos. Actualmente, existen varios estudios sobre los lugares donde estos helmintos son capaces de sobrevivir y reproducirse en México. La prevalencia de Toxocara en perros varía de 0% a más de 87% en los Estados Unidos, México, América Central y el Caribe⁴. Toxocara canis y Ancylostoma spp., así como otras especies parasitarias en perros, han sido reportadas previamente en México 5,6,7,8,9,10,11,12,13 (Tabla 1).

Especies parásitas	Región	Prevalencia (%)	Referencia
Ancylostoma caninum	Querétaro	42.90	5
	Tabasco	15.90	6
	Campeche	35.7 – 42.9	7
	Yucatán	73.8	8
Babesia	Morelos	13.60	9
	Veracruz	10.00
Ooquistes coccidiales	Yucatán	2.30	8
Ctenocefálidos	Morelos	30.3	10
Dipylidium caninum	Yucatán	2.30	8
Dirofilaria	Yucatán	7.0 – 8.3	11
Giardia	Tabasco	3.00	6
	Yucatán	18.8	8
Leishmania	Chiapas	19.00	12
Tenias	Baja California	6.79	13
Toxocara canis	Querétaro	22.10	5
	Yucatán	6.20	8
Trichuris vulpis	Yucatán	25.40	8
Trypanosoma	Jalisco	8.10	9
	Campeche	7.60
	Chiapas	4.5 – 42.8
	Quintana Roo	20.1 – 21.3
	Toluca	17.50
	Yucatán	9.8 – 34

Tabla 1: Prevalencia regional (%) de parásitos caninos en México de 2001 a 2020. Los hallazgos de investigaciones previas realizadas entre 2001 y 2020 han permitido identificar la distribución del parásito canino en varios entornos urbanos y rurales de México. Estos estudios proporcionan una comprensión profunda de los elementos epidemiológicos que conducen a la persistencia de parásitos caninos en diferentes ecosistemas, contribuyendo a una evaluación integral del impacto zoonótico de algunas especies de parásitos.

Las etapas del ciclo de vida de los parásitos intestinales, como huevos, quistes, ooquistes o larvas, se pueden encontrar en muestras de heces. Por lo tanto, el examen de la materia fecal proporciona información valiosa sobre los parásitos de un animal. La necesidad de un método para detectar huevos de Ancylostomidae en heces humanas llevó al uso del frotis fecal simple en 1878, que se utilizó durante muchos años para detectar parásitos gastrointestinales, pero se consideró poco sensible. Por lo tanto, surgió la necesidad de desarrollar mejores métodos copromicroscópicos¹⁴. Han pasado más de 100 años desde que se describió por primera vez la técnica de flotación para recuperar y contar huevos de parásitos en muestras fecales¹⁵. Desde entonces, varios métodos y variantes de la técnica de flotación se han considerado un estándar para la detección de algunos parásitos en sus huéspedes.

Por ejemplo, Lane describió un método en 1924 que involucra la técnica de flotación centrífuga directa, que integra la centrifugación seguida de la flotación del sedimento en una solución saturada de cloruro de sodio con SpG 1.2 en 1 g (Lane) o 10 g (modificación de Stoll). Posteriormente, se modificó la técnica de flotación mediante el uso de soluciones con diferentes SpG¹⁴. En 1939, Gordon y Whitlock informaron de las desventajas de la técnica de Stoll debido a la interferencia de los detritos en la visualización de los huevos de parásitos y desarrollaron el método cuantitativo conocido como McMaster¹⁶. En 1979, O'Grady y Slocombe demostraron que la gravedad específica de la solución, el tiempo y el tamaño de la malla de los filtros afectan la precisión de la detección de huevos utilizando la técnica de flotación¹⁷. Durante las últimas décadas, debido a que se han realizado varias modificaciones en la técnica de flotación, existe una necesidad urgente de estandarizar los métodos de flotación. Actualmente, la detección de infecciones por helmintos caninos en el contexto de la prevención de parásitos zoonóticos es necesaria para aplicar tratamientos antihelmínticos apropiados para limitar la contaminación ambiental con estadios infecciosos de nematodos zoonóticos¹⁸.

Entre los métodos cualitativos, la técnica de flotación fecal es ampliamente utilizada y aceptada porque no requiere mucho equipo, es simple, económica y reproducible; Sin embargo, tiene un gran inconveniente y es que carece de sensibilidad cuando la intensidad de la infección es baja¹⁹. La capacidad de revelar la presencia de un mayor número de elementos parásitos como huevos, ooquistes, quistes o larvas de nematodos suele estar determinada por la densidad de la solución²⁰.

Informes previos han comparado técnicas coproparasitológicas para la detección de huevos de nematodos caninos. Con respecto a la detección de protozoos móviles, se utilizan frotis fecales directos; mientras que los métodos de sedimentación son útiles para el diagnóstico de huevos pesados de parásitos como los trematodos²¹. Una de las pruebas diagnósticas de campo más utilizadas es el método del frotis fecal. Sin embargo, el bajo nivel de sensibilidad de esta técnica puede atribuirse al hecho de que contiene residuos que interfieren con la detección de huevos de parásitos. Al incorporar un paso de tamizado junto con soluciones que proporcionan la SpG adecuada, el método de flotación ofrece una observación más clara y menos desordenada de los huevos de ascáridos y anquilostomas. Esto conduce a un proceso más preciso y eficiente para el cribado microscópico²². Asimismo, las técnicas de flotación simple y flotación centrífuga directa se utilizan con mucha frecuencia para recuperar huevos y ooquistes de parásitos¹⁴. Los métodos clásicos de flotación pueden considerarse cualitativos o cuantitativos dependiendo del uso de una cámara de conteo como el método McMaster¹⁵. No obstante, dado que la técnica de flotación tiene una baja sensibilidad y se centra en la detección de parásitos en el período de la patente, los resultados negativos no deben considerarse concluyentes. Sin embargo, la precisión no solo depende del procedimiento de conservación de las muestras fecales o de la SpG de las soluciones de flotación, sino que también depende de la competencia técnica y la experiencia en la realización de exámenes fecales del usuario.

En consecuencia, se han explorado otros métodos para la detección de parásitos caninos en las heces. En general, se ha reconocido que uno de los enfoques más utilizados para el diagnóstico de las infecciones por helmintos intestinales en perros es la técnica FLOTAC, un método multivalente, sensible y preciso que produce resultados precisos y fiables para el diagnóstico de A. caninum en perros en comparación con un protocolo de flotación en un tubo y la técnica McMaster^{19. Artículo 23}. Los métodos de sedimentación son útiles para recuperar huevos de trematodos, huevos de nematodos embrionados y la mayoría de los huevos de tenia, que no se pueden recuperar en la superficie de una solución de flotación porque estas estructuras no flotan²⁴. Un método que ha demostrado ser superior a las técnicas de flotación/sedimentación es el método de flotación centrífuga doble modificada, ya que permite la detección de huevos de cestodos en las heces, consume menos tiempo, separa los huevos de Anoplocephala de los desechos fecales y disminuye la cristalización²⁵. Además, esta técnica se ha utilizado con éxito para detectar huevos de ascáridos con alta sensibilidad²⁶. Sin embargo, algunas de estas técnicas y métodos centrífugos antes mencionados, como el Ovassay, a diferencia del protocolo de flotación que proponemos en este estudio, requieren la preservación de la muestra en reactivos como el formol, kits comerciales, el procesamiento de muestras en condiciones de laboratorio y el uso de reactivos como el sulfato de zinc²⁷, que son costosos y requieren procedimientos especiales de eliminación para evitar la toxicidad ambiental.

Recientemente se ha favorecido el uso de técnicas que aumenten la sensibilidad del método de flotación mediante la adición de soluciones con alta SpG. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la desventaja de estas soluciones es el aumento de los residuos en la preparación final y, por tanto, la detección inexacta de los huevos del parásito. Además, la disponibilidad comercial de materiales, reactivos, costos, problemas de impacto ambiental y dificultad de uso de métodos centrífugos afectan la selección de una técnica de flotación¹⁴, lo que puede ser desafiante en condiciones de campo en contraste con el protocolo que presentamos en este trabajo. La preparación de las soluciones de flotación con sal de mesa es ventajosa sobre la utilización de azúcar porque en condiciones de campo, el azúcar atrae insectos como avispas y abejas y las preparaciones se vuelven pegajosas. Además, soluciones como el fenol, que se agrega a las soluciones de azúcar para evitar la pegajosidad, o el ZnSO₄son complejas de desechar adecuadamente de acuerdo con las pautas de protección ambiental y no se pueden desechar en el campo; a diferencia de una solución de sal de mesa.

El objetivo de este manuscrito es demostrar los pasos para detectar huevos de T. canis y Ancylostoma spp. en muestras fecales utilizando una adaptación de la técnica de flotación simple en condiciones de campo y laboratorio. Siguiendo el protocolo aquí descrito y utilizando un microscopio con batería de respaldo, el diagnóstico de estos parásitos zoonóticos caninos en zonas rurales y suburbanas es posible cuando no se dispone de equipos e infraestructura de laboratorio. El método de flotación simple descrito en este trabajo puede proporcionar resultados rápidos y es una técnica no invasiva y rentable para el cribado rutinario.

Protocolo

El uso y cuidado de los perros fue aprobado por la Universidad Nacional y Autónoma de México.

1. Recogida de muestras fecales

NOTA: Manipule al perro con la ayuda de un veterinario o del dueño del animal.

1. En el caso de perros asilvestrados (Figura 1A) o animales nerviosos, recoja muestras del suelo inmediatamente después de la defecación o no más de 10 minutos después.
2. Lubrique los guantes quirúrgicos o las bolsas de polietileno de paredes delgadas con agua o vaselina. Para recolectar muestras fecales del recto, use guantes quirúrgicos o bolsas de polietileno de paredes delgadas.
3. Recoja al menos 2 g de heces de cada perro (Figura 1B).
4. Identifique las muestras fecales individuales de la siguiente manera: fecha, ubicación (coordenadas del Sistema de Posicionamiento Global [GPS] utilizando Google Maps), asigne un número de identificación para cada animal, edad aproximada del perro, sexo del perro, raza, perro de interior o exterior (asilvestrado).
5. Cierre las bolsas que contienen la muestra fecal con un nudo apretado. Mantenga las bolsas refrigeradas (4-8 °C) si las muestras de heces no se analizan dentro de las 3-4 h posteriores a la recolección.

2. Preparación de una solución salina saturada para el diagnóstico de campo

NOTA: Si el acceso a una balanza, material de medición, estufas o gas para hervir agua está ausente o limitado, la solución salina saturada se puede preparar fácilmente con agua, sal de mesa común, un vaso de plástico de 12 oz (355 ml) y una botella vacía de plástico de refresco de 1 L.

1. Lave bien una botella de refresco vacía de 1 litro. Llena la botella con 1 L de agua.
2. Llene un vaso de plástico de 12 onzas con sal de mesa común.
3. Transfiere la sal a la botella de refresco.
4. Cierre bien la botella de refresco con el tapón de rosca. Agite la solución vigorosamente hasta que la sal ya no se disuelva.
   NOTA: Agitar la solución en la botella de refresco hasta la disolución completa de la sal puede tardar hasta 90 minutos.

3. Preparación de una solución salina saturada para diagnóstico de laboratorio

1. Pesar 420 g de sal de mesa común.
2. Disolver 420 g de sal en 1 L de agua.
3. Hervir la solución hasta que no se disuelva más sal.
4. Filtre la solución para desechar la sal no disuelta.
5. Verifique la concentración de la solución usando un hidrómetro o densitómetro de fluido pesado.
   NOTA: La concentración ideal tiene un SpG de 1.20 para lograr mejores resultados (Figura 2A). La capacidad de flotación de un huevo está influenciada por su interacción con la solución, lo que contribuye a la capacidad variable de los huevos para flotar en soluciones con la misma gravedad específica. Por lo tanto, para lograr una recuperación óptima de los huevos, es esencial considerar el rango superior de gravedad específica en la solución de flotación, asegurando que supere el de los elementos parásitos objetivo⁶.

4. Método de flotación

NOTA: Si las muestras fecales están demasiado secas o duras, macerarlas en un mortero.

1. Con una cuchara, coloque aproximadamente 3 g de heces en un vaso de plástico (~8,5 cm de altura y ~5,5 cm de diámetro).
2. Añadir 1 mL de la solución salina saturada hasta obtener una pasta.
3. Revuelva durante 1 minuto y agregue 100 ml de solución salina saturada.
4. Pase esta suspensión a través de un colador de plástico a un segundo vaso de plástico para evitar partículas gruesas (Figura 2B).
5. Deje reposar la suspensión durante 15-20 min.
6. Coloque un asa de inoculación en una llama durante 1 s para asegurarse de que esté libre de huevos, quistes u ooquistes (Figura 2C).
7. Espere 5 s para que el asa de inoculación se enfríe (Figura 2D).
8. Tome tres gotas de la superficie de la suspensión con el asa de inoculación. Coloque cada una de las tres gotas por separado en un portaobjetos de vidrio (Figura 2E-G)
   NOTA: Asegúrese de que las gotas no estén en contacto entre sí (Figura 2H).
9. Observar bajo el microscopio con un objetivo de 10x (Figura 2I). Coloque un cubreobjetos si el aumento aumenta a 40x.
10. Cuando se observe un resultado positivo en la gota, asigne una cruz (+) en el cuaderno de laboratorio para registrar la presencia de parásitos en el período de patente en sitios aleatorios de la superficie de suspensión fecal.

5. Interpretación del método de flotación

NOTA: Los resultados negativos no son concluyentes.

1. Realizar una serie de tres pruebas con muestras de 3 días consecutivos para aumentar la sensibilidad de la prueba.
   NOTA: Los resultados positivos indican la presencia de parásitos en el período de la patente.

Resultados

En este trabajo se describen los procedimientos de colecta y coproparasitoscopia para la identificación de T. canis y Ancylostoma spp. La razón detrás de la adaptación del método simple de flotación fecal para detectar huevos de helmintos caninos es que esta técnica es rentable ya que las soluciones, el equipo y los materiales son económicos. Por lo tanto, el método tiene una alta capacidad de manejo de muestras, ya que se pueden procesar múltiples muestras en un período corto. Además, el m?...

Discusión

Los nematodos como T. canis y Ancylostoma spp. pueden habitar en el intestino delgado de los perros y tienen el potencial de transmitirse a los humanos. Los signos clínicos causados por T. canis son graves en perros jóvenes y se manifiestan como un crecimiento deficiente, problemas respiratorios o lesiones en el tracto digestivo²⁸. En los perros adultos, la infección suele ser leve. El diagnóstico se basa en la identificación de huevos característicos en una muestr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 x 1.2 V AA rechargeable batteries	Energizer		Sold in retail stores
Bunsen burner	Viresa	FER-M224
Disposable 12-oz glass cup	Uline Mexico	S-22275	Sold in retail stores
Glass slides	Velab, Mexico	VEP-P20
Inoculating loop	VelaQuin, Mexico	CRM-5010PH
Light Microscope	VelaQuin, Mexico	VE-B2
Lighter	Bic	J25	Sold in retail stores
One plastic cup (12 oz)	Amazon	ASIN B08C2CRHSH	Can be any kitchen plastic reuseable cup
Plastic cups  (size of a dice or urine sample cup) diameter 5.5 cm and height 8.5 cm, two cups	Amazon	Layhit-Containers-ZYHD192919	Can be any kitchen plastic reuseable cup
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Soda bottle	Coca-Cola	1-liter	Sold in retail stores
Spoon	Amazon Basics	ASIN B00TUAAVWI	Can be any kitchen spoon
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