野外および実験室条件下での人獣共通線虫の診断のための簡便便浮遊法

要約

この研究では、2017年から2021年にかけてメキシコの犬から採取された糞便サンプルから検出された Toxocara canis と Ancylostoma 属菌を野外条件下で同定するための浮遊選鉱法の使用について説明します。

要約

Toxocara canisやAncylostoma caninumなどの人獣共通感染症の可能性のある犬の寄生虫を野外条件下で診断することは、メキシコの農村部や郊外では検査室へのアクセスが限られているため、通常困難です。本研究は、2017年から2021年にかけてメキシコのイヌから採取した糞便サンプルから、野外条件下でT. canisとAncylostoma spp.を検出することを目的としたものです。サンプルサイズを計算した結果、全国で534匹の犬が登録されました。

サンプルは、排便後に直腸または地面から直接採取されました。サンプルは、4°Cで個別に密封されたビニール袋に入れて保存しました。 塩化ナトリウムの飽和溶液(比重[SpG]1.20)を野外および実験室条件下で調製した。採取から3日以内に、2〜4gの糞便を、各糞便サンプルを生理食塩水に懸濁させることによる浮遊法を用いて寄生虫について検査した。糞便を浮遊選鉱溶液と混合し、金属製のスプーンを用いて粉砕した。

均一な粘稠度が得られたら、糞便サンプルをふるいを使用して新しいプラスチックカップに注ぎ、10〜15分間放置しました。混合物の上部から3滴を、滅菌した接種ループを用いて回収した。スライドを顕微鏡に置き、訓練を受けた寄生虫学者によって寄生虫を同定しました。1,055匹の犬の糞便サンプルを顕微鏡でスクリーニングしました。 Ancylostoma spp.の陽性サンプル数は833(78.95%頻度)、 T. canisの陽性サンプル数は222(21.04%)でした。これらの知見は、メキシコの都市部と農村部に生息するイヌの人獣共通感染症蠕虫を、実験室および野外条件下で共寄生虫鏡技術を用いて同定することの重要性を示している。

概要

胃腸寄生虫は、犬に影響を与える最も一般的な健康問題の1つです¹。推定によると、世界には~7億匹の飼い犬がおり、約1億7,500万匹が放し飼いに分類され^ます2。60種以上の寄生虫が犬と人間の間で共有されており、犬がこれらの寄生虫を持つ人間の感染源である可能性があることを示唆しています³。Toxocara canisとAncylostoma caninumは、犬に感染し、偶発的に人間の宿主に感染する2つの寄生種です。現在、これらの蠕虫がメキシコで生き残り、繁殖できる場所についていくつかの研究があります。犬のトキソカラの有病率は、米国、メキシコ、中央アメリカ、カリブ海諸国で0%から87%以上までさまざま^です4。Toxocara canisとAncylostoma spp.、およびイヌの他の寄生種は、メキシコで以前に報告されています5,6,7,8,9,10,11,12,13(表1)。

寄生種	地域	有病率(%)	参考
Ancylostomaのcaninum	ケレタロ	42.90	5
	タバスコ	15.90	6
	カンペチェ州	35.7 – 42.9	7
	ユカタン州	73.8	8
バベシア	モレロス州	13.60	9
	ベラクルス州	10.00
コクシジウムオーシスト	ユカタン州	2.30	8
クテノセファリド	モレロス州	30.3	10
ジピリジウム・カニナム	ユカタン州	2.30	8
ディロフィラリア	ユカタン州	7.0 – 8.3	11
ジアルジア	タバスコ	3.00	6
	ユカタン州	18.8	8
リーシュマニア	チアパス 州	19.00	12
サナダムシ	バハカリフォルニア	6.79	13
トキソカラ・イヌ	ケレタロ	22.10	5
	ユカタン州	6.20	8
トリチュリス・バルピス	ユカタン州	25.40	8
トリパノソーマ	ハリスコ州	8.10	9
	カンペチェ州	7.60
	チアパス 州	4.5 – 42.8
	キンタナ・ロー州	20.1 – 21.3
	トルカ	17.50
	ユカタン州	9.8 – 34

表1:2001年から2020年までのメキシコにおける犬の寄生虫の地域的有病率(%)。 2001年から2020年にかけて実施された以前の調査の結果により、メキシコのいくつかの都市部と農村部におけるイヌ寄生虫の分布を特定することができました。これらの研究は、さまざまな生態系におけるイヌ寄生虫の存続を助長する疫学的要素の深い理解を提供し、一部の寄生虫種の人獣共通感染の影響の包括的な評価に貢献します。

卵、嚢胞、オーシスト、幼虫などの腸内寄生虫のライフサイクル段階は、糞便サンプルで見つけることができます。したがって、糞便物質の検査は、動物の寄生虫に関する貴重な情報を提供します。ヒトの糞便中のAncylostomidae卵を検出する方法の必要性から、1878年に単純な糞便塗抹標本が使用され、胃腸寄生虫を検出するために長年使用されていましたが、あまり感度が低いと考えられていました。したがって、より優れた共顕微鏡法を開発する必要性が生じた¹⁴。糞便サンプル中の寄生虫の卵を回収して数えるための浮遊選鉱技術が最初に報告されてから100年以上が経過しました¹⁵。それ以来、浮遊選鉱技術のいくつかの方法と変種は、宿主内のいくつかの寄生虫を検出するための標準と見なされてきました。

例えば、レーンは1924年に、遠心分離とそれに続く沈殿物を1g(レーン)または10g(ストールの修正)でSpG1.2の飽和塩化ナトリウム溶液に浮遊させる直接遠心浮遊選鉱法を含む方法を説明しました。その後、浮遊選鉱技術は、異なる^SpG14の溶液を使用して変更されました。1939年、ゴードンとウィットロックは、寄生虫の卵を視覚化する際のデトリタスからの干渉によるストールの手法の欠点を報告し、マク^{マスター16}として知られる定量的方法を開発しました。1979年、O'GradyとSlocombeは、溶液の比重、タイミング、およびストレーナーのメッシュサイズが、浮遊選鉱技術を使用した卵検出の精度に影響を与えることを実証しました¹⁷。過去数十年の間に、浮選技術にいくつかの変更が加えられたため、浮選方法の標準化が急務となっています。現在、人獣共通感染症の寄生虫の予防の文脈での犬の蠕虫感染の検出は、人獣共通線虫の感染段階による環境汚染を制限するために適切な駆虫治療を適用するために必要です¹⁸。

定性的な方法の中で、糞便浮遊選鉱法は、多くの機器を必要とせず、単純で安価で再現性があるため、広く使用され、受け入れられています。しかし、感染の強度が低いと感度が低下するという大きな欠点があります¹⁹。卵、オーシスト、嚢胞、または線虫幼虫などのより多くの寄生要素の存在を明らかにする能力は、通常、溶液²⁰の密度によって決定される。

これまでの報告では、イヌ線虫の卵を検出するための共寄生学的手法が比較されています。運動性原虫の検出に関しては、直接糞便塗抹標本が使用されます。一方、沈降法は、吸虫などの寄生虫の重い卵を診断するのに有用です²¹。最も広く使用されているフィールドベースの診断検査の1つは、糞便塗抹標本法です。しかし、この技術の感度が低いのは、寄生虫の卵の検出を妨げる破片が含まれているという事実に起因している可能性があります。ふるい分けステップと適切なSpGを提供する溶液を組み込むことにより、浮遊選鉱法は、回虫や鉤虫の卵をより明確で雑然とした観察を提供します。これは、顕微鏡スクリーニングのためのより正確で効率的なプロセス²²をもたらす。同様に、寄生虫の卵やオーシストを回収するために、単純な浮遊選鉱と直接遠心浮選技術が非常に一般的に利用されています¹⁴。古典的な浮選法は、McMaster法¹⁵などの計数室の使用に応じて、定性的または定量的と見なすことができます。それにもかかわらず、浮遊選鉱法は感度が低く、特許期間中の寄生虫の検出に焦点を当てているため、否定的な結果は決定的であると見なされるべきではありません。ただし、精度は、糞便サンプルの保存手順や浮遊選鉱溶液のSpGに依存するだけでなく、ユーザーの糞便検査を実施する際の技術的習熟度と経験にも依存します。

その結果、糞便中の犬の寄生虫を検出するための他の方法が検討されています。犬の腸管蠕虫感染症の診断に最も広く使用されているアプローチの1つは、チューブ内の浮遊選鉱プロトコルやマクマスター法と比較した場合、犬の A.caninum の診断に正確で信頼性の高い結果をもたらす多価で高感度かつ正確な方法であるFLOTAC法であると一般的に認識されています^19。23。沈降法は、吸虫卵、胚化線虫卵、およびほとんどのサナダムシの卵を回収するのに有用であり、これらの構造は浮遊しないため、浮遊選鉱溶液の表面では回収できません²⁴。浮遊選鉱/沈殿技術よりも優れていることが証明されている方法の1つは、糞便中の条虫卵の検出を可能にし、時間がかからず、糞便破片から アノプロケファラ の卵を分離し、結晶化を減少させるため、修正二重遠心浮遊法です²⁵。さらに、この技術は、回虫卵を高感度で検出するために成功裏に使用されています²⁶。しかし、これらの前述の技術やOvassayなどの遠心分離法の中には、この研究で提案する浮選プロトコルとは対照的に、ホルマリンなどの試薬、市販のキット、実験室条件下でのサンプル処理、および硫酸亜鉛²⁷などの試薬の使用が必要であり、これらは高価で環境毒性を回避するために特別な廃棄手順を必要とします。

最近では、高SpGの溶液を添加することにより浮選法の感度を高める技術の使用が好まれています。しかし、これらの溶液の欠点は、最終準備における破片の増加であり、したがって、寄生虫の卵の不正確な検出であることを考慮する必要があります。さらに、材料、試薬、コスト、環境影響問題、および遠心分離法の使用の難しさは、浮遊選鉱技術¹⁴の選択に影響を与え、これは、本研究で提示するプロトコルとは対照的に、フィールド条件において困難であり得る。食卓塩による浮選溶液の調製は、圃場条件下では砂糖がスズメバチやミツバチなどの昆虫を引き付け、調製物が粘着性になるため、砂糖の利用よりも有利です。さらに、べたつきを避けるために糖溶液に添加されるフェノールやZnSO₄などの溶液は、環境保護ガイドラインに従って適切に廃棄するのが複雑であり、現場で廃棄することはできません。食卓塩溶液とは異なります。

この原稿の目的は、野外および実験室条件下での単純な浮遊選鉱技術の適応を使用して、糞便サンプル中の T.canis および Ancylostoma 属の卵を検出する手順を示すことです。本書に記載されているプロトコルに従い、バックアップバッテリーを備えた顕微鏡を使用すると、実験装置やインフラストラクチャが利用できない場合に、農村部および郊外地域でのこれらの犬の人獣共通寄生虫の診断が可能です。この研究で説明した単純な浮遊選鉱法は、迅速な結果を得ることができ、ルーチンスクリーニングのための非侵襲的で費用対効果の高い技術です。

プロトコル

犬の使用と世話は、メキシコ国立自治大学によって承認されました。

1.糞便サンプルの収集

注:獣医師または動物の所有者の助けを借りて犬を扱ってください。

1. 野良犬(図1A)や神経質な動物の場合は、排便直後または10分以内に地面からサンプルを採取してください。
2. 手術用手袋または薄肉のポリエチレンバッグに水またはワセリンを注油します。直腸から糞便サンプルを採取するには、手術用手袋または薄肉のポリエチレンバッグを着用してください。
3. 各犬から少なくとも2gの糞便を採取します(図1B)。
4. 日付、場所(Googleマップを使用した全地球測位システム[GPS]座標)、各動物の識別番号の割り当て、犬のおおよその年齢、犬の性別、犬種、屋内または屋外(野良犬)として個々の糞便サンプルを特定します。
5. 糞便サンプルの入った袋をしっかりと結び目で閉じます。採取後4〜8時間以内に糞便サンプルが分析されない場合は、バッグを冷蔵(4〜4°C)してください。

2. フィールド診断のための飽和塩溶液の調製

注意: 天びん、測定材料、ストーブ、またはお湯を沸かすためのガスへのアクセスが不足または制限されている場合は、水、食卓塩、プラスチック製の12オンス(355 mL)カップ、および1Lのソーダプラスチック空ボトルを使用して、飽和生理食塩水を簡単に調製できます。

1. 空の1Lソーダボトルを完全に洗います。ボトルに1Lの水を入れます。
2. 12オンスのプラスチックカップに一般的な食卓塩を入れます。
3. 塩をソーダボトルに移します。
4. ソーダボトルをスクリューキャップでしっかりと閉じます。塩が溶けなくなるまで溶液を激しく振る。
   注意: 塩が完全に溶けるまでソーダボトル内の溶液を振ると、最大90分かかる場合があります。

3.検査診断のための飽和塩溶液の調製

1. 一般的な食卓塩420gの重さを量ります。
2. 420gの塩を1Lの水に溶かします。
3. 塩が溶けなくなるまで溶液を沸騰させます。
4. 溶液をろ過して、未溶解の塩を廃棄します。
5. 重流体比重計または濃度計を使用して溶液の濃度を確認します。
   注:理想的な濃度は、より良い結果を得るために SpG が 1.20 です(図 2A)。卵の浮遊能力は溶液との相互作用の影響を受け、同じ比重の溶液中で卵が浮遊する能力に変化をもたらします。したがって、最適な卵の回収を達成するためには、浮遊選鉱溶液中の比重の上限を考慮し、標的とする寄生^虫要素の比重を上回っていることを確認することが不可欠である6。

4.浮遊選鉱法

注:糞便サンプルが乾燥しすぎたり硬すぎたりする場合は、乳鉢で浸軟してください。

1. スプーンを使用して、約3gの糞便を1つのプラスチックカップ(高さ~8.5cm、直径~5.5cm)に入れます。
2. ペーストが得られるまで1mLの飽和塩溶液を加えます。
3. 1分間攪拌し、100mLの飽和塩溶液を加えます。
4. この懸濁液をプラスチックストレーナーを通して2つ目のプラスチックカップに通し、粗い粒子を避けます(図2B)。
5. サスペンションを15〜20分間放置します。
6. 接種ループを炎の中に1秒間置き、卵、嚢胞、またはオーシストがないことを確認します(図2C)。
7. 接種ループが冷えるまで5秒間待ちます(図2D)。
8. 接種ループで懸濁液の表面から3滴を取ります。3つの滴をそれぞれ1枚のスライドガラスに別々に置きます(図2E-G)
   メモ:液滴が互いに接触していないことを確認します(図2H)。
9. 10倍の対物レンズで顕微鏡で観察します(図2I)。倍率を40倍にする場合はカバーガラスを配置します。
10. 液滴に陽性の結果が観察された場合は、実験室のログブックに十字(+)を割り当てて、糞便懸濁液表面のランダムな部位に特許期間中の寄生虫の存在を記録します。

5.浮遊選鉱法の解釈

注:陰性の結果は決定的ではありません。

1. 3日間連続して採取したサンプルで3つのテストを行い、テストの感度を上げます。
   注:肯定的な結果は、特許期間中に寄生虫が存在することを示しています。

結果

この研究では、 T. canis と Ancylostoma spp. の同定のための収集と共寄生虫鏡検査手順について説明します。犬の蠕虫の卵を検出するための単純な糞便浮遊法を採用した理論的根拠は、この技術がソリューション、機器、および材料が安価であるため、費用対効果が高いことです。そのため、短時間で複数のサンプルを処理できるため、サンプル処理能力が高いのが特徴です。さらに...

ディスカッション

T. canisやAncylostoma spp.などの線虫は、犬の小腸に生息し、ヒトに感染する可能性があります。T. canisによって引き起こされる臨床徴候は、若い犬では深刻であり、発育不良、呼吸器系の問題、または消化管病変として現れます²⁸。成犬の場合、感染は通常軽度である傾向があります。診断は、糞便サンプル中の特徴的な卵の特定に依存しています。この状態...

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