Un semplice metodo di flottazione fecale per la diagnosi di nematodi zoonotici in condizioni di campo e di laboratorio

Riepilogo

Questo lavoro descrive l'uso di un metodo di galleggiamento per identificare Toxocara canis e Ancylostoma spp. rilevati in campioni fecali raccolti da cani in Messico dal 2017 al 2021 in condizioni di campo.

Abstract

La diagnosi di parassiti canini con potenziale zoonotico come Toxocara canis e Ancylostoma caninum in condizioni di campo è solitamente difficile a causa dell'accesso limitato a un laboratorio nelle aree rurali e suburbane del Messico. Questo studio mirava a rilevare T. canis e Ancylostoma spp. in campioni fecali raccolti da cani in Messico dal 2017 al 2021 in condizioni di campo. Il calcolo della dimensione del campione ha portato a un obiettivo di arruolamento di 534 cani in tutto il paese.

I campioni sono stati raccolti direttamente dal retto o dal terreno dopo la defecazione. I campioni sono stati conservati in sacchetti di plastica individuali ben sigillati a 4 °C. Una soluzione satura di cloruro di sodio (peso specifico [SpG] 1,20) è stata preparata sia in condizioni di campo che di laboratorio. Entro 3 giorni dalla raccolta, 2-4 g di feci sono stati testati per i parassiti utilizzando un metodo di flottazione sospendendo ogni campione fecale in una soluzione salina. Le feci sono state mescolate con la soluzione di flottazione e frantumate con un cucchiaio di metallo.

Una volta ottenuta una consistenza uniforme, il campione fecale è stato versato in un nuovo bicchiere di plastica utilizzando un setaccio e lasciato riposare per 10-15 minuti. Tre gocce dalla parte superiore della miscela sono state raccolte utilizzando un ciclo di inoculazione sterilizzato. I vetrini sono stati posizionati al microscopio e i parassiti sono stati identificati da parassitologi addestrati. I campioni fecali di 1.055 cani sono stati sottoposti a screening microscopico. Il numero di campioni positivi per Ancylostoma spp. è stato di 833 (frequenza del 78,95%) e di 222 (21,04%) per T. canis. Questi risultati illustrano l'importanza di identificare gli elminti zoonotici nei cani che vivono in aree urbane e rurali in Messico utilizzando una tecnica coproparassitoscopica in laboratorio e in condizioni di campo.

Introduzione

I parassiti gastrointestinali sono uno dei problemi di salute più comuni che colpiscono i cani¹. Le stime suggeriscono che ci sono ~ 700 milioni di cani domestici in tutto il mondo e circa 175 milioni possono essere classificati come free-roaming². Più di 60 specie di parassiti sono condivise tra cani ed esseri umani, suggerendo che i cani potrebbero essere una fonte di infezione per gli esseri umani con questi parassiti³. Toxocara canis e Ancylostoma caninum sono due specie parassitarie che infettano i cani e, accidentalmente, gli ospiti umani. Attualmente, ci sono diversi studi sui luoghi in cui questi elminti sono in grado di sopravvivere e riprodursi in Messico. La prevalenza di Toxocara nei cani varia dallo 0% a oltre l'87% negli Stati Uniti, in Messico, in America Centrale e nei Caraibi⁴. Toxocara canis e Ancylostoma spp., così come altre specie parassitarie nei cani, sono state precedentemente segnalate in Messico 5,6,7,8,9,10,11,12,13 (Tabella 1).

Specie parassite	Regione	Prevalenza (%)	Riferimento
Ancylostoma caninum	cantone di Querétaro	42.90	5
	Tabasco	15.90	6
	Campeche	35.7 – 42.9	7
	Yucatán	73.8	8
Babesia	Morelos	13.60	9
	Veracruz	10.00
Oocisti cocciidee	Yucatán	2.30	8
Ctenocefaluridi	Morelos	30.3	10
Caninum di Dipylidium	Yucatán	2.30	8
Dirofilaria	Yucatán	7.0 – 8.3	11
Giardia	Tabasco	3.00	6
	Yucatán	18.8	8
Leishmania	Chiapas	19.00	12
Tenie	Bassa California	6.79	13
Canis di Toxocara	cantone di Querétaro	22.10	5
	Yucatán	6.20	8
Vulpis di Trichuris	Yucatán	25.40	8
Trypanosoma	Jalisco	8.10	9
	Campeche	7.60
	Chiapas	4.5 – 42.8
	Quintana Roo	20.1 – 21.3
	Toluca	17.50
	Yucatán	9.8 – 34

Tabella 1: Prevalenza regionale (%) dei parassiti del cane in Messico dal 2001 al 2020. I risultati di precedenti indagini condotte dal 2001 al 2020 hanno permesso di identificare la distribuzione dei parassiti canini in diversi contesti urbani e rurali in Messico. Questi studi forniscono una profonda comprensione degli elementi epidemiologici che favoriscono la persistenza dei parassiti canini in diversi ecosistemi, contribuendo a una valutazione completa dell'impatto zoonotico di alcune specie di parassiti.

Le fasi del ciclo di vita dei parassiti intestinali, come uova, cisti, oocisti o larve, possono essere trovate in campioni di feci. Pertanto, l'esame del materiale fecale fornisce informazioni preziose sui parassiti di un animale. La necessità di un metodo per rilevare le uova di Ancylostomidae nelle feci umane ha portato all'uso del semplice striscio fecale nel 1878, che è stato utilizzato per molti anni per rilevare i parassiti gastrointestinali ma è stato considerato poco sensibile. Da qui è emersa la necessità di sviluppare metodi copromicroscopici migliori¹⁴. Sono passati più di 100 anni da quando è stata descritta per la prima volta la tecnica di flottazione per il recupero e il conteggio delle uova di parassita nei campioni fecali¹⁵. Da allora, diversi metodi e varianti della tecnica di flottazione sono stati considerati uno standard per il rilevamento di alcuni parassiti nei loro ospiti.

Ad esempio, Lane descrisse un metodo nel 1924 che coinvolgeva la tecnica di flottazione centrifuga diretta, che integra la centrifugazione seguita dal galleggiamento del sedimento in una soluzione satura di cloruro di sodio con SpG 1,2 in 1 g (Lane) o 10 g (modifica di Stoll). La tecnica di flottazione è stata successivamente modificata utilizzando soluzioni con diversi SpG¹⁴. Nel 1939, Gordon e Whitlock riportarono gli svantaggi della tecnica di Stoll a causa dell'interferenza dei detriti nella visualizzazione delle uova del parassita e svilupparono il metodo quantitativo noto come McMaster¹⁶. Nel 1979, O'Grady e Slocombe dimostrarono che il peso specifico della soluzione, la tempistica e le dimensioni delle maglie dei filtri influenzano l'accuratezza del rilevamento delle uova utilizzando la tecnica di flottazione¹⁷. Negli ultimi decenni, poiché sono state apportate diverse modifiche alla tecnica di flottazione, c'è un urgente bisogno di standardizzare i metodi di flottazione. Attualmente, il rilevamento delle infezioni da elminti canini nel contesto della prevenzione dei parassiti zoonotici è necessario per applicare trattamenti antielmintici appropriati per limitare la contaminazione ambientale con stadi infettivi di nematodi zoonotici¹⁸.

Tra i metodi qualitativi, la tecnica di flottazione fecale è ampiamente utilizzata e accettata perché non richiede molta attrezzatura, è semplice, economica e riproducibile; Tuttavia, ha un grosso svantaggio in quanto manca di sensibilità quando l'intensità dell'infezione è bassa¹⁹. La capacità di rivelare la presenza di un maggior numero di elementi parassiti come uova, oocisti, cisti o larve di nematodi è solitamente determinata dalla densità della soluzione²⁰.

Rapporti precedenti hanno confrontato le tecniche coproparassitologiche per il rilevamento delle uova di nematodi canini. Per quanto riguarda l'individuazione dei protozoi mobili, si ricorre a strisci fecali diretti; mentre i metodi di sedimentazione sono utili per diagnosticare uova pesanti di parassiti come i trematodi²¹. Uno dei test diagnostici sul campo più utilizzati è il metodo dello striscio fecale. Tuttavia, il basso livello di sensibilità di questa tecnica può essere attribuito al fatto che contiene detriti che interferiscono con il rilevamento delle uova del parassita. Incorporando una fase di setacciatura insieme a soluzioni che forniscono il corretto SpG, il metodo di flottazione offre un'osservazione più chiara e meno ingombrante delle uova di ascaridi e anchilostomi. Ciò porta a un processo più preciso ed efficiente per lo screening microscopico²². Allo stesso modo, le tecniche di flottazione semplice e centrifuga diretta sono molto comunemente utilizzate per recuperare uova e oocisti parassite¹⁴. I metodi di flottazione classici possono essere considerati qualitativi o quantitativi a seconda dell'utilizzo di una camera di conteggio come il metodo McMaster¹⁵. Tuttavia, poiché la tecnica di flottazione ha una bassa sensibilità e si concentra sull'individuazione di parassiti nel periodo di brevetto, i risultati negativi non dovrebbero essere considerati conclusivi. Tuttavia, l'accuratezza non dipende solo dalla procedura di conservazione dei campioni fecali o dalla SpG delle soluzioni di flottazione, ma dipende anche dalla competenza tecnica e dall'esperienza nell'esecuzione di esami fecali dell'utente.

Di conseguenza, sono stati esplorati altri metodi per il rilevamento di parassiti canini nelle feci. È stato generalmente riconosciuto che uno degli approcci più utilizzati per la diagnosi delle infezioni intestinali da elminti nei cani è la tecnica FLOTAC, un metodo polivalente, sensibile e accurato che fornisce risultati accurati e affidabili per la diagnosi di A. caninum nei cani rispetto a un protocollo di galleggiamento in provetta e alla tecnica McMaster^{19, 23}. I metodi di sedimentazione sono utili per recuperare le uova di trematode, le uova di nematodi embrionati e la maggior parte delle uova di tenia, che non possono essere recuperate sulla superficie di una soluzione di flottazione perché queste strutture non galleggiano²⁴. Un metodo che si è dimostrato superiore alle tecniche di flottazione/sedimentazione è il metodo di flottazione a doppia centrifuga modificata, in quanto consente di rilevare le uova di cestodi nelle feci, è meno dispendioso in termini di tempo, separa le uova di Anoplocephala dai detriti fecali e riduce la cristallizzazione²⁵. Inoltre, questa tecnica è stata utilizzata con successo per rilevare uova ascaridi con elevata sensibilità²⁶. Tuttavia, alcune di queste tecniche e metodi centrifughi come l'Ovassay, al contrario del protocollo di flottazione che proponiamo in questo studio, richiedono la conservazione del campione in reagenti come la formalina, kit commerciali, l'elaborazione del campione in condizioni di laboratorio e l'uso di reagenti come il solfato di zinco²⁷ che sono costosi e richiedono speciali procedure di smaltimento per evitare la tossicità ambientale.

Recentemente è stato favorito l'uso di tecniche che aumentano la sensibilità del metodo di flottazione aggiungendo soluzioni ad alto SpG. Tuttavia, bisogna considerare che lo svantaggio di queste soluzioni è l'aumento dei detriti nella preparazione finale e quindi il rilevamento impreciso delle uova del parassita. Inoltre, la disponibilità commerciale di materiali, reagenti, costi, problemi di impatto ambientale e difficoltà di utilizzo dei metodi centrifughi influenzano la selezione di una tecnica di flottazione¹⁴, che può essere impegnativa in condizioni di campo in contrasto con il protocollo che presentiamo in questo lavoro. La preparazione delle soluzioni di flottazione con sale da cucina è vantaggiosa rispetto all'utilizzo dello zucchero perché in condizioni di campo, lo zucchero attira insetti come vespe e api e le preparazioni diventano appiccicose. Inoltre, soluzioni come il fenolo, che viene aggiunto alle soluzioni zuccherine per evitare l'appiccicosità, o lo ZnSO₄sono complesse da scartare correttamente secondo le linee guida sulla protezione ambientale e non possono essere smaltite sul campo; a differenza di una soluzione di sale da cucina.

L'obiettivo di questo manoscritto è quello di dimostrare i passaggi per rilevare le uova di T. canis e Ancylostoma spp. in campioni fecali utilizzando un adattamento della tecnica di flottazione semplice in condizioni di campo e di laboratorio. Seguendo il protocollo qui descritto e utilizzando un microscopio con una batteria di riserva, la diagnosi di questi parassiti zoonotici canini nelle aree rurali e suburbane è possibile quando non sono disponibili attrezzature e infrastrutture di laboratorio. Il semplice metodo di flottazione descritto in questo lavoro può fornire risultati rapidi ed è una tecnica non invasiva ed economica per lo screening di routine.

Protocollo

L'uso e la cura dei cani è stato approvato dall'Università Nazionale e Autonoma del Messico.

1. Raccolta di campioni fecali

NOTA: Maneggiare il cane con l'aiuto di un veterinario o del proprietario dell'animale.

1. Nel caso di cani selvatici (Figura 1A) o animali nervosi, raccogliere campioni da terra subito dopo la defecazione o non più di 10 minuti dopo.
2. Lubrificare i guanti chirurgici o i sacchetti di polietilene a parete sottile con acqua o vaselina. Per raccogliere campioni fecali dal retto, indossare guanti chirurgici o sacchetti di polietilene a parete sottile.
3. Raccogli almeno 2 g di feci da ogni cane (Figura 1B).
4. Identifica i singoli campioni fecali come segue: data, posizione (coordinate GPS (Global Positioning System) utilizzando Google Maps), assegna un numero di identificazione per ogni animale, età approssimativa del cane, sesso del cane, razza, cane da interno o da esterno (selvatico).
5. Chiudere le sacche contenenti il campione fecale con un nodo stretto. Conservare le sacche in frigorifero (4-8 °C) se i campioni di feci non vengono analizzati entro 3-4 ore dalla raccolta.

2. Preparazione di una soluzione salina satura per la diagnosi in campo

NOTA: Se l'accesso a una bilancia, a un materiale di misurazione, a fornelli o a gas per far bollire l'acqua è assente o limitato, la soluzione salina satura può essere facilmente preparata utilizzando acqua, sale da cucina comune, una tazza di plastica da 12 once (355 ml) e una bottiglia vuota di plastica soda da 1 litro.

1. Lavare accuratamente una bottiglia di soda vuota da 1 L. Riempi la bottiglia con 1 L d'acqua.
2. Riempi un bicchiere di plastica da 12 once con sale da cucina comune.
3. Trasferisci il sale nella bottiglia di soda.
4. Chiudere bene la bottiglia di soda con il tappo a vite. Agitare energicamente la soluzione fino a quando il sale non si scioglie più.
   NOTA: Agitare la soluzione nella bottiglia di soda fino alla completa dissoluzione del sale può richiedere fino a 90 minuti.

3. Preparazione di una soluzione salina satura per la diagnosi di laboratorio

1. Pesare 420 g di sale da cucina.
2. Sciogliere 420 g di sale in 1 L di acqua.
3. Far bollire la soluzione fino a quando non si scioglie più il sale.
4. Filtrare la soluzione per eliminare il sale non disciolto.
5. Controllare la concentrazione della soluzione utilizzando un idrometro per fluidi pesanti o un densitometro.
   NOTA: La concentrazione ideale ha un SpG di 1,20 per ottenere risultati migliori (Figura 2A). La capacità di galleggiamento di un uovo è influenzata dalla sua interazione con la soluzione, contribuendo alla diversa capacità delle uova di galleggiare in soluzioni con lo stesso peso specifico. Pertanto, per ottenere un recupero ottimale delle uova, è essenziale considerare l'intervallo superiore di peso specifico nella soluzione di flottazione, assicurandosi che superi quello degli elementi parassiti bersaglio⁶.

4. Metodo di flottazione

NOTA: Se i campioni fecali sono troppo secchi o duri, macerarli in un mortaio.

1. Usando un cucchiaio, metti circa 3 g di feci in un bicchiere di plastica (~8,5 cm di altezza e ~5,5 cm di diametro).
2. Aggiungere 1 mL della soluzione salina satura fino ad ottenere una pasta.
3. Mescolare per 1 minuto e aggiungere 100 ml di soluzione salina satura.
4. Passare questa sospensione attraverso un colino di plastica in un secondo bicchiere di plastica per evitare particelle grossolane (Figura 2B).
5. Lasciare riposare la sospensione per 15-20 minuti.
6. Posizionare un'ansa di inoculazione in una fiamma per 1 s per assicurarsi che sia priva di uova, cisti o oocisti (Figura 2C).
7. Attendere 5 secondi affinché il circuito di inoculazione si raffreddi (Figura 2D).
8. Prelevare tre gocce dalla superficie della sospensione con l'ansa di inoculazione. Posizionare ciascuna delle tre gocce separatamente su un vetrino (Figura 2E-G)
   NOTA: Assicurarsi che le gocce non siano a contatto tra loro (Figura 2H).
9. Osservare al microscopio con un obiettivo 10x (Figura 2I). Posizionare un vetrino coprioggetto se l'ingrandimento è aumentato a 40x.
10. Quando si osserva un risultato positivo nella gocciolina, assegnare una croce (+) nel registro di laboratorio per registrare la presenza di parassiti nel periodo di brevetto in siti casuali della superficie di sospensione fecale.

5. Interpretazione del metodo di flottazione

NOTA: I risultati negativi sono inconcludenti.

1. Eseguire una serie di tre test con campioni di 3 giorni consecutivi per aumentare la sensibilità del test.
   NOTA: I risultati positivi indicano la presenza di parassiti nel periodo di brevetto.

Risultati

In questo lavoro vengono descritte le procedure di raccolta e coproparassitoscopiche per l'identificazione di T. canis e Ancylostoma spp. La logica alla base dell'adattamento del semplice metodo di flottazione fecale per rilevare le uova di elminti canini è che questa tecnica è conveniente in quanto le soluzioni, le attrezzature e i materiali sono poco costosi. Pertanto, il metodo ha un'elevata capacità di gestione dei campioni in quanto è possibile processare più campioni in un breve periodo. Inol...

Discussione

I nematodi come T. canis e Ancylostoma spp. possono abitare l'intestino tenue dei cani e hanno il potenziale per essere trasmessi all'uomo. I segni clinici causati da T. canis sono gravi nei cani giovani e si manifestano con scarsa crescita, problemi respiratori o lesioni del tratto digestivo²⁸. Nei cani adulti, l'infezione tende in genere ad essere lieve. La diagnosi si basa sull'identificazione delle uova caratteristiche in un campione fecale. Questa condizione è una ...

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