Простой метод фекальной флотации для диагностики зоонозных нематод в полевых и лабораторных условиях

Резюме

В данной работе описывается использование флотационного метода для идентификации Toxocara canis и Ancylostoma spp., обнаруженных в образцах фекалий, взятых у собак в Мексике в период с 2017 по 2021 год в полевых условиях.

Аннотация

Диагностика собачьих паразитов с зоонозным потенциалом, таких как Toxocara canis и Ancylostoma caninum, в полевых условиях, как правило, затруднена из-за ограниченного доступа к лабораториям в сельских и пригородных районах Мексики. Это исследование было направлено на обнаружение T. canis и Ancylostoma spp. в образцах фекалий, собранных у собак в Мексике с 2017 по 2021 год в полевых условиях. Расчет размера выборки привел к целевому набору 534 собак по всей стране.

Образцы собирали непосредственно из прямой кишки или земли после дефекации. Образцы хранили в индивидуальных, плотно закрытых, полиэтиленовых пакетах при температуре 4 °С. Насыщенный раствор хлорида натрия (удельный вес [SpG] 1,20) готовили как в полевых, так и в лабораторных условиях. В течение 3 суток после сбора 2-4 г кала исследовали на паразитов флотационным методом путем суспендирования каждого образца фекалий в физиологическом растворе. Фекалии смешивали со флотационным раствором и измельчали с помощью металлической ложки.

После достижения однородной консистенции образец кала пересыпали в новый пластиковый стаканчик с помощью сита и оставляли на 10-15 минут. Три капли с верхней части смеси собирали с помощью стерилизованной инокуляционной петли. Предметные стекла помещали на микроскоп, а паразитов идентифицировали обученные паразитологи. Образцы фекалий 1055 собак были исследованы под микроскопом. Количество положительных проб для Ancylostoma spp. составило 833 (78,95% частоты) и 222 (21,04%) для T. canis. Эти результаты иллюстрируют важность выявления зоонозных гельминтов у собак, живущих в городских и сельских районах Мексики, с использованием копропаразитоскопического метода в лаборатории и в полевых условиях.

Введение

Желудочно-кишечные паразиты являются одной из наиболее распространенных проблем со здоровьем, которые поражают собак¹. По оценкам, во всем мире насчитывается ~700 миллионов домашних собак, и примерно 175 миллионов из них могут быть отнесены к категории свободно^{гуляющих.} Более 60 видов паразитов являются общими для собак и людей, что позволяет предположить, что собаки могут быть источником инфекции для людей этими^{паразитами.} Toxocara canis и Ancylostoma caninum — два паразитических вида, которые заражают собак и, случайно, людей-хозяев. В настоящее время существует несколько исследований о местах, где эти гельминты способны выживать и размножаться в Мексике. Распространенность токсокары у собак колеблется от 0% до более чем 87% в США, Мексике, Центральной Америке и странах Карибского бассейна⁴. Toxocara canis и Ancylostoma spp., а также другие виды паразитов у собак ранее были зарегистрированы в Мексике 5,6,7,8,9,10,11,12,13 (табл. 1).

Паразитические виды	Область	Распространенность (%)	Ссылка
Анкилостома собачья (Ancylostoma caninum)	Querétaro	42.90	5
	Табаско	15.90	6
	Кампече	35.7 – 42.9	7
	Юкатан	73.8	8
Бабезия	Морелос	13.60	9
	Веракрус	10.00
Кокцидиальные ооцисты	Юкатан	2.30	8
Гребневики	Морелос	30.3	10
Дипилидиум (Dipylidium caninum)	Юкатан	2.30	8
Дирофилярия	Юкатан	7.0 – 8.3	11
Лямблии	Табаско	3.00	6
	Юкатан	18.8	8
Лейшмания	Чьяпас	19.00	12
Цепней	Нижняя Калифорния	6.79	13
Токсокара собачья (Toxocara canis)	Querétaro	22.10	5
	Юкатан	6.20	8
Трихурис вульпис (Trichuris vulpis)	Юкатан	25.40	8
Трипаносома	Халиско	8.10	9
	Кампече	7.60
	Чьяпас	4.5 – 42.8
	Кинтана-Роо	20.1 – 21.3
	Толука	17.50
	Юкатан	9.8 – 34

Таблица 1: Региональная распространенность (%) паразитов собак в Мексике с 2001 по 2020 гг. Результаты предыдущих исследований, проведенных с 2001 по 2020 год, позволили выявить распространение собачьих паразитов в нескольких городских и сельских районах Мексики. Эти исследования обеспечивают глубокое понимание эпидемиологических элементов, способствующих персистенции собачьих паразитов в различных экосистемах, способствуя комплексной оценке зоонозного воздействия некоторых видов паразитов.

Стадии жизненного цикла кишечных паразитов, таких как яйца, цисты, ооцисты или личинки, могут быть обнаружены в образцах стула. Таким образом, исследование фекального материала дает ценную информацию о паразитах животного. Потребность в методе обнаружения яиц Ancylostomidae в фекалиях человека привела к тому, что в 1878 году был использован простой мазок кала, который в течение многих лет использовался для обнаружения желудочно-кишечных паразитов, но считался не очень чувствительным. Таким образом, возникла необходимость в разработке более совершенных копромикроскопических методов¹⁴. Прошло более 100 лет с тех пор, как была впервые описана флотационная методика извлечения и подсчета яиц паразитов в образцах фекалий¹⁵. С тех пор несколько методов и вариантов флотационной техники считаются стандартными для обнаружения некоторых паразитов в их хозяевах.

Например, в 1924 году Лейн описал метод, включающий метод прямой центробежной флотации, который включает центрифугирование с последующим всплытием осадка в насыщенном растворе хлорида натрия с SpG 1,2 в 1 г (Лейн) или 10 г (модификация Столла). Впоследствии метод флотации был модифицирован за счет использования растворов с различными SpG¹⁴. В 1939 году Гордон и Уитлок сообщили о недостатках метода Столла из-за помех от детрита при визуализации яиц паразитов и разработали количественный метод, известный как McMaster¹⁶. В 1979 г. О'Грэйди и Слокомб продемонстрировали, что удельный вес раствора, время и размеры ячеек сетчатых фильтров влияют на точность обнаружения яиц с помощью метода флотации¹⁷. В последние десятилетия в связи с тем, что в технику флотации был внесен ряд изменений, возникла острая необходимость в стандартизации методов флотации. В настоящее время выявление гельминтозов собак в контексте профилактики зоонозных паразитов требует применения соответствующих антигельминтных препаратов для ограничения загрязнения окружающей среды инфекционными стадиями зоонозных нематод¹⁸.

Среди качественных методов широко используется и принимается метод фекальной флотации, поскольку он не требует большого количества оборудования, прост, недорог и воспроизводим; Тем не менее, у него есть существенный недостаток, заключающийся в том, что ему не хватает чувствительности при низкой интенсивности инфекции¹⁹. Способность выявлять наличие большего числа паразитарных элементов, таких как яйца, ооцисты, цисты или личинки нематод, обычно определяется плотностью раствора²⁰.

В предыдущих отчетах сравнивались копропаразитологические методы обнаружения яиц собачьей нематоды. Что касается выявления подвижных простейших, то используют прямые мазки кала; В то время как методы седиментации полезны для диагностики тяжелых яиц паразитов, таких как трематоды²¹. Одним из наиболее широко используемых полевых диагностических тестов является метод мазка кала. Однако низкий уровень чувствительности этого метода можно объяснить тем, что он содержит мусор, который мешает обнаружению яиц паразитов. Благодаря включению этапа просеивания вместе с растворами, обеспечивающими надлежащий SpG, метод флотации обеспечивает более четкое и менее загроможденное наблюдение за яйцами аскарид и анкилостомоз. Это приводит к более точному и эффективному процессу микроскопического скрининга²². Кроме того, для извлечения яиц паразитов и ооцист очень часто используются методы простой флотации и прямой центробежной флотации¹⁴. Классические методы флотации можно считать качественными или количественными в зависимости от использования счетной камеры, такой как метод Макмастера¹⁵. Тем не менее, поскольку метод флотации имеет низкую чувствительность и ориентирован на обнаружение паразитов в период действия патента, отрицательные результаты не следует считать окончательными. Однако точность зависит не только от процедуры консервации образцов фекалий или SpG флотационных растворов, но и от технической квалификации и опыта проведения фекальных исследований пользователя.

Следовательно, были изучены другие методы обнаружения собачьих паразитов в фекалиях. Общепризнано, что одним из наиболее широко используемых подходов к диагностике кишечных гельминтозов у собак является метод FLOTAC, поливалентный, чувствительный и точный метод, который дает точные и надежные результаты для диагностики A. caninum у собак по сравнению с протоколом флотации в пробирке и методом Макмастера^{19. 23}. См. Методы седиментации полезны для извлечения яиц сосальщиков, эмбриональных яиц нематод и большинства яиц ленточных червей, которые не могут быть извлечены на поверхности флотационного раствора, поскольку эти структуры не всплывают²⁴. Одним из методов, который, как было доказано, превосходит методы флотации/седиментации, является модифицированный метод двойной центробежной флотации, поскольку он позволяет обнаруживать цестодные яйца в фекалиях, занимает меньше времени, отделяет яйца Anoplocephala от фекальных остатков и снижает кристаллизацию²⁵. Более того, эта методика успешно используется для обнаружения яиц аскарид с высокой чувствительностью²⁶. Тем не менее, некоторые из этих вышеупомянутых методов и центробежных методов, таких как Ovassay, в отличие от протокола флотации, который мы предлагаем в этом исследовании, требуют консервации образцов в реагентах, таких как формалин, коммерческие наборы, обработки образцов в лабораторных условиях и использования реагентов, таких как сульфат цинка²⁷, которые являются дорогостоящими и требуют специальных процедур утилизации, чтобы избежать токсичности для окружающей среды.

В последнее время предпочтение отдается методам, повышающим чувствительность флотационного метода путем добавления растворов с высоким SpG. Однако необходимо учитывать, что недостатком этих растворов является увеличение мусора в конечном приготовлении и, следовательно, неточное обнаружение яиц паразитов. Кроме того, коммерческая доступность материалов, реагентов, стоимость, вопросы воздействия на окружающую среду и сложность использования центробежных методов влияют на выбор метода флотации¹⁴, который может быть сложным в полевых условиях в отличие от протокола, который мы представляем в этой работе. Приготовление флотационных растворов с поваренной солью имеет преимущество перед утилизацией сахара, так как в полевых условиях сахар привлекает насекомых, таких как осы и пчелы, и препараты становятся липкими. Кроме того, такие растворы, как фенол, который добавляется в растворы сахара, чтобы избежать липкости, или ZnSO₄, сложно правильно утилизировать в соответствии с рекомендациями по охране окружающей среды, и их нельзя утилизировать в полевых условиях; В отличие от раствора поваренной соли.

Целью данной статьи является демонстрация этапов обнаружения яиц T. canis и Ancylostoma spp. в образцах фекалий с использованием адаптации простого флотационного метода в полевых и лабораторных условиях. В соответствии с описанным протоколом и с использованием микроскопа с резервным аккумулятором диагностика этих зоонозных паразитов собак в сельской и пригородной местности возможна при отсутствии лабораторного оборудования и инфраструктуры. Простой метод флотации, описанный в этой работе, может обеспечить быстрые результаты и является неинвазивным и экономически эффективным методом рутинного скрининга.

протокол

Использование и уход за собаками были одобрены Национальным и автономным университетом Мексики.

1. Забор образцов кала

ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте собаку с помощью ветеринара или владельца животного.

1. В случае одичавших собак (рис. 1А) или нервных животных образцы с земли следует брать сразу после дефекации или не более чем через 10 минут.
2. Смажьте хирургические перчатки или тонкостенные полиэтиленовые пакеты водой или вазелином. Для забора образцов кала из прямой кишки надевайте хирургические перчатки или тонкостенные полиэтиленовые пакеты.
3. Соберите не менее 2 г фекалий с каждой собаки (рисунок 1Б).
4. Определите отдельные образцы фекалий следующим образом: дата, местоположение (координаты глобальной системы позиционирования [GPS] с помощью Google Maps), присвойте идентификационный номер для каждого животного, приблизительный возраст собаки, пол собаки, породу, домашнюю или уличную (дикую) собаку.
5. Закройте пакеты, содержащие образец кала, тугим узлом. Храните пакеты в холодильнике (4-8 °C), если образцы кала не были проанализированы в течение 3-4 ч после сбора.

2. Приготовление насыщенного солевого раствора для полевой диагностики

ПРИМЕЧАНИЕ: Если доступ к весам, измерительному материалу, плите или газу для кипячения воды отсутствует или ограничен, насыщенный солевой раствор можно легко приготовить, используя воду, обычную поваренную соль, пластиковую чашку на 12 унций (355 мл) и пластиковую пустую бутылку из-под газировки объемом 1 л.

1. Тщательно вымойте пустую бутылку из-под газировки объемом 1 л. Наполните бутылку 1 л воды.
2. Наполните пластиковый стаканчик на 12 унций обычной поваренной солью.
3. Переложите соль в бутылку с газировкой.
4. Плотно закройте бутылку с газировкой завинчивающейся крышкой. Энергично встряхивайте раствор до тех пор, пока соль не перестанет растворяться.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Встряхивание раствора в бутылке с газировкой до полного растворения соли может занять до 90 минут.

3. Приготовление раствора насыщенной соли для лабораторной диагностики

1. Взвесьте 420 г поваренной соли.
2. Растворите 420 г соли в 1 л воды.
3. Кипятите раствор до тех пор, пока соль не перестанет растворяться.
4. Отфильтруйте раствор, чтобы избавиться от нерастворенной соли.
5. Проверьте концентрацию раствора с помощью ареометра тяжелой жидкости или денситометра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальная концентрация имеет SpG 1,20 для достижения лучших результатов (Рисунок 2A). На способность яйца плавать влияет его взаимодействие с раствором, что обуславливает различную способность яиц плавать в растворах с одинаковым удельным весом. Следовательно, для достижения оптимального извлечения яиц важно учитывать верхний диапазон удельного веса во флотационном растворе, гарантируя, что он превосходит удельный вес целевых паразитарных элементов⁶.

4. Флотационный метод

ПРИМЕЧАНИЕ: Если образцы фекалий слишком сухие или твердые, измельчите их в ступке.

1. С помощью ложки поместите примерно 3 г кала в один пластиковый стаканчик (~8,5 см в высоту и ~5,5 см в диаметре).
2. Добавьте 1 мл насыщенного раствора соли до получения пасты.
3. Помешиваем в течение 1 минуты и добавляем 100 мл насыщенного солевого раствора.
4. Пропустите эту суспензию через пластиковый фильтр во второй пластиковый стаканчик, чтобы избежать крупных частиц (Рисунок 2B).
5. Дать суспензии постоять 15-20 минут.
6. Поместите инокуляционную петлю в пламя на 1 с, чтобы убедиться, что в ней нет яиц, цист или ооцист (рис. 2C).
7. Подождите 5 с, пока петля посева остынет (рис. 2D).
8. Возьмите три капли с поверхности суспензии с помощью инокуляционной петли. Поместите каждую из трех капель отдельно на одно предметное стекло (Рисунок 2E-G)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что капли не соприкасаются друг с другом (Рисунок 2H).
9. Наблюдение под микроскопом с помощью 10-кратного объектива (рис. 2I). Разместите покровное стекло, если увеличение увеличено до 40x.
10. При наблюдении положительного результата в капле ставят крестик (+) в лабораторном журнале для фиксации наличия паразитов в патентный период в случайных участках поверхности фекальной суспензии.

5. Интерпретация метода флотации

ПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательные результаты не являются окончательными.

1. Выполните серию из трех тестов с образцами в течение 3 дней подряд, чтобы повысить чувствительность теста.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Положительные результаты свидетельствуют о наличии паразитов в патентном периоде.

Результаты

В данной работе описаны коллекционные и копаразитоскопические процедуры для идентификации T. canis и Ancylostoma spp. Обоснование адаптации простого метода фекальной флотации для обнаружения яиц собачьих гельминтов заключается в том, что этот метод является экономически эффективным,...

Обсуждение

Нематоды, такие как T. canis и Ancylostoma spp., могут обитать в тонком кишечнике собак и потенциально передаваться человеку. Клинические признаки, вызванные T. canis , являются серьезными у молодых собак, проявляясь в виде замедленного роста, проблем с дыханием или поражений пищеварите...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 x 1.2 V AA rechargeable batteries	Energizer		Sold in retail stores
Bunsen burner	Viresa	FER-M224
Disposable 12-oz glass cup	Uline Mexico	S-22275	Sold in retail stores
Glass slides	Velab, Mexico	VEP-P20
Inoculating loop	VelaQuin, Mexico	CRM-5010PH
Light Microscope	VelaQuin, Mexico	VE-B2
Lighter	Bic	J25	Sold in retail stores
One plastic cup (12 oz)	Amazon	ASIN B08C2CRHSH	Can be any kitchen plastic reuseable cup
Plastic cups  (size of a dice or urine sample cup) diameter 5.5 cm and height 8.5 cm, two cups	Amazon	Layhit-Containers-ZYHD192919	Can be any kitchen plastic reuseable cup
Plastic strainer 10 cm	Ecko	ASIN B00TUAAVWI	Can be any kitchen plastic strainer
Soda bottle	Coca-Cola	1-liter	Sold in retail stores
Spoon	Amazon Basics	ASIN B00TUAAVWI	Can be any kitchen spoon
Table salt	La Fina		Sold in retail stores