Méthode simple de flottation fécale pour diagnostiquer les nématodes zoonotiques sur le terrain et en laboratoire

Résumé

Ce travail décrit l’utilisation d’une méthode de flottation pour identifier Toxocara canis et Ancylostoma spp. détectés dans des échantillons fécaux prélevés sur des chiens au Mexique de 2017 à 2021 dans des conditions de terrain.

Résumé

Le diagnostic des parasites canins à potentiel zoonotique tels que Toxocara canis et Ancylostoma caninum sur le terrain est généralement difficile en raison de l’accès limité à un laboratoire dans les zones rurales et suburbaines du Mexique. Cette étude visait à détecter T. canis et Ancylostoma spp. dans des échantillons fécaux prélevés sur des chiens au Mexique de 2017 à 2021 dans des conditions de terrain. Le calcul de la taille de l’échantillon a abouti à un recrutement cible de 534 chiens à travers le pays.

Les échantillons ont été prélevés directement dans le rectum ou le sol après la défécation. Les échantillons ont été stockés dans des sacs en plastique individuels hermétiquement fermés à 4 °C. Une solution saturée de chlorure de sodium (densité [SpG] 1,20) a été préparée sur le terrain et en laboratoire. Dans les 3 jours suivant la collecte, 2 à 4 g de matières fécales ont été testés pour détecter les parasites à l’aide d’une méthode de flottation en suspendant chaque échantillon fécal dans une solution saline. Les matières fécales ont été mélangées à la solution de flottation et écrasées à l’aide d’une cuillère en métal.

Une fois la consistance uniforme obtenue, l’échantillon fécal a été versé dans un nouveau gobelet en plastique à l’aide d’un tamis et laissé reposer pendant 10 à 15 minutes. Trois gouttes du haut du mélange ont été prélevées à l’aide d’une boucle d’inoculation stérilisée. Les lames ont été placées sur le microscope et les parasites ont été identifiés par des parasitologues qualifiés. Des échantillons fécaux de 1 055 chiens ont été examinés au microscope. Le nombre d’échantillons positifs pour Ancylostoma spp. était de 833 (fréquence de 78,95 %) et de 222 (21,04 %) pour T. canis. Ces résultats illustrent l’importance d’identifier les géohelminthes zoonotiques chez les chiens vivant dans les zones urbaines et rurales du Mexique en utilisant une technique coproparasitoscopique en laboratoire et sur le terrain.

Introduction

Les parasites gastro-intestinaux sont l’un des problèmes de santé les plus courants qui affectent les chiens¹. Les estimations suggèrent qu’il y a ~700 millions de chiens domestiques dans le monde, et environ 175 millions peuvent être classés comme en liberté². Plus de 60 espèces de parasites sont partagées entre les chiens et les humains, ce qui suggère que les chiens pourraient être une source d’infection pour les humains par ces parasites³. Toxocara canis et Ancylostoma caninum sont deux espèces parasites qui infectent les chiens et, accidentellement, les hôtes humains. Actuellement, il existe plusieurs études sur les endroits où ces helminthes sont capables de survivre et de se reproduire au Mexique. La prévalence de Toxocara chez les chiens varie de 0 % à plus de 87 % aux États-Unis, au Mexique, en Amérique centrale et dans les Caraïbes⁴. Toxocara canis et Ancylostoma spp., ainsi que d’autres espèces parasites chez les chiens, ont déjà été signalés au Mexique 5,6,7,8,9,10,11,12,13 (tableau 1).

Espèces parasites	Région	Prévalence (%)	Référence
Ancylostoma caninum	Querétaro	42.90	5
	Tabasco	15.90	6
	Campeche	35.7 – 42.9	7
	Le Yucatán	73.8	8
Babesia	Morelos	13.60	9
	Veracruz	10.00
Oocystes coccidiens	Le Yucatán	2.30	8
Ctenocephalides	Morelos	30.3	10
Dipylidium caninum	Le Yucatán	2.30	8
Dirofilaria	Le Yucatán	7.0 – 8.3	11
Giardia	Tabasco	3.00	6
	Le Yucatán	18.8	8
Leishmania	Chiapas	19.00	12
Ténias	Basse-Californie	6.79	13
Toxocara canis	Querétaro	22.10	5
	Le Yucatán	6.20	8
Trichuris vulpis	Le Yucatán	25.40	8
Trypanosoma	Jalisco	8.10	9
	Campeche	7.60
	Chiapas	4.5 – 42.8
	Quintana Roo	20.1 – 21.3
	Toluca	17.50
	Le Yucatán	9.8 – 34

Tableau 1 : Prévalence régionale (%) des parasites canins au Mexique de 2001 à 2020. Les résultats d’enquêtes antérieures menées de 2001 à 2020 ont permis d’identifier la distribution des parasites canins dans plusieurs milieux urbains et ruraux au Mexique. Ces études permettent de comprendre en profondeur les éléments épidémiologiques propices à la persistance des parasites canins dans différents écosystèmes, contribuant ainsi à une évaluation complète de l’impact zoonotique de certaines espèces parasitaires.

Les stades du cycle de vie des parasites intestinaux, tels que les œufs, les kystes, les oocystes ou les larves, peuvent être trouvés dans les échantillons de selles. Ainsi, l’examen des matières fécales fournit des informations précieuses sur les parasites d’un animal. Le besoin d’une méthode pour détecter les œufs d’Ancylostomidae dans les excréments humains a conduit à l’utilisation du simple frottis fécal en 1878, qui a été utilisé pendant de nombreuses années pour détecter les parasites gastro-intestinaux mais était considéré comme peu sensible. Ainsi, le besoin s’est fait sentir de développer de meilleures méthodes copromicroscopiques¹⁴. Plus de 100 ans se sont écoulés depuis que la technique de flottation pour récupérer et compter les œufs de parasites dans les échantillons fécaux a été décrite pour la première fois¹⁵. Depuis lors, plusieurs méthodes et variantes de la technique de flottation ont été considérées comme un standard pour la détection de certains parasites chez leurs hôtes.

Par exemple, Lane a décrit en 1924 une méthode impliquant la technique de flottation centrifuge directe, qui intègre la centrifugation suivie de la flottaison du sédiment dans une solution saturée de chlorure de sodium avec SpG 1,2 dans 1 g (Lane) ou 10 g (modification de Stoll). La technique de flottation a ensuite été modifiée en utilisant des solutions avec différents SpG¹⁴. En 1939, Gordon et Whitlock ont signalé les inconvénients de la technique de Stoll en raison de l’interférence des détritus dans la visualisation des œufs de parasites et ont développé la méthode quantitative connue sous le nom de McMaster¹⁶. En 1979, O’Grady et Slocombe ont démontré que la densité de la solution, le moment et la taille des mailles des crépines affectent la précision de la détection des œufs à l’aide de la technique de flottation¹⁷. Au cours des dernières décennies, plusieurs modifications ayant été apportées à la technique de flottation, il est urgent de normaliser les méthodes de flottation. Actuellement, la détection des helminthes canins dans le cadre de la prévention des parasites zoonotiques est nécessaire pour appliquer des traitements anthelminthiques appropriés afin de limiter la contamination de l’environnement par les stades infectieux des nématodes zoonotiques¹⁸.

Parmi les méthodes qualitatives, la technique de flottation fécale est largement utilisée et acceptée car elle ne nécessite pas beaucoup d’équipement, est simple, peu coûteuse et reproductible ; Pourtant, il présente un inconvénient majeur en ce sens qu’il manque de sensibilité lorsque l’intensité de l’infection est faible¹⁹. La capacité à révéler la présence d’un plus grand nombre d’éléments parasites tels que des œufs, des oocystes, des kystes ou des larves de nématodes est généralement déterminée par la densité de la solution²⁰.

Des rapports antérieurs ont comparé les techniques coproparasitologiques pour la détection des œufs de nématodes canins. En ce qui concerne la détection des protozoaires mobiles, des frottis fécaux directs sont utilisés ; tandis que les méthodes de sédimentation sont utiles pour diagnostiquer les œufs lourds de parasites tels que les trématodes²¹. L’un des tests de diagnostic sur le terrain les plus utilisés est la méthode du frottis fécal. Cependant, le faible niveau de sensibilité de cette technique peut être attribué au fait qu’elle contient des débris qui interfèrent avec la détection des œufs de parasites. En incorporant une étape de tamisage avec des solutions qui fournissent la bonne SpG, la méthode de flottation offre une observation plus claire et moins encombrée des œufs d’ascarides et d’ankylostomes. Cela conduit à un processus plus précis et plus efficace pour le criblage microscopique²². De même, les techniques simples de flottation et de flottation centrifuge directe sont très couramment utilisées pour récupérer les œufs et les oocystes de parasites¹⁴. Les méthodes de flottation classiques peuvent être considérées comme qualitatives ou quantitatives selon l’utilisation d’une chambre de comptage telle que la méthode McMaster¹⁵. Néanmoins, comme la technique de flottation a une faible sensibilité et se concentre sur la détection des parasites pendant la période du brevet, les résultats négatifs ne doivent pas être considérés comme concluants. Cependant, la précision ne dépend pas seulement de la procédure de conservation des échantillons fécaux ou de la SpG des solutions de flottation, mais aussi de la compétence technique et de l’expérience de l’utilisateur dans la réalisation d’examens fécaux.

Par conséquent, d’autres méthodes ont été explorées pour la détection des parasites canins dans les matières fécales. Il est généralement reconnu que l’une des approches les plus utilisées pour le diagnostic des helminthes intestinaux chez le chien est la technique FLOTAC, une méthode polyvalente, sensible et précise qui donne des résultats précis et fiables pour le diagnostic d’A. caninum chez le chien par rapport à un protocole de flottaison en tube et à la technique McMaster^{19, 23}. Les méthodes de sédimentation sont utiles pour récupérer les œufs de douve, les œufs de nématodes embryonnés et la plupart des œufs de ténia, qui ne peuvent pas être récupérés à la surface d’une solution de flottation car ces structures ne flottent pas²⁴. Une méthode qui s’est avérée supérieure aux techniques de flottation/sédimentation est la méthode de flottation double centrifuge modifiée, car elle permet de détecter les œufs de cestodes dans les matières fécales, prend moins de temps, sépare les œufs d’Anoplocephala des débris fécaux et diminue la cristallisation²⁵. De plus, cette technique a été utilisée avec succès pour détecter les œufs d’ascarides avec une grande sensibilité²⁶. Pourtant, certaines de ces techniques et méthodes centrifuges telles que l’Ovassay, par opposition au protocole de flottation que nous proposons dans cette étude, nécessitent la conservation des échantillons dans des réactifs tels que le formol, des kits commerciaux, le traitement des échantillons dans des conditions de laboratoire et l’utilisation de réactifs tels que le sulfate de zinc²⁷ qui sont coûteux et nécessitent des procédures d’élimination spéciales pour éviter la toxicité environnementale.

L’utilisation de techniques qui augmentent la sensibilité de la méthode de flottation en ajoutant des solutions à forte SpG a été favorisée récemment. Cependant, il faut considérer que l’inconvénient de ces solutions est l’augmentation des débris dans la préparation finale et donc la détection imprécise des œufs de parasites. De plus, la disponibilité commerciale des matériaux, des réactifs, le coût, les problèmes d’impact environnemental et la difficulté d’utilisation des méthodes centrifuges affectent le choix d’une technique de flottation¹⁴, qui peut être difficile dans des conditions de terrain contrairement au protocole que nous présentons dans ce travail. La préparation des solutions de flottation avec du sel de table est avantageuse par rapport à l’utilisation du sucre car, dans des conditions de terrain, le sucre attire les insectes tels que les guêpes et les abeilles et les préparations deviennent collantes. De plus, des solutions telles que le phénol, qui est ajouté aux solutions sucrées pour éviter l’adhérence, ou le ZnSO₄sont complexes à éliminer correctement conformément aux directives de protection de l’environnement et ne peuvent pas être éliminées sur le terrain ; contrairement à une solution de sel de table.

L’objectif de ce manuscrit est de démontrer les étapes de détection des œufs de T. canis et d’Ancylostoma spp. dans des échantillons fécaux en utilisant une adaptation de la technique de flottation simple dans des conditions de terrain et de laboratoire. En suivant le protocole décrit ci-dessous et en utilisant un microscope avec une batterie de secours, le diagnostic de ces parasites zoonotiques canins dans les zones rurales et périurbaines est possible lorsqu’aucun équipement et infrastructure de laboratoire n’est disponible. La méthode de flottation simple décrite dans ce travail peut fournir des résultats rapides et constitue une technique non invasive et rentable pour le dépistage de routine.

Protocole

L’utilisation et les soins des chiens ont été approuvés par l’Université nationale et autonome du Mexique.

1. Prélèvement d’échantillons fécaux

REMARQUE : Manipulez le chien avec l’aide d’un vétérinaire ou du propriétaire de l’animal.

1. Dans le cas de chiens sauvages (figure 1A) ou d’animaux nerveux, prélevez des échantillons au sol juste après la défécation ou pas plus de 10 minutes plus tard.
2. Lubrifiez les gants chirurgicaux ou les sacs en polyéthylène à paroi mince avec de l’eau ou de la vaseline. Pour prélever des échantillons fécaux dans le rectum, portez des gants chirurgicaux ou des sacs en polyéthylène à paroi mince.
3. Prélevez au moins 2 g d’excréments de chaque chien (figure 1B).
4. Identifiez les échantillons fécaux individuels comme suit : date, emplacement (coordonnées GPS à l’aide de Google Maps), attribution d’un numéro d’identification pour chaque animal, âge approximatif du chien, sexe du chien, race, chien d’intérieur ou d’extérieur (sauvage).
5. Fermez les sacs contenant l’échantillon fécal avec un nœud serré. Conserver les sacs au réfrigérateur (4-8 °C) si les échantillons de selles ne sont pas analysés dans les 3-4 heures suivant le prélèvement.

2. Préparation d’une solution saline saturée pour le diagnostic sur le terrain

REMARQUE : Si l’accès à une balance, à du matériel de mesure, à des cuisinières ou à du gaz pour faire bouillir de l’eau est absent ou limité, la solution saline saturée peut être facilement préparée avec de l’eau, du sel de table ordinaire, une tasse en plastique de 12 oz (355 ml) et une bouteille vide en plastique de soda de 1 L.

1. Lavez soigneusement une bouteille de soda vide de 1 L. Remplissez la bouteille avec 1 L d’eau.
2. Remplissez un gobelet en plastique de 12 oz avec du sel de table ordinaire.
3. Transférez le sel dans la bouteille de soda.
4. Fermez hermétiquement la bouteille de soda avec le bouchon à vis. Agitez vigoureusement la solution jusqu’à ce que le sel ne se dissolve plus.
   REMARQUE : Agiter la solution dans la bouteille de soda jusqu’à dissolution complète du sel peut prendre jusqu’à 90 minutes.

3. Préparation d’une solution saline saturée pour le diagnostic en laboratoire

1. Pesez 420 g de sel de table ordinaire.
2. Dissoudre 420 g de sel dans 1 L d’eau.
3. Faire bouillir la solution jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de sel.
4. Filtrer la solution pour jeter le sel non dissous.
5. Vérifier la concentration de la solution à l’aide d’un densitomètre ou d’un densitomètre à fluide lourd.
   REMARQUE : La concentration idéale a un SpG de 1,20 pour obtenir de meilleurs résultats (Figure 2A). La capacité de flottaison d’un œuf est influencée par son interaction avec la solution, ce qui contribue à la capacité variable des œufs à flotter dans des solutions ayant la même densité spécifique. Par conséquent, pour obtenir une récupération optimale des œufs, il est essentiel de prendre en compte la plage supérieure de densité dans la solution de flottation, en veillant à ce qu’elle dépasse celle des éléments parasitaires ciblés⁶.

4. Méthode de flottation

REMARQUE : Si les échantillons fécaux sont trop secs ou durs, faites-les macérer dans un mortier.

1. À l’aide d’une cuillère, placez environ 3 g d’excréments dans un gobelet en plastique (~8,5 cm de hauteur et ~5,5 cm de diamètre).
2. Ajouter 1 mL de solution saline saturée jusqu’à l’obtention d’une pâte.
3. Remuer pendant 1 min et ajouter 100 mL de solution saline saturée.
4. Passez cette suspension dans une passoire en plastique dans un deuxième gobelet en plastique pour éviter les grosses particules (Figure 2B).
5. Laissez la suspension reposer pendant 15-20 min.
6. Placez une anse d’inoculation dans une flamme pendant 1 s pour vous assurer qu’elle est exempte d’œufs, de kystes ou d’oocystes (figure 2C).
7. Attendez 5 s pour que la boucle d’inoculation refroidisse (figure 2D).
8. Prélevez trois gouttes de la surface de la suspension avec la boucle d’inoculation. Placez chacune des trois gouttes séparément sur une lame de verre (figure 2E-G)
   REMARQUE : assurez-vous que les gouttes ne sont pas en contact les unes avec les autres (Figure 2H).
9. Observez au microscope avec un objectif 10x (Figure 2I). Placez une lamelle si le grossissement est augmenté à 40x.
10. Lorsqu’un résultat positif est observé dans la gouttelette, attribuez une croix (+) dans le journal de laboratoire pour enregistrer la présence de parasites pendant la période de brevet dans des sites aléatoires de la surface de suspension fécale.

5. Interprétation de la méthode de flottation

REMARQUE : Les résultats négatifs ne sont pas concluants.

1. Effectuez une série de trois tests avec des échantillons de 3 jours consécutifs pour augmenter la sensibilité du test.
   REMARQUE : Des résultats positifs indiquent la présence de parasites pendant la période du brevet.

Résultats

Dans ce travail, les procédures de collecte et de coproparasitoscopique pour l’identification de T. canis et d’Ancylostoma spp. sont décrites. La raison de l’adaptation de la méthode simple de flottation fécale pour détecter les œufs d’helminthes canins est que cette technique est rentable car les solutions, l’équipement et les matériaux sont peu coûteux. Par conséquent, la méthode a une grande capacité de manipulation des échantillons car plusieurs échantillons peuvent être tra...

Discussion

Les nématodes tels que T. canis et Ancylostoma spp. peuvent habiter l’intestin grêle des chiens et peuvent être transmis aux humains. Les signes cliniques causés par T. canis sont graves chez les jeunes chiens, se manifestant par une mauvaise croissance, des problèmes respiratoires ou des lésions du tube digestif²⁸. Chez les chiens adultes, l’infection a généralement tendance à être bénigne. Le diagnostic repose sur l’identification d’œufs caractéris...

matériels

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