Um método simples de flutuação fecal para o diagnóstico de nematoides zoonóticos em condições de campo e laboratório

Resumo

Este trabalho descreve o uso de um método de flutuação para identificar Toxocara canis e Ancylostoma spp., detectados em amostras fecais coletadas de cães no México de 2017 a 2021 em condições de campo.

Resumo

O diagnóstico de parasitas caninos com potencial zoonótico como Toxocara canis e Ancylostoma caninum em condições de campo é geralmente difícil devido ao acesso limitado a um laboratório em áreas rurais e suburbanas no México. Este estudo teve como objetivo detectar T. canis e Ancylostoma spp em amostras fecais coletadas de cães no México de 2017 a 2021 em condições de campo. O cálculo do tamanho da amostra resultou em uma meta de inscrição de 534 cães em todo o país.

As amostras foram coletadas diretamente do reto ou do solo após a defecação. As amostras foram armazenadas em sacos plásticos individuais, hermeticamente fechados, a 4 °C. Uma solução saturada de cloreto de sódio (gravidade específica [SpG] 1,20) foi preparada em condições de campo e laboratório. Dentro de 3 dias após a coleta, 2-4 g de fezes foram testadas para parasitas usando um método de flutuação, suspendendo cada amostra fecal em uma solução salina. As fezes foram misturadas com a solução de flutuação e trituradas com uma colher de metal.

Uma vez obtida uma consistência uniforme, a amostra fecal foi vertida em um novo copo plástico usando uma peneira e deixada descansar por 10-15 min. Três gotas do topo da mistura foram coletadas usando uma alça de inoculação esterilizada. As lâminas foram colocadas no microscópio e os parasitos foram identificados por parasitologistas treinados. Amostras fecais de 1.055 cães foram triadas microscopicamente. O número de amostras positivas para Ancylostoma spp foi de 833 (78,95% de frequência) e 222 (21,04%) para T. canis. Estes resultados ilustram a importância da identificação de helmintos zoonóticos em cães que vivem em áreas urbanas e rurais no México usando uma técnica coproparasitoscópica em laboratório e em condições de campo.

Introdução

As parasitoses gastrintestinais são um dos problemas de saúde mais comuns que acometem cães¹. Estimativas sugerem que existem ~700 milhões de cães domésticos em todo o mundo, e aproximadamente 175 milhões podem ser categorizados como free-roaming². Mais de 60 espécies de parasitas são compartilhadas entre cães e humanos, sugerindo que os cães podem ser uma fonte de infecção para humanos com esses parasitas³. Toxocara canis e Ancylostoma caninum são duas espécies parasitas que infectam cães e, acidentalmente, hospedeiros humanos. Atualmente, existem vários estudos sobre os locais onde esses helmintos são capazes de sobreviver e se reproduzir no México. A prevalência de Toxocara em cães varia de 0% a mais de 87% nos Estados Unidos, México, América Central e Caribe⁴. Toxocara canis e Ancylostoma spp., assim como outras espécies parasitárias em cães, foram previamente relatadas no México 5,6,7,8,9,10,11,12,13 (Tabela 1).

Espécies parasitárias	Região	Prevalência (%)	Referência
Ancilostoma caninum	Querétaro	42.90	5
	Tabasco	15.90	6
	Campeche	35.7 – 42.9	7
	Yucatán	73.8	8
Babesia	Morelos	13.60	9
	Veracruz	10.00
Oocistos coccidianos	Yucatán	2.30	8
Ctenocefalias	Morelos	30.3	10
Dipylidium caninum |	Yucatán	2.30	8
Dirofilaria	Yucatán	7.0 – 8.3	11
Giardia	Tabasco	3.00	6
	Yucatán	18.8	8
Leishmania	Chiapas	19.00	12
Tapeworms	Baixa Califórnia	6.79	13
Toxocara canis |	Querétaro	22.10	5
	Yucatán	6.20	8
Trichuris vulpis	Yucatán	25.40	8
Trypanosoma	Jalisco	8.10	9
	Campeche	7.60
	Chiapas	4.5 – 42.8
	Quintana roo	20.1 – 21.3
	Toluca	17.50
	Yucatán	9.8 – 34

Tabela 1: Prevalência regional (%) de parasitas de cães no México de 2001 a 2020. Os resultados de investigações anteriores conduzidas de 2001 a 2020 permitiram a identificação da distribuição de parasitas caninos em vários ambientes urbanos e rurais no México. Estes estudos fornecem uma compreensão profunda dos elementos epidemiológicos favoráveis à persistência de parasitas caninos em diferentes ecossistemas, contribuindo para uma avaliação abrangente do impacto zoonótico de algumas espécies de parasitos.

Estágios do ciclo de vida de parasitas intestinais, como ovos, cistos, oocistos ou larvas podem ser encontrados em amostras de fezes. Assim, o exame do material fecal fornece informações valiosas sobre os parasitas de um animal. A necessidade de um método para detectar ovos de Ancylostomidae em fezes humanas levou ao uso do esfregaço fecal simples em 1878, que foi usado por muitos anos para detectar parasitas gastrintestinais, mas foi considerado pouco sensível. Assim, surgiu a necessidade de desenvolver melhores métodos copromicroscópicos¹⁴. Mais de 100 anos se passaram desde que a técnica de flotação para recuperação e contagem de ovos de parasitas em amostras fecais foi descrita pela primeira vez¹⁵. Desde então, vários métodos e variantes da técnica de flotação têm sido considerados um padrão para a detecção de alguns parasitas em seus hospedeiros.

Por exemplo, Lane descreveu um método em 1924 envolvendo a técnica de flotação centrífuga direta, que integra centrifugação seguida de flutuação do sedimento em uma solução saturada de cloreto de sódio com SpG 1,2 em 1 g (Lane) ou 10 g (modificação de Stoll). A técnica de flotação foi posteriormente modificada utilizando-se soluções com diferentes SpG¹⁴. Em 1939, Gordon e Whitlock relataram as desvantagens da técnica de Stoll devido à interferência de detritos na visualização de ovos de parasitas e desenvolveram o método quantitativo conhecido como McMaster¹⁶. Em 1979, O'Grady e Slocombe demonstraram que a gravidade específica da solução, o tempo e as malhas dos filtros afetam a precisão da detecção de ovos pela técnica de flotação¹⁷. Durante as últimas décadas, devido a várias modificações que foram feitas na técnica de flotação, há uma necessidade urgente de padronização dos métodos de flotação. Atualmente, a detecção de helmintos caninos no contexto da prevenção de parasitas zoonóticos é necessária para a aplicação de tratamentos anti-helmínticos apropriados para limitar a contaminação ambiental com estágios infecciosos de nematoides zoonóticos¹⁸.

Dentre os métodos qualitativos, a técnica de flutuação fecal é amplamente utilizada e aceita por não necessitar de muitos equipamentos, ser simples, barata e reprodutível; no entanto, tem uma grande desvantagem na falta de sensibilidade quando a intensidade da infecção é baixa¹⁹. A capacidade de revelar a presença de um maior número de elementos parasitários, como ovos, oocistos, cistos ou larvas de nematoides, é geralmente determinada pela densidade da solução²⁰.

Relatos prévios compararam técnicas coproparasitológicas para a detecção de ovos de nematoides caninos. Com relação à detecção de protozoários móveis, são utilizados esfregaços fecais diretos; enquanto os métodos de sedimentação são úteis para diagnosticar ovos pesados de parasitas como trematódeos²¹. Um dos testes diagnósticos de campo mais utilizados é o esfregaço fecal. No entanto, o baixo nível de sensibilidade dessa técnica pode ser atribuído ao fato de conter detritos que interferem na detecção de ovos do parasita. Ao incorporar uma etapa de peneiramento juntamente com soluções que fornecem a SpG adequada, o método de flotação oferece uma observação mais clara e menos desordenada dos ovos de ascarida e ancilostomíase. Isso leva a um processo mais preciso e eficiente para o rastreamento microscópico²². Da mesma forma, técnicas de flotação simples e centrífuga direta são muito comumente utilizadas para recuperar ovos e oocistos do^parasita14. Os métodos clássicos de flotação podem ser considerados qualitativos ou quantitativos dependendo do uso de uma câmara de contagem como o método de McMaster¹⁵. No entanto, como a técnica de flotação tem baixa sensibilidade e se concentra na detecção de parasitas no período de patente, resultados negativos não devem ser considerados conclusivos. No entanto, a precisão não depende apenas do procedimento de preservação de amostras fecais ou do SpG das soluções de flotação, mas também depende da proficiência técnica e experiência na realização de exames fecais do usuário.

Consequentemente, outros métodos têm sido explorados para a detecção de parasitas caninos nas fezes. Tem sido geralmente reconhecido que uma das abordagens mais utilizadas para o diagnóstico de helmintos intestinais em cães é a técnica FLOTAC, um método multivalente, sensível e acurado que produz resultados precisos e confiáveis para o diagnóstico de A. caninum em cães quando comparado a um protocolo de flutuação em tubo e à técnica de McMaster19^{, 23º}. Os métodos de sedimentação são úteis para a recuperação de ovos de fluke, ovos embrionados de nematoides e a maioria dos ovos de tênia, que não podem ser recuperados na superfície de uma solução de flutuação porque essas estruturas não flutuam²⁴. Um método que tem se mostrado superior às técnicas de flotação/sedimentação é o método de Flotação Centrífuga Dupla Modificada, pois permite a detecção de ovos de cestoide nas fezes, é menos demorado, separa ovos de Anoplocephala de detritos fecais e diminui a cristalização²⁵. Além disso, essa técnica tem sido utilizada com sucesso para detectar ovos de ascarid com alta^{sensibilidade26}. No entanto, algumas dessas técnicas e métodos centrífugos mencionados, como o Ovassay, ao contrário do protocolo de flotação que propomos neste estudo, requerem a preservação da amostra em reagentes como formalina, kits comerciais, processamento de amostras em condições de laboratório e o uso de reagentes como o sulfato de zinco²⁷, que são caros e requerem procedimentos especiais de descarte para evitar toxicidade ambiental.

O uso de técnicas que aumentem a sensibilidade do método de flotação pela adição de soluções com alta SpG tem sido favorecido recentemente. No entanto, deve-se considerar que a desvantagem dessas soluções é o aumento de detritos no preparo final e, consequentemente, a detecção imprecisa de ovos do parasita. Além disso, a disponibilidade comercial de materiais, reagentes, custo, questões de impacto ambiental e dificuldade de uso de métodos centrífugos afetam a seleção de uma técnica de flotação¹⁴, o que pode ser desafiador em condições de campo em contraste com o protocolo que apresentamos neste trabalho. O preparo das soluções de flotação com sal de cozinha é vantajoso em relação à utilização do açúcar, pois, em condições de campo, o açúcar atrai insetos como vespas e abelhas e as preparações tornam-se pegajosas. Além disso, soluções como fenol, que é adicionado a soluções de açúcar para evitar aderência, ou ZnSO₄são complexas de descartar corretamente de acordo com as diretrizes de proteção ambiental e não podem ser descartadas no campo; ao contrário de uma solução de sal de cozinha.

O objetivo deste manuscrito é demonstrar os passos para a detecção de ovos de T. canis e Ancylostoma spp., em amostras fecais, utilizando uma adaptação da técnica de flutuação simples em condições de campo e laboratório. Seguindo o protocolo aqui descrito e utilizando um microscópio com bateria reserva, o diagnóstico desses parasitas zoonóticos caninos em áreas rurais e suburbanas é possível quando não há equipamentos e infraestrutura laboratorial disponíveis. O método de flutuação simples descrito neste trabalho pode fornecer resultados rápidos e é uma técnica não invasiva e custo-efetiva para triagem de rotina.

Protocolo

O uso e cuidado de cães foi aprovado pela Universidade Nacional e Autônoma do México.

1. Coleta de amostras fecais

OBS: Manuseie o cão com a ajuda de um veterinário ou do dono do animal.

1. No caso de cães selvagens (Figura 1A) ou animais nervosos, coletar amostras do solo logo após a defecação ou no máximo 10 minutos depois.
2. Lubrifique luvas cirúrgicas ou bolsas de polietileno de paredes finas com água ou vaselina. Para coletar amostras fecais do reto, use luvas cirúrgicas ou bolsas de polietileno de paredes finas.
3. Coletar pelo menos 2 g de fezes de cada cão (Figura 1B).
4. Identifique amostras fecais individuais da seguinte forma: data, local (coordenadas do Sistema de Posicionamento Global [GPS] usando o Google Maps), atribua um número de identificação para cada animal, idade aproximada do cão, sexo do cão, raça, cão interno ou externo (feral).
5. Feche os sacos contendo a amostra fecal com um nó apertado. Manter os sacos refrigerados (4-8 °C) se as amostras de fezes não forem analisadas dentro de 3-4 h após a coleta.

2. Preparação de uma solução salina saturada para diagnóstico de campo

NOTA: Se o acesso a uma balança, material de medição, fogões ou gás para ferver água estiver ausente ou limitado, a solução salina saturada pode ser facilmente preparada usando água, sal de cozinha comum, um copo plástico de 12 oz (355 mL) e uma garrafa vazia de plástico de refrigerante de 1 L.

1. Lave bem uma garrafa vazia de refrigerante de 1 L. Encha a garrafa com 1 L de água.
2. Encha um copo plástico de 12 oz com sal de cozinha comum.
3. Transfira o sal para a garrafa de refrigerante.
4. Feche bem o frasco de refrigerante com a tampa de rosca. Agite a solução vigorosamente até que o sal já não se dissolva.
   NOTA: Agitar a solução no frasco de refrigerante até a dissolução completa do sal pode levar até 90 min.

3. Preparação de uma solução salina saturada para diagnóstico laboratorial

1. Pesar 420 g de sal de cozinha comum.
2. Dissolva 420 g de sal em 1 L de água.
3. Ferva a solução até que não se dissolva mais sal.
4. Filtrar a solução para eliminar o sal não dissolvido.
5. Verifique a concentração da solução usando um hidrômetro de fluido pesado ou densitômetro.
   OBS: A concentração ideal tem SpG de 1,20 para obtenção de melhores resultados (Figura 2A). A capacidade de flutuação de um ovo é influenciada pela sua interação com a solução, contribuindo para a capacidade variável dos ovos de flutuar em soluções com a mesma gravidade específica. Assim, para alcançar a recuperação ótima dos ovos, é essencial considerar a faixa superior de gravidade específica na solução de flotação, garantindo que ela supere a dos elementos parasitas alvo⁶.

4. Método de flotação

NOTA: Se as amostras fecais estiverem muito secas ou duras, macerá-las em uma argamassa.

1. Usando uma colher, coloque aproximadamente 3 g de fezes em um copo plástico (~8,5 cm de altura e ~5,5 cm de diâmetro).
2. Adicionar 1 mL da solução salina saturada até obter uma pasta.
3. Mexa por 1 min e adicione 100 mL de solução saturada de sal.
4. Passe esta suspensão através de um filtro de plástico para um segundo copo plástico para evitar partículas grosseiras (Figura 2B).
5. Deixe a suspensão descansar por 15-20 min.
6. Coloque uma alça de inoculação em uma chama por 1 s para garantir que ela esteja livre de ovos, cistos ou oocistos (Figura 2C).
7. Aguarde 5 s para que a alça de inoculação esfrie (Figura 2D).
8. Tire três gotas da superfície da suspensão com o ciclo de inoculação. Coloque cada uma das três gotas separadamente em uma lâmina de vidro (Figura 2E-G)
   NOTA: Certifique-se de que as gotas não estejam em contato umas com as outras (Figura 2H).
9. Observar ao microscópio com objetiva de 10x (Figura 2I). Coloque uma lamínula se a ampliação for aumentada para 40x.
10. Quando um resultado positivo for observado na gota, atribuir uma cruz (+) no diário de bordo do laboratório para registrar a presença de parasitas no período de patente em locais aleatórios da superfície de suspensão fecal.

5. Interpretação do método de flotação

NOTA: Os resultados negativos são inconclusivos.

1. Realizar uma série de três testes com amostras de 3 dias consecutivos para aumentar a sensibilidade do teste.
   NOTA: Resultados positivos indicam a presença de parasitas no período de patente.

Resultados

Neste trabalho, são descritos procedimentos de coleta e coproparasitoscopia para identificação de T. canis e Ancylostoma spp. A lógica por trás da adaptação do método simples de flutuação fecal para detectar ovos de helmintos caninos é que essa técnica é custo-efetiva, pois as soluções, equipamentos e materiais são baratos. Assim, o método tem uma alta capacidade de manipulação de amostras, pois múltiplas amostras podem ser processadas em um curto período. Além disso, o método sim...

Discussão

Nematoides como T. canis e Ancylostoma spp podem habitar o intestino delgado de cães e têm potencial para serem transmitidos ao homem. Os sinais clínicos causados pelo T. canis são graves em cães jovens, manifestando-se como baixo crescimento, problemas respiratórios ou lesões do trato digestivo²⁸. Em cães adultos, a infecção normalmente tende a ser leve. O diagnóstico baseia-se na identificação de ovos característicos em uma amostra fecal. Essa condição ...

Materiais

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Bunsen burner	Viresa	FER-M224
Disposable 12-oz glass cup	Uline Mexico	S-22275	Sold in retail stores
Glass slides	Velab, Mexico	VEP-P20
Inoculating loop	VelaQuin, Mexico	CRM-5010PH
Light Microscope	VelaQuin, Mexico	VE-B2
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One plastic cup (12 oz)	Amazon	ASIN B08C2CRHSH	Can be any kitchen plastic reuseable cup
Plastic cups  (size of a dice or urine sample cup) diameter 5.5 cm and height 8.5 cm, two cups	Amazon	Layhit-Containers-ZYHD192919	Can be any kitchen plastic reuseable cup
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