현장 및 실험실 조건에서 인수공통선충을 진단하기 위한 간단한 분변 부유 방법

요약

이 연구는 2017년부터 2021년까지 멕시코의 개에서 채취한 분변 샘플에서 검출된 Toxocara canis 와 Ancylostoma spp.를 현장 조건에서 식별하기 위해 부유선광법을 사용하는 방법을 설명합니다.

초록

Toxocara canis 및 Ancylostoma caninum과 같은 인수공통감염병 가능성이 있는 개 기생충의 진단은 멕시코의 시골 및 교외 지역의 실험실에 대한 접근이 제한되어 있기 때문에 일반적으로 어렵습니다. 이 연구는 2017년부터 2021년까지 멕시코의 개에서 채취한 분변 샘플에서 T. canis와 Ancylostoma spp.를 현장 조건에서 검출하는 것을 목표로 했습니다. 표본 크기 계산 결과 전국에 534마리의 개가 등록되는 것을 목표로 삼았습니다.

샘플은 배변 후 직장 또는 땅에서 직접 수집되었습니다. 샘플은 4°C에서 개별적으로 단단히 밀봉된 비닐 봉지에 보관했습니다. 염화나트륨의 포화 용액(비중[SpG] 1.20)을 현장 및 실험실 조건 모두에서 제조하였다. 채취 후 3일 이내에 2-4g의 대변을 각 대변 샘플을 식염수에 부유시켜 부유 선광 방법을 사용하여 기생충 검사를 실시했습니다. 대변을 부유 용액과 혼합하고 금속 숟가락을 사용하여 분쇄했습니다.

균일한 일관성이 달성되면 대변 샘플을 체를 사용하여 새 플라스틱 컵에 붓고 10-15분 동안 그대로 두었습니다. 혼합물의 상단에서 3방울을 멸균된 접종 루프를 사용하여 수집했습니다. 슬라이드를 현미경에 놓고 훈련된 기생충학자가 기생충을 식별했습니다. 1,055마리의 개에서 채취한 배설물 샘플을 현미경으로 검사했습니다. Ancylostoma spp.의 양성 샘플 수는 T. canis의 경우 833개(78.95% 빈도), 222개(21.04%)였습니다. 이러한 발견은 멕시코의 도시와 농촌 지역에 사는 개에서 실험실과 현장 조건에서 공동 기생충 기술을 사용하여 인수공통전염병을 식별하는 것의 중요성을 보여줍니다.

서문

위장 기생충은 개에게 영향을 미치는 가장 흔한 건강 문제 중 하나입니다¹. 추정에 따르면 전 세계적으로 ~7억 마리의 반려견이 있으며, 약 1억 7,500만 마리가 자유롭게 돌아다니는 것으로 분류될 수 있습니다². 60종 이상의 기생충이 개와 인간 사이에 공유되고 있으며, 이는 개가 이러한 기생충에 감염된 인간의 감염원이 될 수 있음을 시사한다³. 톡소카라 카니스(Toxocara canis)와 안시로스토마 카니눔(Ancylostoma caninum)은 개와 우연히 인간 숙주를 감염시키는 두 가지 기생 종입니다. 현재 멕시코에서 이 기생충이 생존하고 번식할 수 있는 위치에 대한 여러 연구가 있습니다. 개에서 톡소카라의 유병률은 미국, 멕시코, 중미 및 카리브해 전역에서 0%에서 87% 이상까지 다양합니다⁴. 톡소카라 카니스(Toxocara canis)와 안시로스토마(Ancylostoma spp.) 및 개의 다른 기생 종은 이전에 멕시코에서 보고된 바 있다 5,6,7,8,9,10,11,12,13 (표 1).

기생 종	부위	유병률(%)	참조
Ancylostoma caninum (안시로스토마 캐니눔)	케레타로	42.90	5
	타바스코 소스	15.90	6
	캄페체	35.7 – 42.9	7
	유카탄	73.8	8
바베시아	모렐로스	13.60	9
	베라 크루즈	10.00
콕시디얼 난포낭	유카탄	2.30	8
크테노세팔리데스	모렐로스	30.3	10
디필리디움 카니눔	유카탄	2.30	8
디로필라리아	유카탄	7.0 – 8.3	11
편모충	타바스코 소스	3.00	6
	유카탄	18.8	8
리슈마니아	치아파스	19.00	12
촌 충	바하 칼리포르니아	6.79	13
톡소카라 카니스	케레타로	22.10	5
	유카탄	6.20	8
트리쿠리스 불피스(Trichuris vulpis)	유카탄	25.40	8
트리파노소마(Trypanosoma)	할리 스코	8.10	9
	캄페체	7.60
	치아파스	4.5 – 42.8
	킨타나로오	20.1 – 21.3
	톨 루카	17.50
	유카탄	9.8 – 34

표 1: 2001년부터 2020년까지 멕시코의 개 기생충의 지역별 유병률(%). 2001년부터 2020년까지 수행된 이전 조사의 결과를 통해 멕시코의 여러 도시 및 농촌 환경에서 개 기생충 분포를 식별할 수 있었습니다. 이러한 연구는 다양한 생태계에서 개 기생충의 지속성에 도움이 되는 역학적 요소에 대한 깊은 이해를 제공하여 일부 기생충 종의 인수공통감염병 영향에 대한 포괄적인 평가에 기여합니다.

알, 낭종, 난포 또는 유충과 같은 장내 기생충의 생애 주기 단계는 대변 샘플에서 찾을 수 있습니다. 따라서 배설물을 검사하면 동물의 기생충에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있습니다. 인간의 대변에서 Ancylostomidae 알을 검출하는 방법에 대한 필요성으로 인해 1878 년에 간단한 대변 도말이 사용되었으며, 이는 수년 동안 위장 기생충을 검출하는 데 사용되었지만 그다지 민감하지 않은 것으로 간주되었습니다. 따라서 더 나은 공미시적 방법을 개발할 필요성이 제기되었습니다¹⁴. 대변 샘플에서 기생충 알을 회수하고 계수하는 부유 선광 기술이 처음 기술된 지¹⁰⁰년 이상이 지났습니다 15. 그 이후로 부양 기술의 여러 방법과 변형이 숙주에서 일부 기생충을 검출하기위한 표준으로 간주되었습니다.

예를 들어, Lane은 1924년에 원심분리를 통합한 후 SpG 1.2 in 1g(Lane) 또는 10g(Stoll's modification)의 포화 염화나트륨 용액에 침전물을 띄우는 직접 원심 부유 기술을 포함하는 방법을 설명했습니다. 부유 기술은 이후에 상이한 SpG¹⁴를 갖는 용액을 사용하여 수정하였다. 1939년 Gordon과 Whitlock은 기생충 알을 시각화할 때 찌꺼기의 간섭으로 인한 Stoll 기술의 단점을 보고하고 McMaster¹⁶으로 알려진 정량적 방법을 개발했습니다. 1979년에, 오그래디(O'Grady)와 슬로콤(Slocombe)은 용액의 비중, 타이밍 및 스트레이너의 메쉬 크기가 부유 기술¹⁷을 사용하여 계란 검출의 정확도에 영향을 미친다는 것을 증명하였다. 지난 수십 년 동안 부유 선광 기술에 몇 가지 수정이 이루어졌기 때문에 부양 방법의 표준화가 시급합니다. 현재, 인수공통선충의 감염 단계로 인한 환경 오염을 제한하기 위해 적절한 구충 치료를 적용하기 위해 인수공통감염병 예방의 맥락에서 개 기생충 감염을 검출하는 것이 필요하다¹⁸.

정성적 방법 중에서 분변 부유 기술은 많은 장비가 필요하지 않고 간단하고 저렴하며 재현 가능하기 때문에 널리 사용되고 수용됩니다. 그러나 감염 강도가 낮을 때 민감도가 떨어진다는 큰 단점이 있다¹⁹. 알, 난포, 낭종, 또는 선충 유충과 같은 더 많은 수의 기생 요소의 존재를 드러내는 능력은 통상적으로 용액(²⁰)의 밀도에 의해 결정된다.

이전 보고서에서는 개 선충 알을 검출하기 위한 공기생충 기술을 비교했습니다. 운동성 원생동물의 검출과 관련하여 직접 분변 도말이 사용됩니다. 침강 방법은 trematodes²¹과 같은 기생충의 무거운 알을 진단하는 데 유용합니다. 가장 널리 사용되는 현장 기반 진단 검사 중 하나는 대변 도말 방법입니다. 그러나 이 기술의 낮은 수준의 감도는 기생충 알의 감지를 방해하는 파편이 포함되어 있다는 사실에 기인할 수 있습니다. 적절한 SpG를 제공하는 용액과 함께 체질 단계를 통합함으로써 부유선광 분석법은 무서룩 및 십이지장충 알을 보다 명확하고 덜 복잡하게 관찰할 수 있습니다. 이는 현미경 스크리닝을 위한 보다 정밀하고 효율적인 프로세스로 이어진다²². 마찬가지로, 단순 부유선광법과 직접 원심 부유선광법은 기생충 알과 난포낭을 회수하기 위해 매우 일반적으로 활용된다¹⁴. 고전적인 부유 선광 방법은 McMaster 방법¹⁵와 같은 계수 챔버의 사용에 따라 정성적 또는 정량적 인 것으로 간주 될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 부유 선광 기술은 민감도가 낮고 특허 기간 동안 기생충 검출에 중점을 두기 때문에 부정적인 결과가 결정적인 것으로 간주되어서는 안 됩니다. 그러나 정확도는 분변 샘플의 보존 절차 또는 부유 용액의 SpG에 따라 달라질 뿐만 아니라 사용자의 분변 검사 수행에 대한 기술적 숙련도와 경험에 따라 달라집니다.

결과적으로, 대변에서 개 기생충을 검출하기 위한 다른 방법이 연구되었습니다. 개의 장내 기생충 감염 진단을 위해 가장 널리 사용되는 접근법 중 하나는 튜브 내의 부유 프로토콜 및 맥마스터 기법(^McMaster technique)과 비교할 때 개의 A. caninum 진단을 위한 정확하고 신뢰할 수 있는 결과를 산출하는 다가 민감하고 정확한 방법인 FLOTAC 기법인 FLOTAC 기법이라는 것이 일반적으로 인식되어 왔다. ²³. 침전법은 흡충 알, 배아 선충 알 및 대부분의 촌충 알을 회수하는 데 유용하며, 이러한 구조물은 부유하지 않기 때문에 부유 용액의 표면에서 회수할 수 없다²⁴. 부유선광/침강 기법보다 우수한 것으로 입증된 한 가지 방법은 변변 내 세스토드 알을 검출할 수 있고, 시간이 덜 걸리며, 분변 파편에서 아노플로세팔라 알을 분리하고, 결정화를 감소시키기 때문에 수정된 이중 원심 부유선광법이다²⁵. 더욱이, 이 기술은 고감도²⁶으로 아스카리드 알을 검출하는데 성공적으로 사용되었다. 그러나 앞서 언급한 기술 및 Ovassay와 같은 원심 분리 방법 중 일부는 이 연구에서 제안하는 부유 프로토콜과 달리 포르말린, 상용 키트, 실험실 조건에서의 샘플 처리, 고가의 황산아연²⁷과 같은 시약의 사용과 같은 시약의 사용이 필요하며 환경 독성을 피하기 위해 특별한 폐기 절차가 필요합니다.

최근에는 SpG가 높은 용액을 첨가하여 부유선광법의 감도를 높이는 기법을 사용하는 것이 선호되고 있습니다. 그러나 이러한 솔루션의 단점은 최종 준비에서 파편이 증가하여 기생충 알이 부정확하다는 점을 고려해야합니다. 또한, 재료, 시약, 비용, 환경 영향 문제 및 원심 방법의 사용의 어려움의 상업적 가용성은 부유 기술¹⁴의 선택에 영향을 미치며, 이는 우리가 본 연구에서 제시하는 프로토콜과 달리 현장 조건에서 어려울 수 있습니다. 식염으로 부유 용액을 준비하는 것은 현장 조건에서 설탕이 말벌 및 꿀벌과 같은 곤충을 유인하고 준비가 끈적 거리기 때문에 설탕을 사용하는 것보다 유리합니다. 또한, 끈적임을 피하기 위해 설탕 용액에 첨가되는 페놀 또는 ZnSO₄와 같은 용액은 환경 보호 지침에 따라 적절하게 폐기하기가 복잡하고 현장에서 폐기할 수 없습니다. 식염 용액과 달리.

이 원고의 목표는 현장 및 실험실 조건에서 간단한 부유 기술을 적용하여 대변 샘플에서 T. canis 및 Ancylostoma spp. 알을 검출하는 단계를 보여주는 것입니다. 여기에 설명된 프로토콜에 따라 백업 배터리가 있는 현미경을 사용하여 실험실 장비 및 인프라를 사용할 수 없는 경우 시골 및 교외 지역에서 이러한 개 인수공통감염병 기생충을 진단할 수 있습니다. 이 연구에서 설명하는 간단한 부유선광 방법은 빠른 결과를 제공할 수 있으며 일상적인 스크리닝을 위한 비침습적이고 비용 효율적인 기술입니다.

프로토콜

개의 사용과 관리는 멕시코 국립 자치 대학교의 승인을 받았습니다.

1. 분변 시료 채취

알림: 수의사나 동물 주인의 도움을 받아 개를 다루십시오.

1. 들개(그림 1A) 또는 신경질적인 동물의 경우 배변 직후 또는 10분 이내에 땅에서 샘플을 채취합니다.
2. 수술용 장갑이나 얇은 벽의 폴리에틸렌 백에 물이나 바셀린을 바르십시오. 직장에서 대변 샘플을 수집하려면 수술용 장갑이나 얇은 벽의 폴리에틸렌 백을 착용하십시오.
3. 각 개에서 최소 2g의 대변을 수집하십시오(그림 1B).
4. 날짜, 위치(Google 지도를 사용한 GPS(Global Positioning System) 좌표), 각 동물의 식별 번호 할당, 개의 대략적인 나이, 개의 성별, 품종, 실내 또는 실외(야생) 개.
5. 대변 샘플이 들어 있는 가방을 단단히 매듭으로 닫습니다. 채취 후 3-4시간 이내에 대변 샘플을 분석하지 않으면 백을 냉장(4-8°C)에 보관하십시오.

2. 현장 진단을 위한 포화 염 용액의 준비

알림: 물을 끓이기 위한 저울, 측정 재료, 스토브 또는 가스에 대한 접근이 없거나 제한된 경우 물, 일반 식염, 플라스틱 12oz(355mL) 컵 및 1L 소다 플라스틱 빈 병을 사용하여 포화 식염수를 쉽게 준비할 수 있습니다.

1. 빈 1L 소다병을 깨끗이 씻으십시오. 병에 물 1L를 채웁니다.
2. 12온스 플라스틱 컵에 일반 식탁용 소금을 채웁니다.
3. 소금을 소다병에 옮깁니다.
4. 나사 캡으로 음료수 병을 단단히 닫습니다. 소금이 더 이상 녹지 않을 때까지 용액을 세게 흔듭니다.
   알림: 소금이 완전히 녹을 때까지 소다병의 용액을 흔드는 데 최대 90분이 소요될 수 있습니다.

3. 실험실 진단을 위한 포화 염 용액의 준비

1. 일반 식탁용 소금 420g의 무게를 잰다.
2. 물 1L에 소금 420g을 녹입니다.
3. 더 이상 소금이 녹지 않을 때까지 용액을 끓입니다.
4. 용액을 여과하여 용해되지 않은 소금을 버립니다.
5. 무거운 유체 비중계 또는 밀도계를 사용하여 용액의 농도를 확인하십시오.
   알림: 이상적인 농도는 더 나은 결과를 얻기 위해 1.20의 SpG를 갖습니다(그림 2A). 달걀의 부유 능력은 용액과의 상호 작용에 의해 영향을 받아 동일한 비중을 가진 용액에서 달걀이 뜨는 다양한 능력에 기여합니다. 따라서 최적의 난자 회수를 달성하기 위해서는 부유 용액에서 비중의 상한 범위를 고려하여 표적 기생충 요소⁶의 비중을 능가하도록 하는 것이 필수적이다.

4. 부양 방법

알림: 분변 샘플이 너무 건조하거나 딱딱하면 절구에 담그십시오.

1. 숟가락을 사용하여 플라스틱 컵 1개(높이 ~8.5cm, 지름 ~5.5cm)에 약 3g의 대변을 넣습니다.
2. 페이스트가 나올 때까지 포화 소금 용액 1mL를 추가합니다.
3. 1분 동안 저어주고 포화 소금 용액 100mL를 추가합니다.
4. 거친 입자를 피하기 위해 이 서스펜션을 플라스틱 스트레이너를 통해 두 번째 플라스틱 컵에 통과시킵니다(그림 2B).
5. 서스펜션을 15-20분 동안 그대로 두십시오.
6. 접종 루프를 화염에 1초 동안 넣어 난자, 낭종 또는 난포낭이 없는지 확인합니다(그림 2C).
7. 접종 루프가 식을 때까지 5초 동안 기다립니다(그림 2D).
8. 접종 루프가 있는 현탁액 표면에서 세 방울을 떨어뜨립니다. 세 방울을 각각 하나의 유리 슬라이드에 따로 놓습니다(그림 2E-G).
   알림: 방울이 서로 접촉하지 않도록 하십시오(그림 2H).
9. 10x 대물렌즈로 현미경으로 관찰합니다(그림 2I). 배율이 40배로 증가하면 커버슬립을 놓습니다.
10. 액적에서 양성 결과가 관찰되면 실험실 로그북에 십자형(+)을 할당하여 분변 현탁액 표면의 무작위 부위에 특허 기간 동안 기생충의 존재를 기록합니다.

5. 부유선광법의 해석

참고: 부정적인 결과는 결정적이지 않습니다.

1. 테스트의 민감도를 높이기 위해 연속 3일의 샘플로 일련의 3가지 테스트를 수행합니다.
   참고: 양성 결과는 특허 기간 동안 기생충의 존재를 나타냅니다.

결과

이 연구에서는 T. canis 및 Ancylostoma spp.의 식별을 위한 수집 및 공동 기생경 절차에 대해 설명합니다. 개 기생충 알을 검출하기 위해 간단한 분변 부유 선광 방법을 적용하는 이유는 이 기술이 솔루션, 장비 및 재료가 저렴하기 때문에 비용 효율적이기 때문입니다. 따라서 이 방법은 짧은 시간에 여러 샘플을 처리할 수 있으므로 높은 샘플 처리 용량을 가지고 있습니다. 또한, 간단한 분?...

토론

T. canis 및 Ancylostoma spp.와 같은 선충은 개의 소장에 서식할 수 있으며 인간에게 전염될 가능성이 있습니다. T. canis로 인한 임상 징후는 어린 개에게 심각하며, 성장 부진, 호흡기 문제 또는 소화관 병변으로 나타난다²⁸. 성견의 경우 감염은 일반적으로 경미한 경향이 있습니다. 진단은 대변 샘플에서 특징적인 난자를 식별하는 데 의존합니다. 이 질환은 개에게 ?...

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